專利名稱：：Pik3ca基因突變的檢測探針、液相芯片及其檢測方法
技術領域：
：本發明屬于分子生物學領域，具體的是涉及PIK3CA基因突變的檢測探針、液相芯片及其檢測方法。
背景技術：
：PIK3CA基因是逆轉錄病毒r/7說癌基因在細胞內的同系物，編碼IA類磷脂酰肌醇3激酶(pho印hatidylinositol3-kinases,PI3Ks)的pllOa催化亞單位。I類PI3Ks是由一個p110催化亞單位和一個p85調節亞單位組成的異源二聚體，可受表皮生長因子受體(印idermalgrowthfactorrec印tor，EGFR)、胰島素受體等受體酪氮酸激酶的激活。活化的PI3Ks磷酸化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸[phosphatidylinositol4,5-bisphosphate，PI(4,5)P2],生成細胞內的重要第二信使——磷脂酰肌醇(3，4,5)三磷酸(phosphatidyli-3，4，5-triphosphate,PIP3)。PIP3可激活AKT通路，從而產生廣泛的生物學效應，包括調節細胞增殖、存活和細胞周期調控等，涉及mT0R(targetofrapamycin)、BAD、Caspase9、Tuberin、GSK3P和FH(forkhead)轉錄因子家族亞群等眾多的靶分子。對PI3K家族全部16個成員的激酶結構域外顯子編碼區域進行序列分析顯示，PIK3CA是唯一被發現由體細胞突變引起致癌的基因。進一步的研究指出，大部分PIK3CA基因突變集中在螺旋結構域和催化結構域，被稱為PIK3CA基因突變的"熱點"。最新的研究表明，PIK3CA基因突變可發生在包括乳腺癌、卵巢癌、結直腸癌、肺癌、肝癌、胃癌等多種惡性腫瘤細胞中。目前，PI3K通路已經成為各大醫藥公司開發抗腫瘤小分子抑制劑的主要靶標，而PIK3CA基因也成為了腫瘤診斷及治療的主要靶點。目前'Quinolone、Pyricbpyrimidine、Imidaz叩yridine等藥物均是根據PIK3CA靶點和相應的PI3K通路而開發的。然而，由于PIK3CA在腫瘤細胞中存在的突變的高頻性，各種針對EGFR基因以及PI3K通路而開發的藥物療效存在著個體差異。Maruyama等研究報道，存在PIK3CA基因突變的患者其預后更為積極。而有的研究者則指出，在乳腺癌中，PIK3CA中不同的基因突變位點其預后也不同。外顯子9(螺旋結構域)上的突變的患者預后比野生型個體要差，而外顯子20(催化結構域)上的突變相對與野生型個體具有積極的預后。盡管PIK3CA基因突變對腫瘤患者的治療預后的尚未定論，但這些研究都提示著PIK3CA基因突變是影響預后的一個重要因素。因此，對腫瘤患者尤其是乳腺癌患者，進行PIK3CA基因突變的檢測是實現腫瘤個體化治療，讓患者最大程度的受益就顯得十分必要了。當前，國內外進行PIK3CA基因突變檢測的主要方法是進行組織DNA樣本的直接測序。直接測序法具有直接和直觀等優點，能夠確切的了解PIK3CA基因突變的位點和類型，然而，直接測序法存在著靈敏度差和效率低等問題，嚴重的影響了其在臨床上的應用。由于腫瘤組織存在著異質性的問題，即使存在PIK3CA基因突變的患者樣本中也含有大量的野生型基因，從而干擾了PIK3CA基因突變的有效檢出，目前直接測序法可以達到的檢測的靈敏度大概為15%-25%;同時，直接測序法難以實現高通量的檢測，其時效性嚴重的制約了其在臨床診斷中推廣。國際上最先進的檢測PIK3CA基因突變的技術是采用位點特異的熒光定量PCR，該方法的優勢在于提高了檢測靈敏度和檢測的時效性。但實時熒光定量PCR檢測技術本身存在著假陽性率高亦即特異性差的問題，也為臨床診斷所詬病。因此，PIK3CA基因突變的檢測要成為一項臨床常規檢測技術，必須建立一種靈敏度高、特異性好并且能夠實現高通量檢測的簡便易行的檢測新技術，是各級醫院都有條件開展這一基因診斷項目。
