專利名稱：一種癌胚抗原(cea)熒光定量rt-pcr引物和探針及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術領域，特別是涉及定量逆轉錄PCR檢測基因的mRNA表達。

背景技術：
惡性腫瘤的轉移是臨床治療的一大難題，也是惡性腫瘤致死的一個重要原因。及早發(fā)現(xiàn)并作出診斷，對腫瘤的臨床治療方案選擇有著很重要的意義，可以極大地提高患者的生存率。目前腫瘤轉移的發(fā)現(xiàn)和確定，主要靠臨床及病理資料，根據(jù)影像學(如X光片、CT、磁共振、PET等)或病理形態(tài)來診斷。但要使影像學檢查中能夠發(fā)現(xiàn)病灶，需要一定大小轉移灶的形成、能夠被儀器成像且有效分辨；要使病理形態(tài)上判斷出細胞惡變與否，則一定要取得合適的檢測標本，且有相當數(shù)量的可觀察的腫瘤細胞存在。從這一點上講，無論是影像學診斷還是病理學診斷，都是腫瘤形成及轉移后相當晚期、有了大量惡變細胞積累的階段，如果在腫瘤發(fā)生轉移早期，在病理上可觀察到或轉移灶形成前就發(fā)現(xiàn)，并確定轉移，則可以指導臨床治療方案的設計，并提供有力的預后依據(jù)。
血道轉移是腫瘤擴散的主要途徑之一，因此在患者外周血中進行腫瘤細胞基因表達檢測、腫瘤特異性標記產(chǎn)物檢測是了解腫瘤轉移情況的一個有效方式，因此，腫瘤標記物的檢測對腫瘤形成及轉移的具有極大的幫助。但在腫瘤轉移發(fā)生的早期，外周血中的腫瘤細胞非常小，無法完成依賴病理形態(tài)檢查，同時，腫瘤特異性抗原的含量也很少，也很難通過常用的酶標免疫吸附分析或放射免疫分析等方法檢測到，因此，對循環(huán)血中微量腫瘤細胞基因表達和一些特異性產(chǎn)物檢測的研究已經(jīng)引起了人們的廣泛關注。
目前腫瘤發(fā)病率和死亡率居高不下，某些惡性腫瘤還有上升的趨勢。如能對腫瘤轉移患者早期發(fā)現(xiàn)，對進一步治療文案的制定都有非常重要的意義，是提高腫瘤的治愈率重要途徑之一。對我國醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展有極重要的初會意義與經(jīng)濟意義。因此，我們致力于開發(fā)惡性腫瘤轉移早期檢測及診斷技術，以解決臨床治療后大難題。
隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展及其在醫(yī)學研究中的廣泛應用，通過聚合酶鏈反應(PCR)技術檢測外周血中微量腫瘤細胞早已得到應用，特別是熒光定量PCR的出現(xiàn)，有著無法比擬的高靈敏度和特異性。由于熒光定量PCR具有重復性好，靈敏度高，定量結果準確可靠的特點，所以醫(yī)學檢測方面，一些常規(guī)檢測方法所不能解決的問題得到了解決。例如，細胞形態(tài)學檢查可直接觀測到腫瘤細胞，但由于腫瘤脫落至血循環(huán)中的數(shù)目微小，這種檢查的敏感性和特異性均較差，陽性率低。免疫組織化學方法提高了血循環(huán)中腫瘤細胞染色的特異性，特別是單克隆抗體的應用使染色的特異性和敏感性有了較大的改善，可查出104-105個有核細胞中的一個腫瘤細胞。但該技術則需要特異性的抗體，生產(chǎn)相對復雜。同時，假陽性限制了此項技術的廣泛應用。與這些技術相比，熒光定量PCR技術有著明顯的優(yōu)點，由于大多數(shù)基因的調(diào)節(jié)發(fā)生于轉移水平，有些腫瘤可轉錄特異性mRNA，但無相應蛋白合成，故熒光定量PCR應用范圍較廣；PCR簡便易行，只要知道待測基因序列，即可設計合成引物進行逆轉錄及擴增；該方法具有較高的靈敏度及可重復性，也保證了醫(yī)學檢測結果的準確性。所以該技術的應用，將會對早期尋找腫瘤患者血循環(huán)中的腫瘤細胞，發(fā)現(xiàn)微小轉移，對于指導臨床治療、改善患者預后產(chǎn)生極為重要的作用。
癌胚抗原(CEA)是消化道腫瘤特異性較高的腫痛相關抗原，它來自于上皮類腫瘤細胞，而在正常人外周血及其它組織、體液中無CEA mRNA的表達。因此，檢測患者的外周血、胸腹水、穿刺液、骨髓等標本中有無CEA mRNA的表達，可以對腫瘤的診斷的治療提供有力證據(jù)，還可以對腫瘤的轉移和復發(fā)情況以及療效觀察提供幫助。以往對CEA mRNA的檢測采用的是定性RT-PCR法，其特異性相對比較差，且無法精確定量。熒光定量RT-PCR技術及相應的熒光定量PCR儀的推出使得人們可以在利用PCR高靈敏度的情況下，對PCR產(chǎn)物進行實時精確定量檢測，不僅解決了PCR的定量問題，而且還大大提高了檢測特異性。


