專利名稱：一種提高淀粉液化芽孢桿菌fengycin產量的啟動子置換方法
技術領域：
本發明涉及一種提高淀粉液化芽孢桿菌fengycin產量的啟動子置換方法，是利用啟動 子置換技術提高淀粉液化芽孢桿菌的脂肽類抗生素fengycin產量方法，屬于生物技術領 域。
二背景技術：
文摘1968年Arima(Biochemical and Biophysical Research Communication, 1968,31: 488-496.)等首次發現枯草芽孢桿菌(漢s^"h's)能夠產生抗菌脂肽surfactin以來，抗 菌脂肽產生菌的篩選主要集中在枯草芽孢桿菌的不同菌株之間(中國農業科 學，2003,(12):1496-1501.微生物學報，2003 , 43 (5) : 647 - 652.)。近年來，進一步的研究表 明，除枯草芽孢桿菌外，淀粉液化芽孢桿菌(漢a/sj^oh》"e/acie/7s) ( Phytichemistry, 2002, 61 : 693-698.)、短小芽孢桿菌汲 p固D ( Journal of Fermentation and Bioengineering, 1992， 74: 255-216)等也能產生抗菌脂肽。
抗菌脂肽一般是革蘭氏陽性芽孢桿菌產生的代謝產物。抗菌脂肽的分子是由親水的 肽鍵和親油的脂肪烴鏈兩部分組成，由于其特殊的化學組成和兩親型分子結構，文摘
抗菌脂肽除了具有抗菌活性之外還具有生物表面活性劑的特性(Molecular Microbiology,2005, 56:845-857.精細化工，2006，(2 ):121-125.)，在醫藥(Applied Microbiology and Biotechnology, 1999,51(5): 553-563. The Journal of Antibiotics, 1986， 39:755-761 )、農業(Phytichemistry, 2002, 61: 693-698)、食品及化妝品(食品工業科 技，2006， 4:91-93.]、石油開采(微生物學雜志，2005， 2:4-8農業生物技術學 報，2004， (3) :330-333.)和環境治理(Journal of hazardous materials, 2001,85(1-2): 111-125)
等領域有重要的應用前景，已引起廣泛的關注。
其中fengycin等抗菌脂肽具有強烈的抗絲狀霉菌作用，已有許多用來抑制植物病原 菌的研究實例。因此，fengycin在植物病害生物防治方面具有重要的應用前景。對農業生 產具有重要的意義。
但是，通常的菌株一般抗菌肽產量很低，迄今為止，脂肽產生菌的產量一般低于1.0g/L， 少的甚至在O.lg/L以下，因此，需要對生產菌株進行誘變，在這方面已有少量嘗試，并 取得了良好效果(Journal of Natural Products, 2002,63: 1492-1496)。此外，隨著對抗菌脂肽的合 成機理的認識和合成酶基因的定位、克隆和表達的成功，人們開始采用基因工程的手段 構建基因工程菌株用于抗菌脂肽的生產(中國農業科學,2003,(12):1496-1501)。
同源整合技術就是通過同源重組將外源基因定點整合入靶細胞基因組上某一確定的 位點,以達到定點修飾改造染色體上某一基因為目的的一項技術。它克服了隨機整合的盲 目性和危險性,是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質的方法。這項術的誕生可以說是分子生物學技術上繼轉基因技術后的又一革命。尤其是條件性、可誘導性基因同源整合系 統的建立,使得對基因靶位點在時間和空間上的調控更加精確。文摘(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Aug. 2005， p. 45774584. J. Bacteriol. 183:6265~6273.)。目前已有通過同
源整合技術使強啟動子來置換抗菌肽合成酶操縱子的啟動子，并提高了該抗菌肽的產量。 三
發明內容
技術問題
