專利名稱：：一種耐堿、高活性的堿性木聚糖酶及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種耐堿、高活性的堿性木聚糖酶及其基因的克隆。技術(shù)背景木聚糖是一種雜合多聚五碳糖，主鏈絕大部分都是都是d型吡喃木糖通過e-1,4糖苷鍵連接，主要的側(cè)鏈取代基有阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、4-0-甲基葡萄糖醛酸、乙?；?、半乳糖基等。木聚糖是半纖維素的主要成分，占植物碳水化合物的1/3，是繼纖維素之后的第二大可再生資源。所以，水解木聚糖是利用半纖維素的重要步驟。木聚糖酶廣泛用做飼料工業(yè)的添加劑、食品工業(yè)的改良劑、和造紙工業(yè)中紙漿的生物漂白劑等(Polizeli等，2005)。木聚糖酶最早應(yīng)用于飼料工業(yè)。木聚糖酶能破壞植物細(xì)胞壁，將營養(yǎng)物質(zhì)釋放出來，提高養(yǎng)分的利用率(Kiin等,2005)。另外木聚糖酶能降低食糜的粘度，提高飼料的表觀代謝能(Eun等，2006)?？傊揪厶敲缸鳛轱暳咸砑觿?，能有效的解除木聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用。食品工業(yè)方面，木聚糖酶能改善面包的質(zhì)量；降解木聚糖生成具有保健功能的低聚木糖；在釀酒工業(yè)中，木聚糖酶降解木聚糖，能提高發(fā)酵效率，改善口感等。木聚糖酶在工業(yè)中最重要的應(yīng)用是作為造紙工業(yè)中紙漿的生物漂白劑。木聚糖酶能降解凝結(jié)于纖維表面的半纖維素，增加漂白劑與纖維的接觸面積，提高漂白效率。但是，在利用木聚糖酶進(jìn)行預(yù)漂白時(shí)，紙漿為溫度較高的堿性漿，PH值在8.0以上，溫度在60'C左右，這就要求所用的木聚糖酶具有耐堿和耐高溫的特性(Ahlawat等,2007)。同時(shí)，造紙工業(yè)中使用的木聚糖酶不能同時(shí)具有纖維素酶活性，以免降解紙漿中的纖維，影響成漿質(zhì)量(SubramaniyanandPrema,2000)。到目前為止，國內(nèi)外已有300余種不同來源的木聚糖酶基因的報(bào)道,細(xì)菌、真菌、鏈霉菌、植物和原生動(dòng)物中均有報(bào)道(Srivastava等，1991;Suzuki等，2002;Devillard等，1999)，其中IOO多種基因在合適的宿主中被克隆和表達(dá)(WamalTO等，2007)。但是，由于木聚糖酶產(chǎn)量不高或酶的耐受性不夠等問題，以至于酶在工業(yè)上的大規(guī)模使用受到限制。而解決這一問題的方法主要有1、對現(xiàn)有的木聚糖酶進(jìn)行遺傳改造，提高酶的性質(zhì)；2、從極端環(huán)境中篩選優(yōu)良的木聚糖酶產(chǎn)生菌，并獲取優(yōu)良理化性質(zhì)的木聚糖酶基因。尤其是后者，已成為廣泛應(yīng)用木聚糖酶降低生產(chǎn)成本的突破口之一。隨著時(shí)間的推移，陸地資源日漸貧瘠，而世界海洋占據(jù)了地表面積的70%以上，是一個(gè)巨大的生物資源的寶庫。海洋環(huán)境包括了高壓、低溫、無光照、局部的高溫、高鹽等生命極限環(huán)境，以及從營養(yǎng)豐富區(qū)到只有少數(shù)微生物能生存的營養(yǎng)饋乏區(qū)等等，生態(tài)環(huán)境非常復(fù)雜而多樣。在這樣的生態(tài)環(huán)境下，海洋的微生物在長期的進(jìn)化中，發(fā)展了一些獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能，以維持其生命活動(dòng)。海洋微生物的復(fù)雜多樣使其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也具有多樣性、復(fù)雜性和特殊性，因而海洋微生物成為重要的基因庫和開發(fā)新穎生物活性物質(zhì)的極好的天然資源。因此，利用海洋微生物生態(tài)環(huán)境的復(fù)雜和多樣性，從中篩選耐受高壓、高鹽、低溫等極端性質(zhì)的木聚糖酶類是海洋微生物研究與開發(fā)的一個(gè)很好的方向。海洋微生物的木聚糖酶在環(huán)境保護(hù)、食品加工和其它生物技術(shù)過程中具有很大的應(yīng)用潛能。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種性質(zhì)優(yōu)良、適合于在造紙工業(yè)中應(yīng)用的木聚糖酶及其編碼基因，為進(jìn)一步通過基因工程的方法，利用重組生物反應(yīng)器來工業(yè)化生產(chǎn)廉價(jià)木聚糖酶提供很好的基因資源。本發(fā)明人從國家海洋局第三研究所提供的深海細(xì)菌中篩到一株被命名為Kocuriasp.Mn22的天然菌株，它所產(chǎn)生的木聚糖酶(簡稱為Kxyn)適合在造紙工業(yè)中使用。