發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術問題 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR引物和探針及試劑盒，以克服現(xiàn)有技術對早期腫瘤患者外周血等癌胚抗原(CEA)mRNA表達水平的定量檢測準確性差、靈敏度低、檢測速度慢，不利于根據(jù)CEA mRNA表達及時治療的缺陷。
技術方案 本發(fā)明是生物技術領域的一種通過對新鮮抗凝外周血提取總RNA，并通過逆轉錄mRNA樣品得到cDNA，再結合實時熒光定量PCR檢測技術，可準確定量檢測標本中CEA mRNA表達量。
本發(fā)明的技術方案之一是提供一組癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR引物和探針，包括如下序列 癌胚抗原(CEA)上、下游引物 上游引物為SEQ ID NO15’-AATAAC GGG ACC TAT GCC TGT T-3’ 下游引物為SEQ ID NO25’-GAAACTACA CCA GGG CTG CTA-3’ 癌胚抗原(CEA)檢測探針為SEQ ID NO4 5’-FAM-AGC AAC CCC AAC CAG CAC TCC AA-TAMRA-3’； 或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列； 或者與上述序列同源性大于85％的序列； 或者上述序列的堿基互補序列； 或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
上述的一組CEA mRNA熒光定量RT-PCR檢測引物和探針的優(yōu)選技術方案為，其序列組還包括內(nèi)參基因葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)的引物和探針 G6PDH內(nèi)參基因上、下游引物 上游引物SEQ ID NO45’-GGG CCA GTA CCA GTC TTA CA-3’ 下游引物SEQ ID NO55’-CCA GCG AAG GTT GTC AAT GT-3’ G6PDH內(nèi)參基因檢測探針 SEQ ID NO65’-FAM-CCG ACC TTC GCA GCC GTC CTAGT-TAM RA-3’ 或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列； 或者與上述序列同源性大于85％的序列； 或者上述序列的堿基互補序列； 或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
本發(fā)明的技術方案之二是提供一種含有上述引物和探針序列的CEAmRNA熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其組成為細胞裂解液、水、含引物序列SEQ ID NO1-2的CEA RT-PCR反應液、內(nèi)參G6PDH RT-PCR反應液、含探針序列SEQ ID NO3的CEA檢測探針、G6PDH基因探針、逆轉錄酶、DNA聚合酶、標準品、陽性對照、陰性對照。
所說的CEA RT-PCR反應液組成為RT-PCR緩沖液、MgCl2、CEA上、下游引物、dNTPs、無RNA酶的水。
上述的CEA mRNA熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的優(yōu)選技術方案之一為，所說的內(nèi)參G6PDH RT-PCR反應液中的引物序列為SEQ ID NO4和5，且所說的G6PDH基因探針序列為SEQ ID NO6。
所說的G6PDH RT-PCR反應液組成為RT-PCR緩沖液、MgCl2、管家基因(G6PDH)上、下游引物、dNTPs、無RNA酶的水。