本發明的目的是通過分子生物方法提高fengycin合成酶基因簇的表達，獲得fengycin 產量提高的淀粉液化芽孢桿菌置換菌株。 技術方案
一種提高淀粉液化芽孢桿菌fengycin產量的啟動子置換方法，是將野生型淀粉液化 芽孢桿菌ES-2的fengycin合成酶基因的啟動子Ppps置換為啟動子P59的方法。其特征 在于，
1)啟動子P59序列的克隆
設計啟動子Pm的引物
上游引物5 ， - ctttattgttttgccatt -3'
下游弓I物5 ， - ggataagaaagtgaaataacaaactgtcaaataaagta -3 ， 采用上述引物并以質粒pHB201做為模板，擴增獲得一個長376bp的Ps9啟動子序列；
2) fengycin合成酶基因同源片段及新霉素抗性基因的克隆 設計淀粉液化芽孢桿菌fengycin合成酶基因5'端的DNA片段引物序列， 上游引物5 ， - tactttatttgaagtttgttatttcactttcttatcc國3 ，
下游引物5 ， - ccaaacttcttgtctg -3 ，
以淀粉液化芽孢桿菌ES-2基因組DNA為模板，擴增獲得一個長450bp的fengycin 合成酶基因同源片段SEQIDNO.l，即淀粉液化芽孢桿菌fengycin合成酶基因5'端部分 片段；
設計新霉素抗性基因的引物， 上游弓I物5 ， - ccggaattcgcgaccttccactcaccggtt -3 ， 下游弓I物5 ， - ccggaattccggggcaatgaaattagactat -3, 從質粒pMK3擴增得到新霉素抗性基因片段U53bp;
3) 同源整合載體的構建
將PCR產物分別純化后，通過SOE PCR的方法將啟動子P59DNA片段和fengycin合 成酶基因同源片段連接到一起，ddH20重溶，與pMD19-T載體連接，得到質粒載體 pMD19-Tl，然后在質粒載體pMD19-Tl的EcoRl位點加上新霉素抗性基因，得到質粒 載體pMD19-T2，將pMD19-T2轉化大腸桿菌TOP10F'，獲得同源整合載體轉化的大腸 桿菌TOPI OF';
4) 同源整合載體轉化淀粉液化芽孢桿菌野生菌株ES-2
將同源整合載體轉化的大腸桿菌TOP10F'，提取同源整合載體質粒，轉化感受態淀粉液化芽孢桿菌野生菌株ES-2，獲得同源整合載體轉化的淀粉液化芽孢桿菌ES-2菌株， 即啟動子P59置換的菌株。
上述方法得到的置換菌株，其同源片段序列為SEQ IDNO 1，啟動子P59序列為SEQ ID NO 2。
上述置換菌株的鑒定方法，其特征在于 設計引物
上游引物5 ， - ctttattgttttgccatt -3; 下游引物5，-ccaaacttcttcgtctg-3，
以啟動子P59置換的菌株基因組DNA為模板，在100pl體系中，引物終濃度各為 lnM，dNTPs終濃度為0.2mM，淀粉液化芽孢桿菌基因組DNA10ng，4U pfu DNA聚合酶。 擴增程序為94。C 2min;30個循環94°C 50s,53。C 50s,72。C 90s; 72°C 10min;
如果擴增得到大小約826的DNA片段，即是啟動子P59片段和淀粉液化芽孢桿菌 ES-2 fengycin合成酶基因5'端部分DNA片段連接到一起，并整合到野生淀粉液化芽孢 桿菌ES-2的基因組DNA中的DNA片段，即為啟動子Ps9置換的菌株。
有益效果
迄今為止，人們已經采用同源整合技術已經采用強啟動子repU置換了 iturin和 mycosubtilin的啟動子，并最終獲得該抗菌肽產量提高的菌株。本發明人通過同源整合技 術獲得的啟動子Ps9置換fengycin合成酶原來啟動子的淀粉液化芽孢桿菌菌株，在國際中 首次報道通過同源整合技術獲得fengycin產量提高的菌株。
本發明人通過PCR技術從淀粉液化芽孢桿菌菌株ES-2基因組中擴增得到fengycin 合成酶基因的長約450bp的同源片段，并將該片段通過SOEPCR方法和啟動子P59連接， 并將連接到一起的片段克隆到質粒pMD19-T上，得到質粒pMD19-Tl， 最后在質粒 pMD19-Tl的EcoR I酶切位點連接上新霉素抗性基因做為篩選標記，從而構建了一個同 源整合載體pMD19-T2獲得了強啟動子置換的菌株。通過牛津杯法和高效液相技術檢測 fengycin產量提高的菌株。