該木聚糖酶具有高活性，良好的耐堿性和熱穩(wěn)定性、對十二烷基磺酸鈉(SDS)也有一定耐受性，而且沒有纖維素酶活性，只特異性降解木聚糖。Kxyn最適pH為8.5，在不同pH緩沖液中4。C過夜處理后，在pH7.5-12的范圍內(nèi)維持80%以上的酶活性；最適溫度為55'C,在60。C處理一小時(shí)，酶活為30%左右；5mMSDS處理后還有90%的酶活。以羧甲基纖維素鈉、結(jié)晶纖維素、槐豆膠、樺木木聚糖和燕麥木聚糖為底物測定Kxyn的底物特異性，Kxyn只降解木聚糖，酶活分別為132土lIU/rog和22土2IU/rag，對樺木木聚糖的Km為5.4mgml—1,Vmax為272Wnolrain—1mg—1'本發(fā)明克隆到此木聚糖酶的編碼基因，它具有序列表SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。為此基因的改造并在各種外源基因表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)提供了優(yōu)良的基因材料。通過鳥槍法(Charles等,2005)構(gòu)建DNA文庫，得到了這個(gè)木聚糖酶基因Kxyn。序列分析結(jié)果表明，該基因全長為1170bp,編碼390個(gè)氨基酸。其完整的氨基酸序列與GeneBank上各種木聚糖酶的氨基酸序列同源性比較，最高的僅為63%，屬于第10家族糖苷水解酶中的一種新木聚糖酶。Kxyn的氨基酸序列中只有活性催化區(qū)，沒有纖維素結(jié)合區(qū)或其他功能區(qū)。申請人已將包含該基因質(zhì)粒的大腸桿菌(&c力en'cA'accJ"DH5a/Mn22/6p/Kxyn，于2008年11月5日送交湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號為CCTCCNO:M208201號。序列表SEQIDNO:l是本發(fā)明克隆的耐堿、高活性的堿性木聚糖酶Kxyn基因序列，序列全長為1170bp,其中l(wèi)-1170位bp處為編碼區(qū)。圖1:純化后的重組木聚糖酶Kxyn的SDS-PAGE分析圖中l(wèi).標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量2.純化的木聚糖酶Kxyn圖2:木聚糖酶的最適PH值。圖3:木聚糖酶的PH穩(wěn)定性。圖4:木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度。圖5:木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。具體實(shí)施方式實(shí)施例l產(chǎn)木聚糖酶的天然菌株的篩選方法將由中國海洋微生物菌種保藏中心(地址福建省廈門市中國海洋局三所)提供的海洋菌株(共計(jì)IOO個(gè)菌株)在高鹽LB(1%的蛋白胨，0.5%酵母培養(yǎng)物和2%氯化鈉，pH7.0)平板上活化后，挑出單菌落在產(chǎn)酶培養(yǎng)基(1%木聚糖，1%蛋白胨，1%酵母培養(yǎng)物，2%氯化鈉(NaCl)，0.2%磷酸氫一鉀(K2HP04)，0.03%硫酸鎂(MgS04)，0.02呢氯化鈣(CaCl2)和1.5%的瓊脂糖，pH7.0)平板上，28'C培養(yǎng)36小時(shí)后，用1柳J果紅染色10-15分鐘，然后lM的NaCl脫色，挑取產(chǎn)生較大透明圈的菌株。經(jīng)此實(shí)驗(yàn)，篩選得到一株屬于放線菌屬的考克氏菌，將該菌株命名為Kocuriasp.Mn22進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例2DNA文庫的構(gòu)建和木聚糖酶陽性克隆的篩選1、提取細(xì)菌染色體DNA:(1)將實(shí)施例的篩選的Kocuriasp.Mn22菌株，用實(shí)施例1所述的高鹽LB液體培養(yǎng)基于28'C培養(yǎng)24小時(shí)后，取1.5ml菌液于一滅菌Ep管中，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，棄上清，收集菌體；(2)用TEbuffer(50咖ol/LTris-HClp朋.0,10咖ol/LEDTApH8.0)洗菌體2次，之后加入50u1100wg/ml溶菌酶(購于sigma公司)懸浮菌體，37。C水浴一小時(shí)；(3)加入520ulTEbuffer,30ul10%SDS和3yL20mg/ml的蛋白酶K(購于si柳a公司)混勻后，37'C水浴一小時(shí)；(4)然后加入100yl5mol/L的氯化鈉溶液充分混勻，再加溴代十六烷基三甲胺(CTAB)/氯化鈉(愿CTAB，0.7MNaCl)溶液80uL混勻，70。