上述的CEA mRNA熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的優(yōu)選技術方案之二為，所說的標準品為如下DNA序列SEQ ID NO7 5’-AATAACGGGA CCTATGCCTG TTTTGTCTCT AACTTGGCTACTGGCCGCAA TAATTCCATA GTCAAGAGCA TCACAGTCTCTGCATCTGGA ACTTCTCCTG GTCTCTCAGC TGGGGCCACTGTCGGCATCA TGATTGGAGT GCTGGTTGGG GTTGCTCTGATATAGCAGCC CTGGTGTAGT TTC-3’ 作為特例，標準品是含有插入CEA特異性保守序列的T載體，該載體可在大腸桿菌DH5a中增殖。
上述的CEA mRNA熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的優(yōu)選技術方案之三為，所說的水為無RNA酶的水。
一般，無RNA酶的水獲得方法為向去離子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至終濃度為0.01％(V/V)，室溫(22-25℃)放置10-12小時后，121℃，20分鐘高壓，室溫放置備用； 上述的CEA mRNA熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的優(yōu)選技術方案之四為，所說的陰性對照為正常人mRNA樣本。
上述的CEA mRNA熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的優(yōu)選技術方案之五為，所說的陽性對照為含有腫瘤患者mRNA樣本。
上述的CEA mRNA熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的優(yōu)選技術方案之六為，所說的細胞裂解液由細胞裂解液I和細胞裂解液II組成。
作為特例，細胞裂解液I組成為320mM蔗糖、5mM MgCl2、1％TritonX-100，10mM Tris-HCl[pH7.5]、水； 作為特例，細胞裂解液II組成為4M硫氰酸胍、0.75M檸檬酸鈉(pH7.0)和10％月桂酰基肌氨酸鈉(Sarcosyl 1g/10mL)、14.3M β-巰基乙醇、2M醋酸鈉(pH4.0)和水飽和酚； 上述各方案中所說的逆轉錄酶和DNA聚合酶在試劑盒中的形式可以為混合兩種酶的混合液。一般而言，DNA聚合酶選用耐熱Taq DNA聚合酶。
上述的CEA mRNA熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的優(yōu)選技術方案之六為，每盒中各組分的量為細胞裂解液I 1瓶24mL、細胞裂解液II 1瓶6mL、無RNA酶的水1瓶2mL、CEA RT-PCR反應液1管210μL、G6PDH RT-PCR反應液1管210μL、CEA檢測探針1管30μL、G6PDH內(nèi)參基因探針30μL、標準品1管10μL、和陰性對照品1管10μL。
本試劑盒中的細胞裂解液(即RNA總提取試劑)應于4℃保存，RT-PCR試劑保存于-20℃，盡量減少反復凍融。
本發(fā)明還提供所說的試劑盒的使用方法如下 首先，每次檢測目的基因(CEA)和管家基因(G6PDH)均應設立陽性對照和陰性對照。
樣品要求
1～2mL抗凝的新鮮外周血或骨髓樣本。
采集靜脈血或骨髓1～2mL于含有抗凝劑的無菌離心管中，或于無菌離心管中，使用EDTA作抗凝劑(1.44mg/mL全血)。樣本采集后應立即使用，若不能立即使用，可以4℃保存1-2小時，但時間不宜再過長，否則將影響檢測結果。全血經(jīng)處理后，得到的有核細胞可在-80℃或液氮中保存數(shù)月，不會影響檢測結果。
操作步驟
一、總RNA提取 1.將新鮮抗凝全血或骨髓1～1.5mL置于1.5mL Beckman離心管中，4℃下3000g離心10min，棄上清液。
2.在下層細胞中補滿細胞裂解液I，混勻，冰浴10min其間再次混勻兩次，溶液變清表明紅細胞已裂解。
3.4℃下3000g離心10min沉淀有核細胞，完全棄去含有裂解細胞的上清液。
4.用細胞裂解液I重復裂解1次后(若沉淀中仍有紅細胞，需重復此操作1～2次)，傾去上清，吸干管口。