利用本發明獲得fengycin產量提高菌株的方法，具有直接的目的性，可以直接從遺 傳上改良抗菌肽生產菌株，在農業和工業上都具潛在的應用價值。同時對ES-2野生菌和 啟動子置換菌株發酵并提取抗菌物質，并通過高效液相色譜檢測fengycin的產量，最終 獲得產fengycin的啟動子置換菌株的fengycin產量為5704.77±258.89 mg/L，而野生菌的 fengycin產量為3455.05±113.84 mg/L，提高了 fengycin產量約0.65倍。(該實驗已經重 復三次，數據都有標準差的，該菌株fengycin產量在國際報道中產量已經比較高了，由 于細菌本身生理條件的限制很難有大幅度的提高)。 四

圖1同源整合載體構建示意圖
圖2啟動子P59置換fengycin合成酶基因原來啟動子的原理圖
(P59:啟動子P59， fen':從淀粉液化芽孢桿菌ES-2中擴增并通過SOE PCR和啟動子連接到一起的DNA片段，并克隆到質粒pMD19-T上的450bp的DNA片段，Ppps: fengycin 合成酶基因原來的啟動子，fen:基因組中fen，的同源序列，neo+:新霉素抗性基因) 五具體實施例方式
本發明的實現是通過克隆淀粉液化芽孢桿菌ES-2基因組DNA的fengycin的一個合 成酶基因fenA的5，端450bp的同源片段(含啟動子Ppps)，并將該片段通過SOE PCR方 法和啟動子P59連接，并將連接到一起的片段克隆到質粒pMD19-T上，得到質粒 pMD19-Tl，最后在質粒pMD19-Tl的EcoR I酶切位點連接上新霉素抗性基因做為篩選 標記，從而構建了一個同源整合載體pMD19-T2。并將該同源整合載體轉化入淀粉液化 芽孢桿菌ES-2中，獲得了強啟動子置換的菌株。通過牛津杯法和高效液相技術檢測 fengycin鑒定產量提高的置換菌株。
(一) 啟動子P59序列的克隆
通過PCR方法從質粒pHB201上擴增得到組成型啟動子P59(Bron S, et al. Protein secretion and possible roles for multiple signal peptidases for precursor processing in bacilli. J Biotechnol 1998, 64:3-13.)，該啟動子能夠在枯草等革蘭氏陽性菌中啟動一些基因高效表 達，在啟動子P59的下游連接上fengycin基因合成酶的部分DNA片段作為同源片段，載 體上的同源片段和淀粉液化芽孢桿菌基因組上相應DNA片段發生單交換，使同源片段以 及下游的基因處于啟動子P59的控制之下，從而可以得到啟動子置換菌株。
參考Bacillus Genetic Stock Center(http:〃bacillus.biosci.ohio-state.edu/)中pHB201的序 列，利用primer primier 5. 0軟件自行設計擴增啟動子P59的引物 上游引物5 ， - ctttattgttttgccatt陽3'
下'游弓I #勿5 ， - ggataagaaagtgaaataacaaactgtcaaataaagta -3 ， 采用上述引物并以質粒pHB201做為模板，通過下述方法擴增得到啟動子P59序列。 在lOOpl體系中，引物終濃度各為lpM,dNTPs終濃度為0.2mM,質粒 pHB201DNA10ng，4U pfo DNA聚合酶。擴增程序為94°C 2min;30 X (94°C 50s，53。C 50s,72。C 1: 30min);72。C 10min。瓊脂糖凝膠電泳，切膠，采用上海生工試劑盒回收，將 回收的PCR產物與TaKaRa公司pMD19-T vector連接，轉化￡ co// DH5a，涂于含有 IPTG、 X-gal、氨芐青霉素的LB平板，37°C培養13-14小時，挑白色菌落，振蕩培養， 提取質粒，確定連接成功后送到金斯特公司測序。用計算機分析測序結果，獲得一個長 376bp的P59啟動子序列。