C水浴10分鐘；(5)加入等體積的酚氯仿異戊醇(體積比為25:24:1)，混勻，室溫放置5-10分鐘。12000rpm離心10分鐘，抽提兩次，得到上清；(6)取步驟(5)的上清加入2/3體積的異丙醇輕輕混勻，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘；(7)棄上清，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室溫干燥后，溶于50ulTE溶液中，置-20。C保存?zhèn)溆?。部分酶解KocuriaspMn22染色體DNA染色體DNA用限制性內(nèi)切酶&w3AI(購自TAKARA公司)部分酶解，酶解反應(yīng)(50u1)為5y110X酶解緩沖液(購自TAKARA公司)，30y1染色體DNA，0.5U限制性內(nèi)切酶&u3AI，加水至終體積為50ul，在37'C下酶解5分鐘后，每兩分鐘取樣5"1終止酶解，瓊脂糖電泳確定最佳酶解時(shí)間，然后放大體系酶解酶解最佳時(shí)間后，瓊脂糖電泳酶解產(chǎn)物，根據(jù)DNAmarker切膠回收4-9Kb片段。純化酶解產(chǎn)物按Qiagen公司瓊脂糖膠DNA純化試劑盒(QIAquickgelpurificationkit)及操作程序進(jìn)行.具體過程是取600ulPB緩沖液(購自Qiagen公司)，與150mg含有酶解產(chǎn)物的瓊脂糖膠于50'C加熱溶膠，待瓊脂糖膠充分熔解后,上純化柱(購自Qiagen公司)，以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘,棄去流出液，再加750p1PE緩沖液(購自Qiagen公司)，用12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，棄去流出液，最后，力n50u1無離子水，用12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，離心收集純化酶解DNA。酶解、脫磷PUC18載體用限制性內(nèi)切酶及^HI(購自TAKARA公司)充分酶解質(zhì)粒載體pUC18(購自TAKARA公司)，酶解反應(yīng)(150lU)為15ulIOX酶解緩沖液(購自TAKARA公司)，100u1染色體DNA,1-2yl限制性內(nèi)切酶及Mffl,加水至終體積為150u1,在37。C下酶解2-3小時(shí)后，再加lulCIAP(購自TAKARA公司)37'C反應(yīng)1小時(shí)。瓊脂糖電泳酶解產(chǎn)物，根據(jù)DNA隨rker切膠回收2.7Kb左右片段。連接20ul連接反應(yīng)含有2u1IOX連接緩沖液(購自TAKARA公司)，2-4ul預(yù)先用feMH酶解和CIAP脫磷的pUC18載體(購自TAKARA公司)，7-10u1酶解PCR產(chǎn)物，1u1TJ)NA連接酶(購自TAKARA公司)，加水至終體積20ul，放4。C保溫過夜。轉(zhuǎn)化:取2ul連接混合物與20w1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH10B(購自Invitrogen公司)混合，加入到預(yù)冷的lmm的電轉(zhuǎn)杯(購自BioRad公司)，1.5KV電擊，然后迅速加入800u1液體LB培養(yǎng)基(其中含1%胰蛋白胨，l%Nacl,0.5%酵母粉pH7.0),37。C保溫l小時(shí)。與40ul2%X-gal和4ul20呢的IPTG(均購自sigma公司)混勻，鋪含IOOPg/ml氨芐青霉素固體LB培養(yǎng)基(配方如下1%胰蛋白胨，l%Nacl，0.5%酵母粉，1.5%瓊脂糖，pH7.0)平皿，37'C保溫14小時(shí),獲得藍(lán)白斑篩選的Jocw/a印.Mn22的DNA文庫。篩選木聚糖酶陽性克隆用滅菌牙簽將白斑挑出同時(shí)接種在含IOO化/ml氨芐青霉素固體木聚糖平板和LB平板上，培養(yǎng)過夜后，用O.5%剛果紅染色木聚糖平板10-15分鐘，然后用lMNaCl脫色，篩選產(chǎn)生透明圈的克隆，并在LB平板上保存相對應(yīng)的克隆。根據(jù)這種方法，我們從3000個(gè)轉(zhuǎn)化子中挑出一個(gè)能在木聚糖平板上產(chǎn)生透明圈的陽性克隆，插入的質(zhì)粒被命名為pUC-Kxyn。插入木聚糖酶基因的重組質(zhì)粒的制備將產(chǎn)生透明圈的陽性克隆從LB固體平板上接種到含100化/ml氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中37。C培養(yǎng)過夜，取1.5ml菌液于一滅菌Ep管中，12000分鐘/轉(zhuǎn)離心1分鐘,棄上清液，收集菌體。