5.在上述沉淀有核細胞中加入50μL無RNA酶水，用槍頭抽吸打散形成清亮不粘的溶液，再加入450μL細胞裂解液II，用移液器反復吹打混勻，室溫放置5分鐘。
6.加200μL三氯甲烷，用手來回振蕩混勻15秒，室溫放置5分鐘，4℃15,000rpm離心10分鐘，將上清移入新的離心管。
7.加入等體積異丙醇，旋渦振蕩5秒，室溫沉淀10分鐘，4℃15,000rpm離心5分鐘，棄上清。
8.加入500μL預冷的75％乙醇洗滌，上下顛倒10次，4℃10,000rpm離心5分鐘，吸干上清，沉淀室溫干燥10-20分鐘，加入20μL無RNA酶水稀釋混勻，立即使用或-70℃保存。
二、RT-PCR 將裝有CEA RT-PCR反應液、內(nèi)參G6PDH RT-PCR反應液、CEA檢測探針、G6PDH管家基因探針、混合酶、標準品、對照品的離心管從-20℃中取出，置于冰盒上待其緩慢融化后，低速離心，用移液器將上述試劑分別配制目的基因(CEA)和管家基因(G6PDH)RT-PCR反應液，混勻，低速離心，置于冰盒上備有。
按下列組成配制RT-PCR反應液(30μL體系)

RT-PCR反應條件37℃30分鐘；95℃5分鐘；(95℃10秒，60℃60秒，40個循環(huán))。
三、標準曲線的制作 將標準品貯存液(7.5×107copies/μL)梯度稀釋為7.5×106，7.5×105，7.5×104，7.5×103copies/μL，取4μL為模板，同待測樣品一同進行RT-PCR擴增，制作標準定量曲線。
結果判斷
1.使用實時熒光定量PCR儀的隨機軟件進行文件保存及閾值的設定。
2.選中不同濃度標準品，應用相應軟件進行分析，得出標準曲線及相關信息。
3.選中樣品所對應有目的基因和管家基因檢測孔，應用相應的軟件進行分析，得出待測樣品目的基因和管家基因的起始拷貝數(shù)(即[Copy]sample和[Copy]IPC)。
4.根據(jù)檢測樣本目的基因和管家基因的起始拷貝數(shù)，計算基因表達率，即Expression Ratio＝[Copy]sample/[Copy]IPC。
有益效果 本發(fā)明的試劑盒通過對新鮮抗凝外周血有核細胞提取總RNA，為了排除不同標本以及因提取造成在RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量和逆轉錄效率上可能存在的差別而獲得目標基因特異性表達的真正差異，選擇中等豐度表達，在細胞標本間變異較低的G6PDH作為內(nèi)參照基因進行校正和標準化，再結合實時熒光定量RT-PCR檢測技術，可同時準確檢測標本中CEAmRNA的表達水平，從而能迅速、準確檢出CEA，為臨床選擇可行的治療方案、預后判斷以及療效觀察提供重要的參考依據(jù)。
本發(fā)明建立了利用TaqMan技術檢測CEA mRNA表達的方法，并且經(jīng)過對消化道腫瘤患者標本進行檢測，表明該法切實可行。由于本方法采用了熒光定量PCR，使得CEA mRNA表達的檢測敏感性和特異性大大的提高，降低了常規(guī)PCR擴增的假陽性率，從而使得本發(fā)明可以在極少量的標本中獲得足夠的信息。同時為了排除不同標本以及因提取時造成在RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量和逆轉錄效率上可能存在的差別而獲得目標基因特異性表達的真正差異，通過篩選確定以中等豐度表達，在細胞標本間變異較低的G6PDH作為內(nèi)參照基因(也稱管家基因)進行校正和標準化。
在本檢測項目中，本發(fā)明采用了目前最為先進的實時熒光定量PCR檢測技術，在保持高敏感性的前提下，盡量減少假陽性的干擾。在實量熒光定量PCR檢測技術出現(xiàn)之前，人們對PCR模板的定量都要通過PCR產(chǎn)物電泳，再將電泳結果經(jīng)計算機圖像處理，根據(jù)電泳條帶的高度來確定最終PCR產(chǎn)物量的多少，或將帶標記的PCR產(chǎn)物以ELISA的方式進行檢測，再由此推測出起始模板的量，但這些方法實際上都有屬于半定量水平，因為即使PCR條件已最優(yōu)化，電泳及后續(xù)步驟的操作的不穩(wěn)定性仍會給結果的分析帶來影響，從而影響定量這一目的。隨著本發(fā)明實時熒光定量PCR技術的應用，可以真正地做到對PCR模板的精確定量，這種定量不僅保持了常規(guī)PCR的高敏靈性，而且由于特異性熒光探針雜交技術的應用，使得被子檢測基因的特異性大大提高。
