專利名稱：布氏錐蟲亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種生物技術領域的活性蛋白的制備方法，具體是一種布氏錐蟲亮氨 酰tRNA合成酶活性蛋白的制備方法。
背景技術：
熱帶寄生蟲病是全球危害人類健康的重要疾病之一，它已經影響了世 界范圍內數億人口，造成了大量的死亡，產生了嚴重的社會后果。非洲睡眠病 (Africantrypanosomiasis)，也被稱之為昏睡病，是因為致病性寄生蟲錐蟲入侵中央神經 系統后所引起的昏睡而得名的。到目前為止，已上市的用于治療非洲人類錐蟲病的四種藥 物都存在著一些缺陷，藥物毒性、缺乏胃腸外管理和有保障的供應以及出現的抗藥性等都 是需要解決的問題。近年來，隨著生物化學的大力發展，以及錐蟲基因組序列的陸續破解，為我們尋找 新的藥物作用靶點提供了很好的基礎。最近，氨酰tRNA合成酶(AARS)便成為研究者們開 發該類藥物的重點。通過抑制AARS的活力，可以抑制某些病原菌的蛋白質生物合成而抑制 病原菌的生長，為人類設計新型藥物提供新思路。已上市的莫匹羅星(商品名Bactroban) 就是AARS抑制劑臨床應用的一個重要實例。此外，人類許多疾病的發生與蛋白質生物合成 精確性的失控有關。因此，研究AARS不僅具有重要的生物學意義，而且隨著研究的深入還 可以應用于人類疾病的防治，服務于人類的健康和改善人類生存環境。本發明主要是用基 因工程的方法，構建布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)亮氨酸tRNA合成酶(LeuRS)的重組 質粒，表達純化出布氏錐蟲亮氨酸tRNA合成酶蛋白，可以廣泛的作為藥物作用的靶標，從 而為抗寄生蟲藥物的篩選奠定了基礎。經對現有技術的文獻檢索發現，孟憲芳、施靜、劉曉春等在《中國病理生理雜志》 2005年21卷第12期2407-2409頁發表了題為《人類組氨酰tRNA合成酶類似物的原核表 達及其多克隆抗體的制備》一文，文章中給出了表達純化人類組氨酰tRNA合成酶類似物的 方法，但是該方法對布氏錐蟲亮氨酰tRNA合成酶的表達效率較低。

發明內容
本發明的主要目的在于克服現有技術的不足，提供一種布氏錐蟲亮氨酰tRNA合 成酶活性蛋白的制備方法。本發明所得的亮氨酰tRNA合成酶可以作為藥物篩選的靶標，廣 泛的應用于藥物篩選領域。本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括如下步驟步驟一，設計特異引物，擴增布氏錐蟲全基因組；步驟二，切膠回收，得到布氏錐蟲亮氨酰tRNA合成酶基因；步驟三，將步驟二得到的基因連接到克隆載體中，構建基因克隆質粒；步驟四，將克隆質粒亞克隆進表達載體，鑒定，轉化大腸桿菌，培養轉化的大腸桿 菌單克隆，誘導；
步驟五，純化表達的融合蛋白，得到布氏錐蟲亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白。步驟一中，所述特異性引物為，GGCTGGCATATGTCGACTGTACGAC, TTCGGATCCGCTGCCTTCTTGTC。步驟四中，所述培養具體為，將轉化的大腸桿菌單克隆接種到含氨卞青霉素 100μ g/ml的LB培養基中，37°C過夜培養，之后將培養的菌液按體積分數為1%。的接種量接 種到含氨卞青霉素的LB培養基的培養瓶中，培養至A55tlOD為0. 6-0. 8時停止培養，冰上冷 卻。步驟四中，所述誘導具體為向冷卻后的菌液中加IPTG至其終濃度為0.2mM， 20 °C _25°C 過夜。本發明通過以下步驟得到布氏錐蟲亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白PCR擴增布氏錐 蟲全基因組；得到布氏錐蟲亮氨酰tRNA合成酶基因片段；構建基因克隆質粒；亞克隆進表 達載體，鑒定，轉化大腸桿菌，培養；最后純化表達的融合蛋白。本發明具有如下的有益效果本發明所得的布氏錐蟲亮氨酰tRNA合成酶可以作 為抗錐蟲藥物體外篩選的靶標，廣泛的應用于抗錐蟲藥物篩選與抗錐蟲作用機制研究領 域。本發明中所涉及的菌株大腸桿菌DH5ci已在《汪玲玲，楊輯，黃誠之，王海洪；大 腸桿菌holo-ACP的過表達、分離純化及長鏈脂酰ACP的合成，微生物學報，2008，48 (7) 963-969》文獻中公開。本發明涉及的菌株可通過公開市售的商業渠道取得，如上海天根生 物公司，公司地址上海市漕溪路258弄27號航星商務樓1號樓606室。本發明涉及的大腸桿菌BL21 (DE3)RIPL已在《張美祥，張小梅，范三紅，羅龍海， 閆曉華，郭藹光；擬南芥Alpha-dioxygenase 2原核表達、純化及亞細胞定位預測，農業 生物技術學報，2007，15(5) :816-820》可通過公開示售的商業渠道取得，如可以從美國 stratagene公司購得，菌株編號為B0003。