發明內容本發明的目的在于提供用于PIK3CA基因突變檢測的探針，以及應用這些探針所制備的PIK3CA基因突變檢測液相芯片。該液相芯片可用于檢測PIK3CA基因外顯子9和/或外顯子20上的相關突變，從而為臨床治療提供參考。實現上述目的的技術方案如下用于PIK3CA基因突變檢測的探針包括有針對E542的野生型的SEQIDNO.1探針和針對E542K點突變的SEQ丄DNO.2探針；禾口/或針對E545野生型的SEQIDNO.3探針，針對E545K點突變的SEQIDNO.4探針和針對E545D點突變的SEQIDNO.5探針；和/或針對E1047的野生型SEQIDN0.6探針、針對E1047R點突變的SEQIDNO.7探針。一種PIK3CA基因突變檢測的液相芯片，主要包括有包被有SEQIDNO.1的、針對E542的野生型氨基修飾探針的微球、和包被有SEQIDN0.2的、針對E542K點突變的氨基修飾探針的微球；和/或包被有于SEQIDN0.3的針對E545的野生型氨基修飾探針的微球、包被有SEQIDN0.4的針對E545K點突變的氨基修飾探針的微球、以及包被有SEQIDNO.5的針對E545D點突變的氨基修飾探針的微球；和/或包被有SEQIDNO.6的、針對E1047的野生型氨基修飾探針的微球、和包被有SEQIDNO.7的、針對E1047R點突變的氨基修飾探針的微球；上述每種探針的堿基序列與氨基之間連接有間隔臂，上述每種微球具有不同顏色編碼；以及用于擴增出具有PIK3CA的9外顯子和/或20外顯子突變位點的目標序列的引物，且該目標序列的末端具有生物素標記。以上所述間隔臂為用于將特異性的探針與微球表面間隔開來或是將特異性探針置于親水性環境中的序列。通過在探針序列與氨基之間設置適當長度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應的效率以及雜交反應的特異性。常見的間隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n間隔臂(n》3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)千擾，還可以用poly(TTG)作為間隔臂。本發明間隔臂優選為5—30個T，更優選為IO個T。優選地，用于擴增出具有9外顯子突變位點的目標序列的引物包括有SEQIDNO.8SEQIDNO.10引物序列，所述引物中至少有一條帶有末端的生物素標記；和/或用于擴增出具有20外顯子突變位點的目標序列的SEQIDNO.11SEQIDNO.13引物，所述引物中至少有一條帶有末端的生物素標記。本發明的另一目的還在于提供一種PIK3CA基因突變的檢測方法，該方法快速、準確、操作簡便，可同時并行檢測多個突變位點。一種使用上述PIK3CA基因突變檢測的液相芯片PIK3CA基因突變的檢測方法，包括以下步驟(1)提取待檢測樣本中的DNA后，以用于擴增出具有PIK3CA基因9外顯子和/或20外顯子突變位點的目標序列的引物進行第一輪PCR擴增；(2)酶切富集第一輪PCR擴增產物；(3)以酶切產物為模板進行第二輪PCR擴增；(4)第二輪PCR擴增產物與上述包被有探針序列的微球進行雜交；(5)雜交反應后加入鏈霉親和素-藻紅蛋白進行反應，然后通過Luminex儀器檢測信號。優選地，進行第一輪PCR擴增用的引物對為SEQIDNO.8、SEQIDNO.9和/或SEQIDNO.11、SEQIDNO.12。進行第二輪PCR擴增用的引物對SEQIDNO,9、SEQIDNO.10和/或SEQIDNO.12、SEQIDNO.13。優選地，雜交的溫度為55—6(TC。優選地，每種包被有探針的微球的制備方法包括步驟如下(1)取微球母液，渦旋，充分混勻成微球懸液；(2)取出8ul微球母液，共含0.8X105—1.2X1()5個微球至0.5ml離心管中；(3)》10，000rPm離心25min，棄去上清液；(4)加入10y1偶聯液(pH4.5)，渦旋使之充分混勻；(5)加入2pmol/iU探針工作液2u1;(6)加入2.5ul5mg/ml的EDC工作液，25。