專利名稱：：一種活性乳酸乳球菌制品的制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種乳酸乳球菌制品的制備方法，特別是涉及一種可高效低成本的表達苯丙氨酸解氨酶的活性乳酸乳球菌制品的制備方法。
背景技術：
：苯丙氨酸(phenylalanine,phe)是人體必須氨基酸的一種，正常人從飲食中攝入及體內再循環利用的苯丙氨酸，除少部分被直接利用外，大部分在肝臟的苯丙氨酸羥化酶(phenylalaninehydroxylase,PAH)的作用下轉化成為酪氨酸后被利用。患有常染色體隱性遺傳病——苯丙酮尿癥(phenylketonuria,PKU)的患者，由于苯丙氨酸羥化酶基因缺陷，導致肝臟的PAH酶活性降低或缺如，無法將苯丙氨酸轉化成為酪氨酸，致使苯丙氨酸通過其他途徑轉化為苯丙酮酸、苯乙酸、苯乳酸等。這些非正常代謝產物在血、腦脊液和其他組織中大量積累，對各種組織特別是腦組織造成不可逆損傷。PKU患者的主要臨床表現是智力低下，癲癇發作和黑色素減少。目前國際上通用的治療PKU方法是低苯丙氨酸飲食控制療法。該方法需從患兒一出生起即給予低苯丙氨酸特制奶粉和食物，同時嚴格限制正常食物的攝入，并且根據各生長發育階段和個體的差異隨時調整飲食控制量，直至智力發育基本成熟，g卩17-18歲。由于苯丙氨酸在日常飲食中普遍、大量存在，飲食控制難度極大且容易造成患兒其它必需氨基酸缺乏引起體質下降、生長發育遲滯等副作用。而人工合成的低苯丙氨酸食品品種少、口感差、價格昂貴，實際應用中患者由于常年無法食用正常飲食而極其痛苦，少有能堅持飲食控制十幾年者，因此極大地影響了治療質量。國際上80年代初就開始研究酶法治療PKU，主要是采用逆轉錄病毒和重組腺病毒載體介導的方法，來實現PAH在PKU模型小鼠的肝細胞表達。主要問題是g移效率低，免疫原性強，外源基因在細胞中只能短期表達，同時存在安全性隱患，因此至今未見用于臨床的報道。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanineammonia-lyase，PAL)廣泛存在于各種綠色植物和少數微生物中，它可以催化苯丙氨酸脫氨生成肉桂酸，因此有希望口服該酶治療PKU。由于植物和酵母等生產的天然PAL量極少，提取成本很高，因此通過基因工程方法獲取大量PAL成為研究的重點。《中國病理生理雜志》2000年16巻第1期第12頁公布了一種水稻苯丙氨酸解氨酶基因在大腸桿菌BL21DE3中的表達方法，融合蛋白His6—rPAL主要以包涵體形式存在，誘導7小時后逸高峰，表達蛋白量占菌體總蛋白量的35.43%。由于大腸桿菌為人體致病菌，其活菌禁止直接口服應用。但該菌超聲破碎后提取的粗酶比活性很低，僅為0.46U/g。原因可能是PAL在生物體外極不穩定。中國專利02117216.1公布了"一種治療苯酮尿癥的藥物及其制造方法與應用"技術，將苯丙氨酸脫氨酶基因轉入腸道正常菌中表達有活性的PAL酶，通過口服轉基因工程菌，利用PAL酶在消化道內將phe轉化為肉桂酸，從而降低食物來源中phe進入血液的量，達到治療疾病的同時保持較正常飲食的目的。《生物工程學報》2002年18巻第6期第713頁公布了利用上述技術在乳酸乳球菌(丄./ac&)NICE系統表達歐芹PAL的結果，其使用翻譯融合型載體p。(NZ8048-PAL)和轉錄融合型載體p(NZ8048-PAL)在乳酸乳球菌中表達的歐芹PAL，表達量分別占總蛋白的5.16%和2.76%。該技術的明顯缺陷在于表達產物產率很低，乳酸乳球菌的產量也低，因此成本極高，限制了其實際應用。
發明內容本發明的目的是提供一種高效低成本的表達苯丙氨酸解氨酶的活性乳酸乳球菌制品的制備方法。該發明克服了上述缺點，采用了高效表達的菌種和發酵培養條件，提高了產率、產為了實現上述發明目的，本發明釆用的技術方案，包括菌種的構建(質粒構建、連接、轉化、篩選)、配制發酵培養基、菌種活化、接種發酵、收菌和干燥工藝過程為了提高歐芹PAL基因在乳酸乳球菌中的表達效率，本發明在菌種構建過程中采用了乳酸乳球菌偏愛密碼子1)質粒構建以質粒pET23b-PAL中PAL基因片段為模板，將歐芹PAL上密碼子全部改變為乳酸乳球菌偏愛密碼子，并進行人工合成得到全長2.2kb的PALcDNA(PAL311);2)連接將PALT與適當表達載體相連接形成重組表達載體；3)轉化將重組表達載體轉化感受態的乳酸乳球菌(L/M^);4)篩選篩選獲得高效表達菌株采用本發明技術可使表達效率大幅提高，使PAL蛋白表達達到總蛋白量12%以上。