圖1為LeuRS的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2為重組質粒pET21a_LeuRS的構建圖；圖 3 為重組菌 BL21 (DE3) RIPL-pET2Ia-LeuRS 的 IPTG 誘導表達圖譜；圖4為融合蛋白誘導后經His-Tag親和層析柱純化后的圖譜。
具體實施例方式下面結合具體實施例進一步闡述本發明。應理解為這些實施例僅用于說明本發 明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規 條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊見New York ColdSpring Harbor Laboratory 出版社1989年版中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。步驟一，布氏錐蟲亮氨酰tRNA合成酶基因的獲得(1)取布氏錐蟲的基因組cDNA 20 μ g作為模板，擴增用的引物為是PAGE純化的上 下游兩條引物，其中，引物 1 序列GGCTGGCATATGTCGACTGTACGAC ；
引物 2 序列TTCGGATCCGCTGCCTTCTTGTC。用KODdash(TOYOBO)聚合酶進行PCR反應，聚合酶鏈式反應時先分別將反應液 a (組份見表1)和反應液b (組份見表2)混勻。表 權利要求
一種布氏錐蟲亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，設計特異引物，擴增布氏錐蟲全基因組；步驟二，切膠回收，得到布氏錐蟲亮氨酰tRNA合成酶基因；步驟三，將步驟二得到的基因連接到克隆載體中，構建基因克隆質粒；步驟四，將克隆質粒亞克隆進表達載體，鑒定，轉化大腸桿菌，培養轉化的大腸桿菌單克隆，誘導；步驟五，純化表達的融合蛋白，得到布氏錐蟲亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白。
2.根據權利要求1所述的布氏錐蟲亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白的制備方法，其特征 是，步驟一中，所述特異性引物為，GGCTGGCATATGTCGACTGTACGAC，TTCGGATCCGCTGCCTTCTTGTC。
3.根據權利要求1所述的布氏錐蟲亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白的制備方法，其特征 是，步驟四中，所述培養具體為，將轉化的大腸桿菌單克隆接種到含氨卞青霉素100 μ g/ml 的LB培養基中，37°C過夜培養，之后將培養的菌液按體積分數為1%。的接種量接種到含氨 卞青霉素的LB培養基的培養瓶中，培養至A55tlOD為0. 6-0. 8時停止培養，冰上冷卻。
4.根據權利要求1所述的布氏錐蟲亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白的制備方法，其特征 是，步驟四中，所述誘導具體為向冷卻后的菌液中加IPTG至其終濃度為0. 2mM,20°C -25°C 過夜。
全文摘要
一種生物技術領域的布氏錐蟲亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白的制備方法，步驟包括設計特異引物，擴增布氏錐蟲全基因組；切膠回收，得到布氏錐蟲亮氨酰tRNA合成酶基因；將步驟二得到的基因連接到克隆載體中，構建基因克隆質粒；將克隆質粒亞克隆進表達載體，鑒定，轉化大腸桿菌，培養轉化的大腸桿菌單克隆，誘導；純化表達的融合蛋白，得到布氏錐蟲亮氨酰tRNA合成酶活性蛋白。本發明所得的亮氨酰tRNA合成酶可以作為藥物篩選的靶標，廣泛的應用于藥物篩選領域。
文檔編號C12R1/19GK101935638SQ20091004824
公開日2011年1月5日 申請日期2009年3月26日 優先權日2009年3月26日
發明者周虎臣, 姚瓔, 李大偉 申請人:上海交通大學