C孵育30min;重復該步驟一次；(7)加入0.2ml洗滌液，渦旋使之充分混勻，》10，000rpm離心25rain，棄去上清液；重復該步驟一次；(8)加入500ulTE溶液，渦旋使之充分混勻；(9)》10,OOOrpm離心25min，棄去上清液；(10)加入17iUTE溶液，渦旋使之充分混勻，微球濃度應約為5XK)3個/y丄；(11)取2ul，用水稀釋50倍，計數，儲存于2-8'C。根據現有的研究，PIK3CA基因突變主要集中在外顯子9(螺旋結構域)和外顯子20(催化結構域)上，特別的，氨基酸位點E542、E545和H1047被稱為PIK3CA突變的熱點(Hot-印ot)，約占所有PIK3CA點突變的80M。為此，本發明選擇突變率最高的E542、E545和H1047的突變情況進行檢測。本發明的主要優點在于-(1)采用本發明提供的PIK3CA基因突變檢測液相芯片，可同時對PIK3CA基因突變相對頻率較高的位點進行檢測，也可以各自單獨進行檢測，檢測時的反應條件均一，檢測步驟簡單，在檢測時效性上遠遠優于常用的直接測序技術，同時，多位點的并行檢測實現了檢測的高通量。(2)本發明采用酶切富集的方法進行目標序列的PCR擴增進而用于檢測，避免了產物中大量野生型序列對檢測結果所造成的干擾，從而極大的提高了檢測的靈敏度，是現有檢測技術所無法比擬的。(3)本發明實現了酶切富集技術和液相芯片技術的有效結合，避免了實時熒光定量PCR存在的假陽性率高的問題，大大的提高了檢測的特異性和準確率。具體實施例方式溶液配方'偶聯液(pH4.5):0.lmol/LMES(SigmaM-2933)洗滌液0.2ml/LTween-20(SigmaP-9416),lg/LSDS(SigmaL-4390)TE(pH8.0)(儲存液)10ramol/LTris(Sigma337501)，lmmol/LEDTA(SigmaE—5134)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>過濾后貯存于4°C。實施例1PIK3CA基因突變檢測的液相芯片的制備一、探針序列設計及微球包被針對PIK3CA基因外顯子9、20的野生型與突變型序列，設計特異的寡核苷酸探針。探針的5'端為一個氨基基團，接著是一個IO個T的間隔臂。探針由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。探針分別與不同顏色編碼的微球(購自Luminex公司)通過共價結合偶聯在一起(包被過程)。每種微球包被的具體步驟如下(1)取微球母液(購自Luminex公司)于渦旋儀上震蕩成微球懸液；(2)取出8ul微球母液，共含0.8X105—1.2X1()5個微球至0.5ml離心管中；(3)10，000rpm離心2min，棄去上清液；(4)加入10ul偶聯液(pH4.5),渦旋使之充分混勻；(5)加入2pmol/ul探針工作液2ul;(6)加入2.5ul濃度為5mg/ml的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亞胺鹽酸鹽)工作液，25'C孵育30min;重復該步驟一次；(7)加入0.2ml洗滌液，渦旋使之充分混勻，10，000rpm離心2min，棄去上清液；重復該步驟一次；(8)加入500ulTE溶液，渦旋使之充分混勻；(9)10，OOOrpm離心2min，棄去上清液；(10)加入20ulTE溶液，儲存于2-8。C。探針序列如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。PE9-AS2與PE20-AS2的5'端分別加上生物素標記。其中，PE9-S1與用PE9-AS1于外顯子9的第一輪PCR擴增，PE9-S1與生物素標記的PE9-AS2用于外顯子9的第二輪PCR擴增；PE20-S1與PE20-AS1用于外顯子20的第一輪PCR擴增，PE20-S1與生物素標記的PE20-AS2用于外顯子20的第二輪PCR擴增。