本發(fā)明的引物、探針和試劑盒采用熒光定量RT-PCR方法，該方法靈敏、特異、重復性好，結果用拷貝數(shù)表示，準確可靠，利于統(tǒng)一標準。針對臨床樣品的檢測顯示該方法靈敏度好，重組質(zhì)粒定量模板，按10倍梯度稀釋，可檢出10個拷貝，并由此制出標準曲線，線性范圍寬(0～107拷貝)，方法的穩(wěn)定性、重復性、相關性好，相關系數(shù)為0.997。



圖1為樣本標準檢測圖。
圖2為樣品標準曲線圖。

具體實施例方式 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆操作手冊，或按照制造廠商所建議的條件。所有無機化學試劑和有機溶劑購自上海化學試劑廠，Trizol試劑購自上海生工公司，限制性內(nèi)切酶購自上海申能博彩生物公司，MMLV逆轉錄酶、Taq DNA聚合酶、Oligo(dT)15-18均購自美國Promega公司，引物和探針均由上海生工公司合成。Eppendorf梯度式PCR擴增儀購自德國Eppendorf公司，PE7500熒光PCR儀為ABI公司產(chǎn)品。
實施例1 實時熒光定量RT-PCR法檢測腫瘤患者CEA mRNA的表達及應用 一、引物及探針設計與合成 以CEA全長cDNA序列(GenBank登錄號NM_004363)為模板，使用Oligo軟件分析TaqMan引物和探針的位點，從中選擇最佳組合。
標準品PCR上游引物序列為5’-ACA CAA GTT CTC TTT ATC GC-3’；下游引物序列為5’-TCA CGA TGT TGG CTA GGA T-3’； 檢測用PCR上游引物序列為5’-AGG AGC CCC GTC ATA GGA AG-3’和5’-GAC CTC AGC TCT TGC ATC AC-3’；下游引物序列為5’-GTG GTAGCC TGA GGA CTT GT-3’； 熒光探針序列為5’-FAM-CTG AAG AGA TAG TGC CCA GCCCTC-TAM RA-3’； 二、檢測標準品制備 取患者新鮮外周血，分離外周血有核細胞，經(jīng)PBS洗滌后，離心收集細胞，用Tri zol試劑提取總RNA，取1μgRNA，在25μL總反應體系中用Oligo(dT)15-18為引物對其進行逆轉錄后，用標準品上、下游引物在Eppendorf梯度式PCR擴增儀上進行PCR擴增，反應條件為95℃變性5分鐘，再按95℃20秒、57℃20秒、72℃45秒進行35個循環(huán)擴增，最后于72℃延伸7分鐘后置于4℃。
PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后送上海超世生物公司進行克隆(質(zhì)粒由該公司提供)，并將陽性克隆經(jīng)測序驗證(由上海英駿公司測序)。提取陽性克隆質(zhì)粒，即為標準品，測定其濃度并換算成(拷貝數(shù)/體積)。
三、標本檢測 取6例經(jīng)病理確定的消化道腫瘤患者和4例正常人外周血標本1.5mL，分離外周外有核細胞，經(jīng)PBS洗滌后，離心收集細胞，用Trizol試劑提取總RNA，取4μL RNA提取液，在30μL總反應體系中，用檢測用上、下游引物以及管家基因上、下游引物同時在PE7500熒光PCR儀上進行PCR擴增，反應條件均為37℃保溫30分鐘，94℃變性5分鐘，再按94℃20秒、60℃45秒進行40個循環(huán)擴增，同時加入標準品檢測作標準曲線，測定結果經(jīng)儀器處理根據(jù)標準曲線計算出檢測標本的CEA mRNA和G6PDH管家基因的拷貝數(shù)，再根據(jù)兩者的拷貝數(shù)計算CEAmRNA表達率。