(二) fengycin合成酶基因同源片段及新霉素抗性基因的克隆 將淀粉液化芽孢桿菌ES-2(中國農業科學，2006,(11): 2327-2334)培養液離心收集
菌體，用上海生物工程公司基因組DNA試劑盒提取基因組DNA。
參考Genbank中淀粉液化芽孢桿菌FZB42的fengycin基因序列(登陸號AJ576102), 利用primer primier 5.0軟件自行設計淀粉液化芽孢桿菌fengycin合成酶基因5'端的DNA 片段(即同源片段)引物，
上、游引物5 ， - tactttatttgaagtttgttatttcactttcttatcc -3'下游引物5，- ccaaacttcttgtctg -3 ，
由上海生工合成。
在lOOpl體系中，引物終濃度各為lnM，dNTPs終濃度為0.2mM,淀粉液化芽孢桿菌 ES-2基因組DNA10ng，4U pfu DNA聚合酶。擴增程序為94°C 2min;30X(94。C 50s，53。C 50s,72。Cl: 30min);72°C 10min。瓊脂糖凝膠電泳，切膠，采用上海生工試劑盒回收，將 回收的PCR產物與TaKaRa公司pMD19-T vector連接，轉化co// DH5a，涂于含有 IPTG、 X-gal、氨芐青霉素的LB平板，37°C培養13-14小時，挑白色菌落，振蕩培養， 提取質粒，確定連接成功后送到金斯特公司測序。用計算機分析測序結果，獲得一個長 450bp的fengycin合成酶基因同源片段SEQ ID NO.l ，即淀粉液化芽孢桿菌fengycin合成 酶基因5'端部分片段。
參考Genbank中質粒pMK3上新霉素基因的序列(EU549779)，利用primer primier 5.0 軟件自行設計新霉素抗性基因的引物，
上游弓I物5, - ccggaattctgcaatgtggaattgggaac -3 ，
下游弓I物5 ， - ccggaattcccttattattaattcaattcgctca -3 ，
在100^1體系中，引物終濃度各為lpM,dNTPs終濃度為0.2mM,質粒 pHB201DNA10ng,4U pfu DNA聚合酶。擴增程序為94°C 2min;30 X (94°C 50s,53。C 50s,72°C 1: 30min);72°C 10min。)從質粒pMK3中擴增得到新霉素抗性基因片段U53bp 作為轉化淀粉液化芽孢桿菌的篩選標記。
(三) 同源整合載體的構建
將PCR產物分別純化后，通過SOE PCR的方法將啟動子P59DNA片段和fengycin合 成酶基因同源片段連接到一起，ddH20重溶，與pMD19-T載體(購自大連寶生物公司) 連接，得到質粒載體pMD19-Tl，然后在質粒載體pMD19-Tl的EcoRl位點加上新霉素 抗性基因，得到質粒載體pMD19-T2，將pMD19-T2轉化大腸桿菌TOP10F，(購自深圳勤 寶升公司),從轉化平板上隨機挑取幾個菌落，接入LB液體培養基，振蕩培養，小量提取 質粒，電泳，以電泳滯后的質粒為模板進行PCR驗證，確定連接成功后送到金斯特公司 測序，獲得同源整合載體轉化的大腸桿菌TOP10F，。
(四) 同源整合載體轉化淀粉液化芽孢桿菌野生菌株ES-2
將同源整合載體轉化的大腸桿菌TOP10F'在37'C培養10-11小時后挑取小菌落,接入 含有氨芐青霉素的50ml LB液體培養基,70-卯rpm 3(TC培養過夜，采用質粒提取試劑盒(購 自上海生工)提取同源整合載體質粒，作為轉化淀粉液化芽孢桿菌ES-2用。淀粉液化芽 孢桿菌電轉化方法如下
1、感受態細胞的準備 過夜培養菌體，稀釋16倍置于生長培養基(LB含有0.5M的山梨醇)，37C培養至 OD600為0.85-0.95，將菌體細胞在冰水中冷凍10分鐘。4°C5000 x G離心5分鐘收集菌 體細胞，在冰冷的電轉化液中洗四次。(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%的甘油)。用培 養量的1/40電轉化液重新懸浮菌體細胞。使細胞濃度達到1-1.3 x 1010cfo/ml;2、轉化