制備得到的PIK3CA基因突變檢測液相芯片包括有包被有SEQIDNO.1的、針對E542的野生型氨基修飾探針的微球、包被有SEQIDNO.2的、針對E542K點突變的氨基修飾探針的微球、包被有SEQIDNO.3的針對E545的野生型氨基修飾探針的微球、包被有SEQIDN0.4的針對E545K點突變的氨基修飾探針的微球、包被有SEQIDNO.5的針對E545D點突變的氨基修飾探針的微球、包被有SEQIDNO.6的、針對E1047的野生型氨基修飾探針的微球、和包被有SEQIDN0.7的、針對E1047R點突變的氨基修飾探針的微球，上述每種探針的堿基序列與氨基之間連接有間隔臂，且每種微球具有不同顏色編碼；以及SEQIDNO.8—10和SEQIDNO.11—13的引物序列,其中SEQIDNO.10與SEQIDNO.13堿基序列的5'端分別加上生物素標記。實施例2運用實施例1中的PIK3CA基因突變檢測液相芯片對乳腺癌組織樣本進行檢測一、待測樣本的準備乳腺癌組織樣本中DNA的提取取乳腺癌術后的組織標本5-50mg，研磨后，用pH7.4的PBS溶液洗滌2次；洗滌后的組織標本重懸于1ml的消化液(50mmol/LTris，l鵬o/LNa2EDTA，0.5%Tween-20,200ug/ml的蛋白酶K200，pH8.5)，55。C水浴消化1小時，99。C水浴15min滅活蛋白酶K;12000轉/分鐘離心10分鐘；取上清，通過酚-氯仿-異戊醇法抽提，乙醇沉淀法獲得用于PCR反應的DNA樣品。也可通過微量離心柱法提取DNA;二、待測樣品的PCR擴增與酶切富集(1)樣本DNA的PCR擴增與酶切富集外顯子9上E542、E545突變型的酶切富集PCR擴增如下1.第一輪PC財廣增PCR反應體系10XTureStartDNApolymeraseBuffer2.5pl2.5mMdNTP混合液2|_UPE9-AS10.5^1(2(Vmol/L)PE9-S10.5fU(20(amol/L)TureStartT叫脆polymerase0.5]ul(2U/jal)模板DNAlpl加入滅菌雙蒸水至25plPCR反應條件:步驟預變性變性退火延伸溫度95°C95°C58°C72°C時間5min30sec30sec45sec循環次數12010min2.PCR產物酶切E542酶切的反應體系如下10XNEBBuffer4PCR產物Hpyl88I加入滅菌雙蒸水至37。C溫育2小時，65'C20分鐘滅活酶cE545酶切的反應體系如下10XNEBBuffer4PCR產物TspRI100XBSA加入滅菌雙蒸水至0.5|al(lOU/pl)I3^10.5pl(10U/|al)0.lul165"溫育2小時<3.第二輪PCR擴增PCR反應體系lOXTureStartDNApolymeraseBuffer2.5pl2.5mMdNTP混合液2plPE9_Sl0.5(^1(20nmol/L)Biotin-PE9-As2TureStartTaqDNApolymerase0.5)^1(20,1/L)0.5nl(2,)酶切產物1(^1加入滅菌雙蒸水至PCR反應條件:步驟預變性變性退火延伸最后延伸溫度95°C95°C59°C72°C72°C時間5min30sec30sec45sec10min外顯子20上E1047突變型的酶切富集PCR擴增如下1.第一輪PCR擴增PCR反應體系10XT匿Start腿polymeraseBuffer2.5)^1循環次數302.5mMdNTP混合液PE20-SIPE20-AslTureStartTaq■polymerase152^10.25pl(20|amol/L)0.25^1(20)_unol/L)0.5)ul(2U/)al)模板DNA加入滅菌雙蒸水至PCR反應條件:步驟預變性變性退火延伸最后延伸2.PCR產物BsaBI酶切:反應體系如下:溫度95。C95°C53°C72。