四、結果 (一)標準品的制備 經(jīng)測序，上述設計的標準品完全與預期相符，回收的標準品片段序列如下 5’-A CACAAGTTCT CTTTATCGCC AAAATCACGC CAAATAATAACGGGACCTAT GCCTGTTTTG TCTCTAACTT GGCTACTGGCCGCAATAATT CCATAGTCAA GAGCATCACA GTCTCTGCATCTGGAACTTC TCCTGGTCTC TCAGCTGGGG CCACTGTCGGCATCATGATT GGAGTGCTGG TTGGGGTTGC TCTGATATAGCAGCCCTGGT GTAGTTTCTT CATTTCAGGA AGACTGACAGTTGTTTTGCT TCTTCCTTAA AGCATTTGCA ACAGCTACAG TCTAAAATTGCTTCTTTACC AAGGATATTT ACAGAAAAGA CTCTGACCAGAGATCGAGAC CATCCTAGCC AACATCGTGA-3’ (二)樣品檢測 標準品檢測結果見圖1，標準曲線見圖2。
取6例經(jīng)病理確定的消化道腫瘤患者和4例正常人外周血熒光定量RT-PCR檢測結果如下 表達率(Ratio) 患者編 性年 融合基因 G6PDH 標本 (CopyPML/ABL/ 號 別齡 (copies/mL) (copies/mL) CopyG6PDH) 1 女32外周血1.171*1033.564*102 3.29 2 男47外周血6.142*1025.894*102 1.04 3 女41外周血1.073*1032.149*102 4.99 4 男53外周 2.531*1012.846*101 0.89 5 男38外周 3.719*1024.417*102 0.84 6 女65外周血2.142*1032.782*102 7.70 7 女59外周血-- - 8 男36外周血-- - 9 男29外周血-- - 10 女61外周血-- - 采用同樣的檢測PCR上、下游引物以及同樣的6例樣本進行原位RT-PCR檢測。
實驗方案如下 逆轉錄反應反應體系20μL.含200μmol/L dNTPs.1μmoI/L下游引物，RNA酶抑制劑40U和Mo-MLV 20U，反應液經(jīng)一個基因框(GeneFrame，購于Advanced Biotechnologies公司)密封在上述玻片中心附有細胞的區(qū)域，玻片在原位PCR儀(Genius，英國Techne公司)中42℃反應30min，結束后去除基因框，甩棄反應液。
原位PCR反應體系25μL，含200μmol/L dNTPs，1μmol/L上、下游引物，4.5mmol/L MgCl2，10μmol/L地高辛標記的dUTP和Taq酶5U。反應液同樣密封在上述部位，反應條件為95℃變性5min后，以94℃變性，58℃退火和72℃延伸各1min，在原位PCR儀上，總共進行25循環(huán)。
擴增產(chǎn)物檢測①洗片2×SSC洗片3次，含0.1％吐溫-20的Buffer I(0.1moI/L Tris-HCI pH7.5，0.15M MgCl2)洗2次，每次5min；含5％牛血清白蛋白(BSA)和3％綿羊血清的Buffer II室溫孵育30min，再用抗地高辛抗體滴片，濕盒內(nèi)37℃孵育2h；②再洗片含0.1％吐溫-20的Buffer I洗3次，BufferII洗1次，BufferIII(0.1mol/L Tris-HCl pH9.5，0.1mol/L NaCl，0.05mol/LMgCl2)洗1次，每次5min；NBT/BCIP避光染色約30min，光鏡下觀察，待顯色適度后水洗終止，蓋上蓋玻片，甘油明膠封片；③結果判斷細胞漿中出現(xiàn)藍紫色顆粒物質(zhì)為陽性，陰性者胞漿內(nèi)無藍紫色顆粒。
取6例經(jīng)病理確定的消化道腫瘤患者和4例正常人外周血原位RT-PCR檢測結果如下 編號 性別 年齡標本 檢測結果 1女32 外周血陽性 2男47 外周血陽性 3女41 外周血陽性 4男53 外周血陽性 5男38 外周血陽性 6女65 外周血陽性 7女59 外周血陰性 8 男36外周血陰性 9 男29外周血陰性 10女61外周血陰性 雖然，原位RT-PCR檢測結果與熒光定量RT-PCR檢測結果一致，但其操作過程過余復雜，結果判斷受主觀因素的影響，而且只能作定性檢測，不能迅速、準確檢出CEA mRNA表達量，為臨床選擇可行的治療方案、預后判斷以及療效觀察提供重要的參考依據(jù)。
核苷酸序列表
SEQUENCE LISTING
<110>上海復星醫(yī)藥(集團)股份有限公司
上海復星醫(yī)學科技發(fā)展有限公司
<120>一種癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR引物和探針及試劑盒