在60uL感受態細胞中加如luL (50ng克/ixL) DNA，轉移到電轉杯中(lmm的電 擊杯)，保溫1-1.5分鐘，加電壓25uF、 200Q。時間4.5-5.0ms。釋放電壓后，立即象轉 化過的細胞中加入lmL恢復培養基(LB含0.5M山梨醇、0.38M甘露醇)。在37'C培養 3h后，置于含有新霉素(5ug/mL)的培養基上篩選。37'C過夜培養,獲得具有新霉素抗性 的菌株，即同源整合載體轉化的淀粉液化芽孢桿菌ES-2菌株，也就是啟動子P59置換的 菌株。
(五) 啟動子置換菌株的鑒定方法
參考Genbank中淀粉液化芽孢桿菌FZB42的fengycin合成酶操縱子基因序列(編號 AJ576102 ) Bacillus Genetic Stock Center(http:/7bacillus.biosci.ohio-state.edu/)中質粒 pHB201上P59的序列)(376bp),利用primer primier 5.0軟件自行設計啟動子P59DNA 序列和淀粉液化芽孢桿菌fengycin合成酶基因部分450bp DNA序列連接到一起的DNA 片段的引物
上游引物5 ， - ctttattgttttgccatt -3;
下游引物5，- ccaaacttcttcgtctg隱3 ， 以啟動子P59置換的菌株基因組DNA為模板，在lOOpl體系中，引物終濃度各為 lpM,dNTPs終濃度為0.2mM，淀粉液化芽孢桿菌基因組DNA10ng,4U pfo DNA聚合酶。 擴增程序為94。C 2min;30X(94。C 50s,53。C 50s,72。C 1: 30min);72。C 10min。
將回收的PCR產物與TaKaRa公司pMD19-T vector連接，轉化co//DH5a，涂于 含有IPTG、 X-gal、氨芐青霉素的LB平板，37°C培養13-14小時，挑白色菌落，振蕩 培養，提取質粒，確定連接成功后送到金斯特公司測序。用計算機分析測序結果，擴增 得到大小約826的DNA片段(SEQIDN0.2)，即啟動子P59片段和淀粉液化芽孢桿菌 ES-2 fengycin合成酶基因5，端部分DNA片段連接到一起，并整合到野生淀粉液化芽孢 桿菌ES-2的基因組DNA中的DNA片段。從而使fengycin合成酶基因置于啟動子P59 的控制之下。
(六) 啟動子置換的菌株ES-2脂肽類抗生素fengycin的發酵和提取
5.1菌株抗菌物質的發酵將種子液以5c/。濃度接種于Landy發酵培養基中，在32°C和 180rpm/min下培養48h，得抗菌物質發酵液。
5.2抗菌提取物的制備發酵液在11.000 g下離心15min除去菌體，用HC1將上清夜調 節pH至2，然后輕微攪動或靜止過夜，離心收集沉淀，再用NaOH中和，加入甲醇抽 提幾次，獲得抗菌提取物。
(七) 啟動子置換菌株ES-2 fengycin產量的提高
按照(六)所述的方法同時對ES-2野生菌和啟動子置換菌株發酵并提取抗菌物質， 并通過高效液相色譜檢測fengycin的產量，最終獲得產fengycin的啟動子置換菌株的 fengycin產量為5704.77±258.89 mg/L，而野生菌的fengycin產量為3455.05 ± 113.84 mg/L，提高了 fengycin產量約0.65倍。序列表
<110>南京農業大學
<120> —種提高液化芽孢桿菌fengycin產量的啟動子置換方法
<130>說明書
<140> 00
<141> 2008-11-18
<160> 8
< 170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 450
<212> DNA
<213> PCR擴增
<220>
<221> fenA基因同源片段 <222> (1)..(450) <223> <400> 1