C72°C10XNEBBuffer2PCR產物BsaBI加無酶水至25(il時間5min30sec30sec45sec10min循環次數120lul0.5^1(lOU/fxl)160。C溫育2小時，80°C20分鐘滅活酶c3.第二輪PCR擴增PCR反應體系:10XTureStartDNApolymeraseBuffer2.5|lU2.5mMdNTP混合液Biotin-PE20-As20.5(^1(20pmol/L)PE20-SI0.5^1(20,1/UTureStartTaqDNApolymerase0.5(jl(2U/(il)酶切產物1^1加入滅菌雙蒸水至25|tdPCR反應條件步驟溫度時間循環次數預變性95°C5min1變性95°C30sec退火53°C30sec30延伸72°C45sec最后延伸72°C10min1三、雜交與上機檢測(1)將包被有探針E542P、E542K-P、E545-P,E545K-P,E545D-P,E1047-P，E1047R-P，陰性對照探針(N-P)的微球分別渦旋混勻；(2)用1.5XTm雜交液配制含有包被有探針的混合微球工作液，使溶液中每種微球濃度為75個/ul;(3)將混合微球工作液渦旋混勻；(4)每孔加入對應的33ul混合微球工作液，使反應體系中最終含有每種微球各約20002500個;(5)背景孔加入17ulTE(pH8.0);其他每孔分別加入每個樣本的第二輪PCR產物各2-17ul，補加TE至17ul;輕輕混勻；蓋上反應板(管蓋)防止蒸發；(6)設置PCR儀程序95°C5min;60。C雜交孵育15min;(7)用lXTm雜交液配制SA-PE至10ug/ml(25ul/孔)；(8)每孔加入25ulSA-PE(鏈親和素藻紅蛋白)工作液；(9)馬上置于雜交溫度(6CTC)，孵育5min;(10)將Luminex儀器設置到雜交溫度，讀數。四、檢測結果與數據分析反應后產物通過Luminex系列分析儀器檢測，檢測結果如表1所示。在此之前，我們首先采用野生型DNA(非特異性)的樣本進行檢測，記錄每次檢測熒光值，取突變型(特異性)探針微球上的熒光值的平均值加上5倍標準差(Mean+5*SD)作為每個突變檢測的cut-off值。根據這一方法確定的E542K-P、E545K-P、E545D-P和E1047R-P探針的cutoff值均接近100，因此，將本PIK3CA基因突變檢測液相芯片各探針的cutoff值確定為100。根據這一判定標準，本實施例所檢測的10份樣本中，5例存在點突變，其中2號樣本突變型為E542K，3號樣本為突變型E545D，5號、8號樣本突變型為E1047R，9號樣本突變型為E542K。同時，我們將檢測樣本進行測序法檢測(見表2)，其中2號樣本測序法難以判別是否存在突變(測序出現雜峰，我們從液相芯片檢測結果也可以看到，探針E545-P也有一定的響應值，MFI值為787，而探針E545K-P檢測值為209,說明該樣本中存在異質性且突變型DNA比例較低)，其余9個樣本測序情況均與本實施例中檢測判定的結果一致，符合率達到100%，即使加上測序無法判別的樣本，符合率也達到90%。而本實驗也充分說明，本發明所提供的PIK3CA基因突變檢測液相芯片及檢測方法不僅可以同時檢測突變類型，而且具有很高的檢測準確率和特異性，其檢測的靈敏度明顯優于測序法的檢測(2號樣本測序法無法判讀)。表1樣本的檢測結果樣<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實施例3、PIK3CA基因突變檢測液相芯片檢測靈敏度實驗為了檢測本液相芯片的檢測靈敏度，設計在PIK3CA野生型DNA中檢測突變型DNA的能力，即考察本液相芯片系統所能檢測的突變型DNA的最低比例。本實驗各組樣本中野生型DNA、突變型DNA的拷貝數如表2所示。每組實驗都進行重復實驗。本實施例中樣本的第一輪PCR、酶切反應、第二輪PCR反應以及luminex檢測與實施例2所述步驟相同。