加入100iil溶液I(50mMTris-HC1，pH7.5，10mM乙二胺四乙酸(EDTA),核糖核酸酶A100ug/ml)充分混勻，然后加入溶液II(0.2MNaOH，1%SDS)輕輕混勻，室溫靜置3-5分鐘，最后加入溶液III快速混勻，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，收集上清；加入等體積的酚氯仿異戊醇(體積比為25:24:1)，混勻，室溫放置5-10分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘；再次收集上清，力Q2/3倍體積的異丙醇混勻后12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘沉淀DNA;棄上清，沉淀用70%乙醇洗1次；置于室溫干燥后，溶于50ulTE溶液中，置-2(TC保存?zhèn)溆眯蛄蟹治龈鶕?jù)pUC18/M13通用引物為測序引物(引物l:AGTCACGACGTTGTA;引物2:CCCAGTCACGACGTT)，以pUC-Kxyn重組質(zhì)粒為模板，由北京華大生物公司測序。測序結(jié)果通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)，插入片段確實(shí)含有木聚糖酶基因，基因全長為1170bp，編碼390個(gè)氨基酸，其完整的氨基酸序列與GeneBank上各種木聚糖酶的氨基酸序列同源性比較，最高的僅為63%，屬于第10家族木聚糖酶。實(shí)施例3大腸桿菌中克隆、表達(dá)和純化木聚糖酶Kxyn的方法構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-6P-Kxyn:根據(jù)測序結(jié)果，設(shè)計(jì)引物，該引物對的序列如下止向引物(F):5'--ACCGGATCCATGAGCAGACGAGCCCCCCT反向引物(R):5'_(ffcoRI)-GCGGAATTCTCAGCGGAACGCGGGGT以pUC-Kxyn為模板，PCR擴(kuò)增Zov7。PCR體系如下10XPCR緩沖液(購自TAKAKA公司)5iUMncl2(5mM)3P1d證(10mM)1u1模板質(zhì)粒pUC-Kxyn1u1正向引物FC10nM)1u1反向引物K(10uM)1ii1TaqDNA聚合酶(購自寶生物工程(大連)有限公司，即TAKARA,2.5U/ul)1ul加無離子水至50ulPCR條件95°C預(yù)變性4分鐘；95。C40秒；6(TC30秒；72°C60秒，30個(gè)循環(huán)；72'C延伸10分鐘，4'C5分鐘結(jié)束。酶解PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體pGEX-6P-l:PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶fe/z/HlAfcoRI(購自TAKARA公司)酶解，酶解反應(yīng)(IOOul)含有10ul10X酶解緩沖液(購自TAKAM公司)，70wlPCR產(chǎn)物，3u1限制性內(nèi)切酶Hl/fe凍I,加水至終體積為100ul,在37'C下保溫3-5小時(shí)。質(zhì)粒載體pGEX-6P-l酶解條件和體系同上一致。純化酶解產(chǎn)物按Qiagen公司PCR純化試劑盒(QIAciuickPCRpurificationkit)及試劑盒說明書介紹的操作程序進(jìn)行。具體過程是取400nlPB緩沖液(購自Qiagen公司)，與100ulPCR產(chǎn)物充分混勻后，上純化柱(購自Qiagen公司)，以12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，棄去流出液，再加750u1PE緩沖液(購自Qiagen公司)，用12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，棄去流出液，最后，加50w1無離子水，用12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，離心收集純化酶解DNA。純化質(zhì)粒pGEX-6P-l酶解產(chǎn)物方法參照實(shí)施例中"純化酶解產(chǎn)物"的方法。連接20ul連接體系含有10X連接緩沖液(購自TAKARA公司)2u1Sa邁HI/fcoRI酶解pGEX-6P-12u15a辺Hl/fcdI酶解PCR產(chǎn)物8u1T4DNA連接酶(購自TAKARA公司)1u1加無離子水至20n14'C保溫過夜。轉(zhuǎn)化將連接混合物與100ii1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a混合,冰浴放置30分鐘，42°C處理90秒，加800ulLB培養(yǎng)基(其中1%胰蛋白胨，1%氯化鈉，0.5%酵母粉，pH7.0)，37'C保溫1小時(shí)，鋪含100Pg/ml氨芐青霉素固體LB平皿，37'C保溫14小時(shí),挑取轉(zhuǎn)化子抽提質(zhì)粒。