<130>5
<140>CN
<141>2008-10-10
<160>7
<170>PatentIn version 3.3
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<211>21
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gaaactacac cagggct gct a 21
<210>3
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<213>Homo sapiens
<220>
<221>SEQ ID NO3
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<223>“n＝FAM”，“y＝TAMRA”
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<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
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<213>Homo sapiens
<220>
<221>SEQ ID NO5
<222>(1)..(20)
<400>5
ccagcgaagg ttgtcaatgt 20
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>SEQ ID NO6
<222>(1)..(23)
<223>“n＝FAM”，“y＝TAMRA”
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<400>6
nccgaccttc gcagccgtcc tagty 25
<210>7
<211>183
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>SEQ ID NO7
<222>(1)..(183)
<400>7
aataacggga cctatgcctg ttttgtctct aacttggcta ctggccgcaa taattccata 60
gtcaagagca tcacagtctc tgcatctgga acttctcctg gtctctcagc tggggccact 120
gtcggcatca tgattggagt gctggttggg gttgctctga tatagcagcc ctggtgtagt 180
ttc 18權利要求
1.一組癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-CR引物和探針，包括如下序列
癌胚抗原(CEA)上、下游引物
上游引物為SEQ ID NO15’-AATAAC GGG ACC TAT GCC TGT T-3’
下游引物為SEQ ID NO25’-GAAACT ACA CCA GGG CTG CTA-3’
癌胚抗原(CEA)檢測探針為SEQ ID NO3
5’-FAM-AGC AAC CCC AAC CAG CAC TCC AA-TAM RA-3’；
或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列；
或者與上述序列同源性大于85％的序列；
或者上述序列的堿基互補序列；
或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
2.根據(jù)權利要求1所述的一組癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR引物和探針，其序列組還包括內(nèi)參基因葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)的引物和探針
G6PDH內(nèi)參基因上、下游引物
上游引物SEQ ID NO45’-GGG CCA GTACCA GTC TTA CA-3’
下游引物SEQ ID NO55’-CCA GCG AAG GTT GTC AAT GT-3’
G6PDH內(nèi)參基因檢測探針為SEQ ID NO6