表3PIK3CA基因突變檢測液相芯片靈敏度檢測結果<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>檢測的結果表2所示(檢測熒光值MFI值大于100即判定為陽性，為有效檢出。)檢測的結果表明采用本發明的PIK3CA基因突變檢測液相芯片，將酶切富集技術和液相芯片技術有效結合，可以在5000拷貝的野生型DNA中檢出5個拷貝數的突變型DNA，檢測靈敏度至少為0.1%'同時，采用本發明的檢測方法，可以最低檢測出5個拷貝的突變型DNA。序列表〈110〉廣州益善生物技術有限公司〈120〉PIK3CA基因突變位點的檢測探針、液相芯片及其檢測方法〈160〉14〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉22212〉DNA〈213〉人工序列<400〉1tacacgagatcctctctctgaa22〈210〉2〈211〉22〈212〉DNA<213〉人工序列<400>2tacacgagatcctctctctaaa22<210〉3<211〉21<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉3tcactgagcaggagaaagatt〈210〉4〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉4tcactaagcaggagaaagatt〈210〉5〈211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列tcacttagcaggagaaagatt<210〉6〈211〉20〈212〉DNA<213〉人工序列〈400〉6gatgcacatcatggtggctg〈210>7<211〉20〈212〉■〈213〉人工序列<400〉7gatgcacgtcatggtggctg20〈210〉8〈211〉24<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉'8ggaactttaccacactgctgaacc〈210〉9<211>22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉9gcaggagaaagattttctatgg〈210〉10<211〉21〈212〉腿24〈213〉人工序列〈400〉10cttctcgggatacagaccaat〈210〉11〈211〉19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉11ccttgtaacacatctcctg〈210〉12〈211〉23〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉12ggatcttccacacaattaaacag23〈210〉13〈211〉19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉13attgtagttctggcattcc25〈210>14〈211〉20〈212〉腿<213〉人工序列〈棚〉14cgttaggtcggagcttgatc權利要求1.用于PIK3CA基因突變檢測的探針，其特征在于，包括有針對E542的野生型的SEQIDNO.1探針和針對E542K點突變的SEQIDNO.2探針；和/或針對E545野生型的SEQIDNO.3探針、針對E545K點突變的SEQIDNO.4探針和針對E545D點突變的SEQIDNO.5探針；和/或針對E1047的野生型SEQIDNO.6探針、針對E1047R點突變的SEQIDNO.7探針。2.