質(zhì)粒制備方法同實(shí)施例2中"帶有木聚糖酶基因的重組質(zhì)粒的制備"序列測定以pGEX-6P-Kxyn重組質(zhì)粒為模板，以pGEX-6P-1的通用引物為測序引物，交由北京華大生物公司測序。結(jié)果與pUC-Kxyn的木聚糖酶核苷酸序列完全一致。表達(dá)純化木聚糖酶將重組質(zhì)粒pGEX-6P-Kxyn轉(zhuǎn)化致大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)純化木聚糖酶。具體步驟是轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pGEX-6P-Kxyii與100u1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)混合，冰浴放置30分鐘，42°C處理90秒，加800p1LB培養(yǎng)基(其中1W胰蛋白胨，l%Nacl，0.5%酵母粉，PH7.0),37'C保溫1小時(shí)，鋪含100M/ml氨芐青霉素固體LB平皿，37'C保溫14小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)表達(dá)木聚糖酶。重組木聚糖酶在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)將過夜活化的轉(zhuǎn)化子以m的接種量轉(zhuǎn)接至lL含100^Ail氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，37'C培養(yǎng)2-3hrs,使A600達(dá)到0.6-0.7,加入異丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.2mM，18°C200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)10小時(shí)。離心收集菌體，然后用PBS緩沖液(pH7.4,140.0mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，10.0mM磷酸氫二鈉，1.8mM磷酸氫二鉀)洗滌一次，再用50ralPBS懸浮，然后用高壓細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，收集細(xì)胞破碎液。于4。C、12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，收集上清。對上清進(jìn)行初步活性實(shí)驗(yàn)和SDS-PAGE檢測上清是否有目的蛋白表達(dá)。親和層析純化木聚糖酶根據(jù)GST融合蛋白純化試劑盒(購自Pharmacia公司)及試劑盒說明書操作。(1)裝柱取lmL柱材料GSHS印harose4B至層析柱中，用50mlPBS(pH7.4，140.0mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，10.0mM磷酸氫二鈉，1.8mM磷酸氫二鉀)緩沖液過柱，平衡柱材料。(2)上樣將細(xì)胞破碎液的上清以O(shè).5ml/min的流速過柱(3)洗脫再用200mlPBS緩沖液過柱，洗脫沒有結(jié)合的蛋白(4)酶解取10ul濃度為10個(gè)單位/ul的3C蛋白酶(購自Pharmacia公司)與lml的PBS緩沖液混勻，加入層析柱酶切，在4'C酶解16小時(shí)。(5)收集蛋白收集上次添加的PBS緩沖液，然后再加lmlPBS緩沖液第二次洗脫收集。PBS緩沖液中即溶有目的蛋白Kxyn。SDS-PAGE檢測重組木聚糖酶純度濃縮膠濃度為5%，配方如下H201.4ml30%Acr-Bis(29:1)0.33ral1MTris-HCl，pH8.80.25ml10%SDS0.02ml10%過硫酸銨0.02mlTEMED0.002ml分離膠濃度為12%，配方如下H201.6ml30%Acr-Bis(29:1)2ral1MTris-HC1，pH8.81.3ml10%SDS0.05ml10%過硫酸銨0.05mlTEMED0.002ml取10iil純化的蛋白樣品，加等體積的蛋白上樣緩沖液(2X)，沸水浴5-10min，然后上樣10wl電泳檢測。SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果(圖l)表^a，純化的蛋白為單一條帶，大小為40KDa。測定木聚糖酶蛋白濃度根據(jù)Bradford蛋白定量檢測試劑盒(購自上海生工生物工程技術(shù)有限責(zé)任公司)說明書測定木聚糖酶蛋白濃度。具體步驟是(1)取4ul蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(購自上海生工生物工程技術(shù)有限責(zé)任公司)力口PBS稀釋至100ul，使終濃度為200ng/ml。