為了提高表達苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌的產量，本發明在發酵過程中采用了添加氫氧化鈉和鹽酸的方法自動平衡調節pH值，使pH值維持在6.5-7.5，避免了乳酸乳球菌發酵過程中因乳酸產物積累，pH過酸對發酵的抑制作用，延長了菌體對數生長期一倍以上，使表達苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌的產量明顯提高。為了進一步提高表達苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌的產量，本發明還采用了經優化的發酵培養基配方，1L培養基中含有蛋白胨5-30g，酵母提取物2.5-15g，乳糖或葡萄糖5-30g，MgS04.7H200.2-0.5g，MnS04.H200.05國0.1g，NaAc.3H203.3g，KH2P042g，Tween-800.5-5ml，pH值6.5-7.5。該技術的優點是提供適當的碳源、氮源及合理的碳/氮比例，在培養基中添加促進工程菌生長的微量元素MgS04、MnS04及對表達產物有利的穩定劑Tween-80，在保證充分發酵所需能量的同時，避免酸性產物的大量堆積，減少原材料浪費，降低了成本。因乳酸乳球菌發酵最適pH值為6.0-6.5，而PAL酶保存最適pH值為7.5-9.5，為了減少發酵過程中PAL酶活力的損失，本發明采用將發酵pH值維持在6.5-7.5，溫度維持在25-40°C，發酵時間控制在6-30小時，使得發酵充分的同時PAL酶活力得到最佳保護。為減少外源基因PAL過早表達對乳酸乳球菌生長的不利影響，本發明采用當發酵液光齊度OD值在0.3-0.6時進行誘導，誘導劑為乳鏈菌素(Nisin)，誘導劑終濃度為3.75-50ng/ml;為在收菌后保持乳酸乳球菌的活菌率同時有利于PAL酶的保存，本發明采用將發酵液it速離心脫水并用pH值為8.0-8.8的磷酸鹽或硼酸鹽緩沖液洗滌2-3次，收集菌體，25-60'C烘干6-72小時得活菌粉。本發明的特點是釆用乳酸乳球菌偏愛密碼子，提高苯丙氨酸解氨酶在基因工程菌中的表達效率；通過對pH值進行調控，使pH維持在6.5-7.5之間，延長乳酸乳球菌的對數生長時間，并有利于保護PAL表達產物的活性；對培養基配方進行優化，找到最適于工程菌生長的碳源、氮源及其比例；在培養基中添加促進工程菌生長的微量元素及對表達產物有利的穩定劑；在菌體密度達到0.3-0.6時使用最佳誘導濃度誘導，使得誘導表達量和菌體得率達到最佳平衡；屏棄凍干等高能耗的活菌保存方法，使用簡便易行、節能環保的干燥方式同樣達到良好的保存效果。采用本發明的技術，乳酸乳球菌發酵體系中菌體密度提高IOO倍，活菌得率大于10UCFU/ml，PAL表達量大于12%;所得菌體具有高效轉化苯丙氨酸生成肉桂酸的能力，PAL酶比活性大于50U/g;所得菌粉穩定性好，在4'C保存6個月，活菌數仍可達101C)CFU/g以上，并且PAL酶比活性無明顯降低；發酵成本降低2/3。因此利用本發明可方便地大量提供低成本的PAL用于PKU治療。具體實施例方式實施例一高效表達苯丙氨酸脫氨酶的基因工程乳酸乳球菌制備1、以質粒pET23b-PAL中PAL基因片段為模板，將歐芹PAL上密碼子全部改變為乳酸乳球菌偏愛密碼子，并進行人工合成得到PAL"t，所用的引物為Tl:5'-GAGAACGGTAACGGTGCAACTAC國3'，T2:5'-GCTCTAGAGCATGTCAGTTAAC-3'。T2含XbaI酶切位點；2、PAL^經T4DNA聚合酶處理后，再用XbaI酶切，得到具有乳酸乳球菌偏愛密碼子的cDNA片段；3、用NcoI酶切表達載體pNZ8149,并與具有乳酸乳球菌偏愛密碼子的cDNA片段連接;4、用上述重組質粒轉化感受態的乳酸乳球菌；5、篩選被轉化乳酸乳球菌中的高效表達菌株；6、配制發酵培養基，各組分的含量均為重量體積百分比，即g/L:蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，乳糖5g，MgS04.7H200.25g，MnS04.H200.05g，NaAc.3H2O3.3g,KH2P042g，Tween-800.5ml，其余為水，pH值7.0;7、將菌種進行常規活化，活化種子液按l:50比例接種發酵培養基；8、發酵溫度為3(TC，發酵時間為18小時；9、當發酵液光密度OD值在0.3時用乳鏈菌素進行誘導，誘導劑終濃度為7.5ng/ml;10、發酵過程中采用添加氫氧化鈉和鹽酸的方法調節pH值，使pH值維持在6.5-7.5之間；11、發酵結束，發酵液經高速離心(8000rpm/分，離心20分鐘)脫水并用pH8.0的O.lmol/L磷酸鹽緩沖液洗滌3次，收集菌體，60'C烘干，4X:密封避光保存。