5’-FAM-CCG ACC TTC GCA GCC GTC CTA GT-TAMRA-3’
或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延長的序列；
或者與上述序列同源性大于85％的序列；
或者上述序列的堿基互補序列；
或者使用上述所有序列中的任意一種或一種以上的組合。
3.一種含有權利要求1所述的一種癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其組成為細胞裂解液、水、含有權利要求1所述引物序列SEQ IDNO1～2的CEA RT-PCR反應液、內(nèi)參G6PDH RT-PCR反應液、含有權利要求1所述探針序列SEQ ID NO3的CEA檢測探針、G6PDH基因探針、逆轉錄酶、DNA聚合酶、標準品、陽性對照、陰性對照。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所說的內(nèi)參G6PDH RT-PCR反應液中的引物序列為SEQ IDNO4和5，且所說的G6PDH基因探針序列為SEQ ID NO6。
5.根據(jù)權利要求3所述的癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所說的標準品為如下DNA序列SEQ ID NO7
5’-AATAACGGGA CCTATGCCTG TTTTGTCTCT AACTTGGCTACTGGCCGCAA TAATTCCATA GTCAAGAGCA TCACAGTCTCTGCATCTGGA ACTTCTCCTG GTCTCTCAGC TGGGGCCACTGTCGGCATCA TGATTGGAGT GCTGGTTGGG GTTGCTCTGATATAGCAGCC CTGGTGTAGT TTC-3’。
6.根據(jù)權利要求3所述的癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所說的水為無RNA酶的水。
7.根據(jù)權利要求3所述的癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所說的陰性對照為正常mRNA樣本。
8.根據(jù)權利要求3所述的癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，陽性對照為含有癌胚抗原(CEA)mRNA樣本。
9.根據(jù)權利要求3所述的癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，所說的細胞裂解液由細胞裂解液I和細胞裂解液II組成。
10.根據(jù)權利要求3所述的癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于，每盒中各組分的量為細胞裂解液I1瓶24mL、細胞裂解液II1瓶6mL、無RNA酶的水1瓶2mL、CEART-PCR反應液1管210μL、G6PDHRT-PCR反應液1管210μL、CEA檢測探針1管30μL、G6PDH內(nèi)參基因探針30μL、標準品1管10μL、和陰性對照品1管10μL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種癌胚抗原(CEA)熒光定量RT-PCR引物和探針及試劑盒，癌胚抗原(CEA)引物和探針序列為SEQ ID NO1～3，內(nèi)參基因引物和探針序列為SEQ ID NO4～6，試劑盒包含細胞裂解液、水、RT-PCR反應液、內(nèi)參G6PDHRT-PCR反應液、CEA探針、G6PDH內(nèi)參基因探針、混合酶、標準品、對照品。可以快速、精確定量檢測樣品中CEA mRNA的表達量。該試劑盒可用于臨床及科研中檢測患者的外周血及腫瘤組織中CEA的表達量，用以輔助診斷、指導治療及提示預后。
文檔編號C12N15/11GK101760521SQ200810201640
公開日2010年6月30日 申請日期2008年10月23日 優(yōu)先權日2008年10月23日
發(fā)明者沈維祥, 吳大治, 夏懿 申請人:上海復星醫(yī)藥(集團)股份有限公司, 上海復星醫(yī)學科技發(fā)展有限公司