(2)取稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品按O，1，2，4,6，8，10,15ul分別加到96孔板中，加PBS補(bǔ)足到20ul，每孔蛋白含量分別為O，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2和3ug,每個(gè)梯度重復(fù)3次。(3)加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中，力nPBS到20ul，重復(fù)3次(4)各孔加入200ulBradfordReagent,混勻，室溫放置5min。(5)用預(yù)熱的酶標(biāo)儀(購自ThermoScientific公司)測定A595讀數(shù)。(6)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的蛋白濃度最后計(jì)算獲得木聚糖酶濃度為O.17mg/ml。實(shí)施例4木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)的測定方法木聚糖酶最適pH和pH穩(wěn)定性測定方法如下采用常規(guī)的3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定產(chǎn)生還原糖含量。取10ul稀釋了10倍的純化的木聚糖酶加入90ul用不同pH值緩沖液配制W的樺木木聚糖底物(pH3.0-8.O緩沖液為O.2M磷酸氫二鈉/0.1M檸檬酸緩沖液；pH8.5-12緩沖液為50mM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液)，50。C反應(yīng)30min，然后加入IOOn1終止液(1L溶液酒石酸鉀鈉182.0g,3，5-二硝基水楊酸6.3g，NaOH21.Og，苯酚5.Og，無水亞硫酸鈉5.0g)終止反應(yīng)，并于10(TC反應(yīng)10min,冷卻后加雙蒸水定容至lml，再取200wl酶標(biāo)儀測定A540讀數(shù)，以最高酶活為100%,計(jì)算不同條件下的相對酶活。圖2表明，Kxyn最適pH為8.5,在pH6.5_9.5酶活均維持在最大酶活的60%以上。木聚糖酶于上述不同pH值緩沖液中4。C放置24hrs，再在pH8.5的緩沖液中測定活性，以研究Kxyn的pH值耐受性，以未處理的木聚糖酶酶活為100%，計(jì)算相對酶活。結(jié)果見圖3，圖3表明，在pH7.5-12,殘余酶活仍在80%以上，且在pH8.5-10.5時(shí)殘余酶活為100t說明此木聚糖酶Kxyn具有很好的耐堿性。木聚糖酶最適溫度和熱穩(wěn)定性測定方法如下木聚糖酶最適溫度的測定是在p朋.5的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中在不同溫度下測定酶活。熱穩(wěn)定性的測定是木聚糖酶在6(TC和70。C處理不同時(shí)間，再在最適溫度下測定酶活。圖4和圖5結(jié)果分別表明Kxyn的最適溫度為55。C，在60°C和70。C處理一小時(shí)后殘余酶活為3096和15^左右。木聚糖酶的Km和Vmax測定方法如下用PH8.5Gly-NaOH緩沖液配制不同濃度的樺木木聚糖底物(從O.5rag/mlto15mg/ml),在55°C測定酶活性，計(jì)算Kxyn55。C的Km和Vmax。經(jīng)測定，Kxyn在55。C的Km為5.4mgnil—1，V腿為2，720Wnolmin—1mg—'。各種化學(xué)試劑對Kxyn酶活的影響測定如下各種金屬離子(終濃度為lmm)和乙二胺四乙酸、二硫蘇糖醇、e-巰基乙醇和十二烷基磺酸鈉(終濃度為5rain)與木聚糖酶混勻，然后按常規(guī)方法測定酶活。以對照酶活為100%,計(jì)算相對酶活。結(jié)果(表l)表明，Hg2+，Cu2+，Zif，Pb2+和EDTA強(qiáng)烈抑制Kxyn的活性，而Mg2、Na、K'，Ca2P-巰基乙醇和DTT對Kxyn沒有影響。但是Kxyn對SDS具有耐受性，加入SDS后，Kxyn仍有9C^的酶活。表l各種化合物對本發(fā)明的木聚糖酶Kxyn的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>木聚糖酶的底物特異性測定方法如下以濃度均為1%的羧甲基纖維素鈉、結(jié)晶纖維素、樺木木聚糖、燕麥木聚糖和槐豆膠(購自sigma公司)為底物，在pH8.5緩沖液中55。C測定Kxyn對各種底物的活性。結(jié)果如表2所示，由表2可以看出，本發(fā)明制備的木聚糖酶Kxyn只對木聚糖有活性，對纖維素或葡甘露聚糖沒有活性。