gtcgaaattt aattgtaatt atttcacttt cttatcctct taaattgaaa tggagggatt 60 ccattgaaga acactgttta ttctttaact cacgcccaaa gaagagtgtg gtttacggag 120 ctgctcgaac cgggcacaag tatctgcaat ctcgcggcat gcgtcaaatt caggggggac 180 atcgattttg acgtactgcg ccatgcttta gatttttcta tctcgcaaaa tgattcgctc 240 aggtttcaac tgacagaagg ggacggatca gaaccccagc tgtatctggc ggggcatcgg 300 ccgatttctc tagagactgt tgattttact catactgatc aggcagagcg ggacgcatgg 360 attgacacgc agacccgtgt tccgttcaag ctgtttcatt cacctctgta tcactttact 420 ctgcttgtca tgtcagacga agaagtttgg 450 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213>人工合成 <400> 2
tactttattt gaagtttgtt atttcacttt cttatcc 37
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 3
ccaaacttct tgtctg 16
<210> 4
<211> 377
<212> DNA
<213> PCR擴增
<220>
<221>啟動子P59序列 <222> (1)..(377) <223> <400> 4
ctttattgtt ttgccatttt aaaaggttca aataaaatat加cataaa attatcagat 60 gttttttaaa aaatgaaata aaagaagaaa aaaatagaaa atacactaac ccaaagaagc 120 gcgtaatatc gagggtttaa gagacaataa gaaaaaaaga ttgaaaaatg acattaaatt 180 cttgacaggg agagataggt ttgatagaat ataatagttg tcgcgagaga cgacgttgaa 240 gcgcgacaag ctagaccatt gaaaactgaa taaagaagaa tgactcatgt gatgtagcaa 300 tacatcaaaa atctgtcaat caataatgaa agacaagcca tcaattcggt gacttaaata 360 ctttatttga aagtttg 377 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213>人工合成 <400> 5ctttattgtt ttgccatt 18
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 6
ggataagaaa gtgaaataac aaactgtcaa ataaagta 38
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 7
ccggaattcg cgaccttcca ctcaccggtt 30
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213>人工合成
<400> 8
ccggaattcc ggggcaatga aattagacta t
權利要求