—種PIK3CA基因突變檢測的液相芯片，其特征在于，主要包括有包被有SEQIDNO.1的針對E542的野生型氨基修飾探針的微球，和包被有SEQIDNO.2的針對E542K點突變的氨基修飾探針的微球；和/或包被有SEQIDNO.3的針對E545的野生型氨基修飾探針的微球、包被有SEQIDN0.4的針對E545K點突變的氨基修飾探針的微球、以及包被有SEQIDNO.5的針對E545D點突變的氨基修飾探針的微球；和/或包被有SEQIDNO.6的針對E1047的野生型氨基修飾探針的微球，和包被有SEQIDNO.7的、針對E1047R點突變的氨基修飾探針的微球；上述每種探針的堿基序列與氨基之間連接有間隔臂，上述每種微球具有不同顏色編碼；以及用于擴增出具有PIK3CA的9外顯子和/或20外顯子突變位點的目標序列的引物，且該目標序列的末端具有生物素標記。3.根據權利要求2所述的用于PIK3CA基因突變檢測的液相芯片，其特征在于所述間隔臂為5—30個T。4.根據權利要求2所述的用于PIK3CA基因突變檢測的液相芯片，其特征在于用于擴增出具有9外顯子突變位點的目標序列的引物包括有SEQIDN0.8SEQIDNO.10引物序列，所述引物中至少有一條帶有末端的生物素標記；和/或用于擴增出具有20外顯子突變位點的目標序列的SEQIDNO.11SEQIDNO.13引物，所述引物中至少有一條帶有末端的生物素標記。5.—種PIK3CA基因突變的檢測方法，其特征在于使用權利要求2所述的PIK3CA基因突變檢測的液相芯片，包括以下步驟1〉提取待檢測樣本中的DNA，以用于擴增出具有9外顯子和/或20外顯子突變位點的目標序列的引物進行第一輪PCR擴增；2)酶切富集第一輪PCR擴增產物；3)以酶切產物為模板進行第二輪PCR擴增；4)第二輪PCR擴增產物與對應的權利要求2中所述包被有探針的微球進行雜交；5)雜交反應后加入鏈霉親和素-藻紅蛋白進行反應，然后檢測信號。6.根據權利要求5所述的PIK3CA基因突變的檢測方法，其特征在于步驟1)第一輪PCR擴增用的引物對的堿基序列為SEQIDNO.8、SEQIDNO.9和/或SEQIDNO.11、SEQIDNO.12;步驟3)第二輪PCR擴增用的引物對的堿基序列為SEQIDNO.9、SEQIDNO.10和/或SEQIDNO.12、SEQIDNO.13。7.根據權利要求5所述的PIK3CA基因突變的檢測方法，其特征在于步驟4)所述雜交溫度為55—60。C。8.根據權利要求5所述的PIK3CA基因突變的檢測方法，其特征在于每種所述包被有探針的微球的制備方法包括步驟如下(1)取微球母液充分混勻成微球懸液；(2)取出8y1微球母液，共含0.8Xl()5—1.2X105個微球至0.5ml離心管中；(3)》10,OOOrpm離心25min，棄去上清液；(4)加入10ul偶聯液，渦旋使之充分混勻；(5)加入2pmol/y1探針工作液2y1;(6)加入2.5y15mg/ml的EDC工作液，25。C孵育30min;重復該步驟一次；(7)加入0.2ml洗滌液，渦旋使之充分混勻，^10,000rpra離心25min，棄去上清液；重復該步驟一次；(8)加入500u1TE溶液，渦旋使之充分混勻；(9)^10，000rpm離心25min，棄去上清液；(10)加入17p1TE溶液，渦旋使之充分混勻，微球濃度應約為5乂103個/"1;(11)取2yl，用水稀釋50倍，計數，儲存于2-8'C。全文摘要本發明公開了一種PIK3CA基因突變位點的檢測探針、液相芯片及其檢測方法，該PIK3CA基因突變檢測液相芯片主要包括有包被探針的微球；用于擴增出具有9外顯子和/或20外顯子的目標序列的引物。采用本發明提供的PIK3CA基因突變檢測液相芯片和檢測方法，可同時對PIK3CA基因突變相對頻率較高的位點進行檢測，可以對9外顯子和20外顯子各單獨進行檢測，也可以兩者同時檢測，檢測時的反應條件均一，檢測結果特異性好，靈敏度高，檢測準確度達90％以上，檢測所需時間短。文檔編號C12Q1/68GK101445832SQ20081022026公開日2009年6月3日申請日期2008年12月23日優先權日2008年12月23日發明者許嘉森,郭元杰申請人:廣州益善生物技術有限公司