__表2本發(fā)明的木聚糖酶Kxyn對各種底物的活性_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>槐豆膠Notdetected結(jié)晶纖維素_Notdetected_參考文獻(xiàn)1.Polizeli，M,L.T.M.，Rizzatti,A,C.S.，Monti，R.，Terenzi,H.F,，Jorge,J.A,，Amorim，D.S.，2005.Xylanasesfromfungi:propertiesandindustrialapplications.ApplMicrobiolBiotechnol.67，577-5912.Kim，丄C.，Simmins,P.H"Mullan，B.P，2005.Thedigestibleenergyvalueofwheatforpigs,withspecialreferencetothepost-weanedanimal.AnimalFeedScienceandTechnology.122，257-2873.Eun，J.S.，Beauchemin，LA.，Hong，S.H.，2006.Exogenousenzymesaddedtountreatedorammoniatedricestraw:Effectsoninvitrofermentationcharacteristicsanddegradeability.AnimalFee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rp210Asn—Ala195200205AlaHisGluAlaAspProAsnAlaGinLeuPhePheAsnAsp215220ValGluGlylieAsnAlaLysSerAspAlaTyrTyrAla230235GinAspLeuLeuAlaGinGlyValProValHisGlyPheLeu240MetGinThrHisGly245250255GlyLeuGinTyrGlyPheAspGlyArgMetGinGinLeu260265270AsnLeuGinArgPheAsp'AspLeuGlyLeuGluThrAlaValThrGlu275280285lieAspValArgGlyProValAspGlyAspAspArgMetThrAspGlu290295300LeuArgArgLysGinAlaAspTrpTyrArgThrAlaLeuGluAlaCys305310315320LeuAlaValGluAspCysAsnSerPheThrValTrpGlyValLeuAsp325330335GluHisSerTrpValProAsnThrPheProGlyTyrGlyAspAlaLeu340345350ThrMetGluGlyAspTyrGluArgLysProAlaTyrAspAlaLeuGin355360365GluAlaLeuValArgSerGinProGlyGlyAspAlaLysTrpGluHis370375380HisProAlaPheArg38權(quán)利要求1、一種耐堿、高活性的堿性木聚糖酶Kxyn基因，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所述。2、一種編碼的耐堿、高活性的堿性木聚糖酶Kxyn基因，它的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:1所述。3、一種表達(dá)耐堿、高活性的堿性木聚糖酶Kxyn基因質(zhì)粒的大腸桿菌(Eyc/^n'c/z/aco/t)DH5a/Mn22/6p/Kxyn，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號為CCTCCNO:M208201號。全文摘要本發(fā)明屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種新的堿性木聚糖酶及其編碼基因。本發(fā)明公開所述基因的序列及其編碼區(qū)。包含該基因質(zhì)粒的大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α/Mn22/6p/Kxyn，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCNOM208201。經(jīng)過生物學(xué)驗(yàn)證，證明該木聚糖酶Kxyn具有強(qiáng)耐堿性和熱穩(wěn)定性，可專門降解木聚糖。本發(fā)明的木聚糖酶Kxyn可用于造紙等相關(guān)領(lǐng)域。文檔編號C12N15/56GK101402964SQ20081019756公開日2009年4月8日申請日期2008年11月10日優(yōu)先權(quán)日2008年11月10日發(fā)明者劉子鐸,李嬋娟,洪玉枝,邵宗澤申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)