1、一種提高淀粉液化芽孢桿菌fengycin產量的啟動子置換方法，是將野生型淀粉液化芽孢桿菌ES-2的fengycin合成酶基因的啟動子Ppps置換為啟動子P59的方法。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，1)啟動子P59序列的克隆設計啟動子Ps9的引物上游引物5'- ctttattgttttgccatt -3 ，下游弓l物5，- ggataagaaagtgaaataacaaactgtcaaataaagta -3，采用上述引物并以質粒pHB201做為模板，擴增獲得一個長376bp的Ps9啟動子序列；2) fengycin合成酶基因同源片段及新霉素抗性基因的克隆設計淀粉液化芽孢桿菌fengycin合成酶基因5'端的DNA片段引物序列，上游引物5，- tactttatttgaagtttgttatttcactttettatcc -3'下游引物5'國ccaaacttcttgtctg-3，以淀粉液化芽孢桿菌ES-2基因組DNA為模板，擴增獲得一個長450bp的fengycin合成酶基因同源片段SEQIDNO.l，即淀粉液化芽孢桿菌fengycin合成酶基因5'端部分片段；設計新霉素抗性基因的引物，上游弓i物5 ， - ccggaattcgcgaccttccactcaccggtt -3 ，下游弓I物5 ， - ccggaattccggggcaatgaaattagactat國3 ，從質粒pMK3擴增得到新霉素抗性基因片段1153bp;3) 同源整合載體的構建將PCR產物分別純化后，通過SOE PCR的方法將啟動子P59DNA片段和fengycin合成酶基因同源片段連接到一起，ddH20重溶，與pMD19-T載體連接，得到質粒載體pMD19-Tl，然后在質粒載體pMD19-Tl的EcoRl位點加上新霉素抗性基因，得到質粒載體pMD19-T2，將pMD19-T2轉化大腸桿菌TOP10F'，獲得同源整合載體轉化的大腸桿菌TOP10F;4) 同源整合載體轉化淀粉液化芽孢桿菌野生菌株ES-2將同源整合載體轉化的大腸桿菌TOP10F，提取同源整合載體質粒，轉化感受態淀粉液化芽孢桿菌野生菌株ES-2，獲得同源整合載體轉化的淀粉液化芽孢桿菌ES-2菌株，即啟動子P59置換的菌株。
3、 權利要求1或2所述方法得到的置換菌株。
4、 權利要求3所述置換菌株的同源片段，其序列為SEQIDNOl。
5、 權利要求3所述置換菌株的啟動子P59，其序列為SEQIDN0 2。
6、權利要求3所述置換菌株的鑒定方法，其特征在于設計引物-上游引物5 ，國ctttattgttttgccatt國3;下游弓I物5 ，- ccaaacttcttcgtctg -3 ，以啟動子Ps9置換的菌株基因組DNA為模板，在100^1體系中，引物終濃度各為l[iM,dNTPs終濃度為0.2mM,淀粉液化芽孢桿菌基因組DNA10ng,4U pfu DNA聚合酶。擴增程序為94。C 2min;30個循環94°C 50s,53。C 50s,72。C 90s; 72°C 10min;如果擴增得到大小約826的DNA片段，即是啟動子P59片段和淀粉液化芽孢桿菌ES-2 fengycin合成酶基因5'端部分DNA片段連接到一起，并整合到野生淀粉液化芽孢桿菌ES-2的基因組DNA中的DNA片段，即為啟動子P59置換的菌株。
全文摘要
本發明涉及一種提高淀粉液化芽孢桿菌fengycin產量的啟動子置換方法，屬于生物技術領域。是通過PCR方法從淀粉液化芽孢桿菌ES-2菌株基因組中擴增得到450bp的同源序列，從質粒pHB201上擴增啟動子P₅₉序列，將上述兩個DNA片段連接到一起，并克隆到質粒pMD19-T上，并連接上新霉素抗性基因做為篩選標記，從而構建了一個同源整合載體。將構建好的同源整合載體轉化到野生淀粉液化芽孢桿菌ES-2中，啟動子置換菌株的fengycin產量為5704.77±258.89mg/L，比野生菌的fengycin產量提高了約0.65倍。
文檔編號C12N15/52GK101475944SQ20081024372
公開日2009年7月8日 申請日期2008年12月12日 優先權日2008年12月12日
發明者烏云達來, 別小妹, 盧亞萍, 呂鳳霞, 孫會剛, 林 曹, 煜 王, 陸兆新 申請人:南京農業大學