實施例二本發明中乳酸乳球菌表達PAL酶活力測定將實施例一收集的菌體用pH8.8的0.1mol/L硼酸鹽緩沖液(含有10mM苯丙氨酸)配制成lmg/ml懸液，3(TC反應1小時，分別在0，15，30，45，60分鐘收集反應上清液，用分光光度法測定轉化產物肉桂酸的生成量，并計算出菌體中PAL酶的比活。實施例三本發明治療苯丙酮尿癥的藥效學鑒定給基因缺陷苯丙酮尿癥模型小鼠詞喂本發明實施例一中得到的菌體，用法為每日單次R服，0.5g/只，連續7天，結果表明，用藥小鼠血液中苯丙氨酸水平均明顯低于對照鼠，兩組有顯著性差異(PO.Ol)。實施例四本發明不同制備工藝的產量、產率比較表1中配方1為常規乳酸菌培養基M17，配方2為實施例一中優化培養基配方表1、不同培養培養基和pH值產量比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2中培養基為經本發明優化的培養基配方，發酵條件均為經本發明優化的培養條件。表2、不同誘導劑濃度產量比較<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權利要求1、一種利用微生物菌株制備活性乳酸乳球菌制品的方法，其制備過程包括如下步驟1)質粒構建以質粒pET23b-PAL中PAL基因片段為模板，將歐芹PAL上密碼子全部改變為乳酸乳球菌偏愛密碼子，并進行人工合成得到全長2.2kb的PALcDNA(PALart)；2)連接將PALart與適當表達載體相連接形成重組表達載體；3)轉化將重組表達載體轉化感受態的乳酸乳球菌(L.lactis)；4)篩選篩選獲得高效表達菌株5)配制發酵培養基6)菌種活化7)接種發酵8)誘導9)收菌10)干燥其特征是在質粒構建過程中使用了乳酸乳球菌偏愛密碼子。2、根據權利要求1所述的一種利用微生物菌株制備活性乳酸乳球菌制品的方法，其特征是所述發酵培養基1L中含有蛋白胨5-30g,酵母提取物2.5-15g，乳糖或葡萄糖5-30g，MgS04.7H200.2-0.5g，MnS04.H200.05-0.1g，NaAc.3H203.3g，KH2P042g，Tween-800.5-5ml,pH值6.5-7.5。3、根據權利要求1所述的一種利用微生物菌株制備活性乳酸乳球菌制品的方法，其特征是所述發酵過程中采用添加氫氧化鈉和鹽酸的方法自動平衡調節pH值，使pH值維持在6.5-7.5之間。4、根據權利要求1所述的一種利用微生物菌株制備活性乳酸乳球菌制品的方法，其特征是所述誘導條件為當發酵液光密度OD值在0.3-0.6時進行誘導，誘導劑為乳鏈菌素(Nisin)，誘導劑終濃度為3.75-50ng/ml。5、根據權利要求1所述的一種利用微生物菌株制備活性乳酸乳球菌制品的方法，其特征是所述發酵溫度為25-3(TC，發酵時間為6-30小時。6、根據權利要求1所述的一種利用微生物菌株制備活性乳酸乳球菌制品的方法，其特征是所述收菌過程，采用高速離心脫水并用適當緩沖液洗滌2-3次收集菌體。7、根據權利要求1所述的一種利用微生物菌株制備活性乳酸乳球菌制品的方法，其特征是干燥采用25-6(TC烘干6-72小時。8、根據權利要求6所述的一種利用微生物菌株制備活性乳酸乳球菌制品的方法，其特征是所述適當緩沖液為pH8.0-8.8的磷酸鹽或硼酸鹽緩沖液中的一種。全文摘要本發明公開了一種活性乳酸乳球菌制品的制備方法，包括菌種的構建(質粒構建、連接、轉化、篩選)、配制發酵培養基、菌種活化、接種發酵、收菌和干燥工藝過程，本方法采用了高表達的菌株、優化的培養基配方，為延長菌體的對數生長期采用了pH調控等方法，最終使發酵體系中菌體密度提高100倍，活菌得率大于10¹¹CFU/ml，PAL蛋白表達量大于12％；所得菌體具有高效轉化苯丙氨酸生成肉桂酸的能力，PAL酶比活性大于50U/g；所得菌粉穩定性好，在4℃保存6個月，活菌數仍可達10¹⁰CFU/g以上，并且PAL酶比活性無明顯降低；發酵成本降低2/3。因此利用本發明可方便地大量提供低成本的PAL用于PKU治療。文檔編號C12R1/225GK101586111SQ200810098008公開日2009年11月25日申請日期2008年5月22日優先權日2008年5月22日發明者劉金毅,孫儉波,春牛,程永慶,高天星申請人:北京三元基因工程有限公司;北京畢艾歐科技發展有限責任公司