專利名稱：利用pts基因和RNA干擾ads基因提高青蒿廣藿香醇含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域的提高青蒿廣藿香醇含量的方法，具體是一種利用 (patchoulol synthase,廣藿香醇合成酶)基因和RNA干擾aofe(Amorpha-4, ll-diene synthase,紫穗槐二烯合成酶)基因提高青蒿廣藿香醇含量的方法。
技術(shù)背景青蒿(Artemisia annua L )是菊科蒿屬的一年生草本植物。青蒿素是從青蒿地上 部分分離出的一種含有過氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯化合物，是目前世界上公認(rèn)的治療瘧疾 最有效的藥物，尤其對于腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾具有更好的效果。ads是青蒿素合成途 徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，是青蒿素代謝工程的重要耙點(diǎn)。采用基因工程手段，用反義RNA的 方法抑制a血基因，將使得植株不產(chǎn)青蒿素或少產(chǎn)青蒿素，并且將代謝流分流到其他萜 類等次生代謝產(chǎn)物的合成上，從而得到產(chǎn)生其他次生代謝產(chǎn)物的青蒿植株。廣藿香醇，英文名Patchouli Alcohol;俗稱百秋李醇；分子量222;分子式C15H260;熔點(diǎn)55°C-59°C;溶解度不溶于水，易溶于乙醇、丙酮、石油醚等有機(jī)溶劑。廣藿香醇是從廣藿香中提取出來的一種具有特殊芳香氣味的天然單體化合物，用于香精 或香水行業(yè)，是法國標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)確定的香精香料中的標(biāo)志性成分，可用于治療真菌性 皮膚病，還可用于其它化合物合成的基礎(chǔ)原料，提高廣藿香醇具有重大的商業(yè)價(jià)值和廣闊的市場前景。Pts是廣藿香中廣藿香醇合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，是廣藿香醇代謝工程的重要靶點(diǎn)。采用基因工程手段，用關(guān)鍵酶基因p&質(zhì)體定位地轉(zhuǎn)化青蒿，將打破廣 藿香醇生物合成的限速瓶頸，獲得廣藿香醇高產(chǎn)的青蒿植株，為規(guī)模化生產(chǎn)廣藿香醇提 供一條新途徑。Joe Chappell等在《Nature Biotechnology》(自然生物技術(shù))2006年24期1441-1447 頁發(fā)表了題為"Redirection of cytosolic or plastidic isoprenoid precursors elevates terpene production in plants"(在植物中通過異戊二烯前體的質(zhì)體或胞質(zhì) 分流提高萜類化合物的產(chǎn)量)的論文，文中評述，通過在轉(zhuǎn)基因煙草中過量表達(dá)廣藿香 醇合成酶可以使原來不產(chǎn)生廣藿香醇的煙草產(chǎn)生廣藿香醇，每克濕重物質(zhì)中廣藿香醇含 量達(dá)到0. 5微克，可見通過代謝調(diào)控廣藿香醇合成途徑關(guān)鍵步驟可以使原來不產(chǎn)生廣藿3香醇的植物合成廣藿香醇。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，目前尚未發(fā)現(xiàn)與利用p"基因和RNA干擾的a血基 因提高廣藿香醇含量有關(guān)的報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種利用p"基因和RNA干擾a血 基因提高青蒿廣藿香醇含量的方法。本發(fā)明建立了一種穩(wěn)定提高青蒿中廣藿香醇含量 的方法，為利用轉(zhuǎn)基因青蒿大規(guī)模生產(chǎn)廣藿香醇以及除青蒿素外的其他萜類等次生代 謝物奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括步驟如下步驟一，獲得青蒿素生物合成途徑關(guān)鍵酶基因a&部分序列，廣藿香醇生物合成途徑關(guān)鍵酶基因P"全部閱讀框序列和擬南芥中質(zhì)體定位信號(hào)肽的^片段；步驟二，將獲得的基因部分序列構(gòu)建成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，然后將發(fā)夾結(jié)構(gòu)和質(zhì)體定位 的p"基因分別連于表達(dá)調(diào)控序列上，得到含a&i和質(zhì)體定位的p"基因的植物表達(dá) 載體；步驟三，用含a血i和質(zhì)體定位的p"基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌； 步驟四，利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿外植體，PCR檢測，獲得轉(zhuǎn)基因青 蒿植株；步驟五，對獲得的轉(zhuǎn)基因青蒿中廣藿香醇含量進(jìn)行測定。步驟二中，所述質(zhì)體定位的p"基因由/^5"5"或cyp;7aW基因啟動(dòng)子啟動(dòng)。步驟四中，所述PCR檢測具體為，分別設(shè)計(jì)合成檢測a血i和檢測質(zhì)體定位的p"基因的引物，進(jìn)行DNA擴(kuò)增，紫外線下觀察到目的條帶為陽性的植株即為轉(zhuǎn)基因青蒿植株。步驟五中，所述測定具體為HPLC-ELSD法檢測，色譜柱C-18反相硅膠柱，流動(dòng)相 為甲醇與水，柱溫3(TC，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10 ^L，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫 度4(TC，放大系數(shù)為7，載氣壓力5bar。所述流動(dòng)相中甲醇與水的體積比為70:30。本發(fā)明從廣藿香中克隆廣藿香醇合成酶基因的完整閱讀框P"序列，構(gòu)建質(zhì)體定位 的P"基因的植物表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)；從青蒿中克隆紫穗槐二烯合成酶基因 a血部分序列，構(gòu)建含so^'結(jié)構(gòu)的植物表達(dá)載體，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA干擾,簡稱為"WW 或"/^>/ J'/7 a血"；將質(zhì)體定位的p"和s血i基因同時(shí)導(dǎo)入植物并再生出植株；PCR檢測外源目的基因質(zhì)體定位的P"和ao^'的整合情況，利用HPLC-ELSD法測定植物中 廣藿香醇含量。本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明將青蒿素合成途徑的關(guān)鍵酶ao^'基因和質(zhì)體 定位的廣藿香醇合成途徑關(guān)鍵酶基因p"導(dǎo)入青蒿植株中，獲得了廣藿香醇含量顯著提 高的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。轉(zhuǎn)基因青蒿植株中廣藿香醇的含量達(dá)到濕重的1.02%，是非轉(zhuǎn)化 普通青蒿的1020倍，本發(fā)明對于廣藿香醇的規(guī)模化生產(chǎn)以及利用轉(zhuǎn)基因青蒿大規(guī)模生 產(chǎn)除青蒿素外的其他萜類等次生代謝產(chǎn)物具有重要意義。本發(fā)明涉及的根癌農(nóng)桿菌EHA105已在《黃亞麗，蔣細(xì)良，田云龍，郭萍，朱昌雄； 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的哈茨木霉菌遺傳轉(zhuǎn)化的研究，中國生物工程雜志，2008， 28(3): 38-43》 文獻(xiàn)中公開。根癌農(nóng)桿菌EHA105可通過公開市售的商業(yè)渠道取得，如可以從澳大利亞 CAMBIA公司購得，菌株編號(hào)為Gambarl。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解為這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī) 條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊見New York Cold Spring Harbor Laboratory出版社1989年版中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1步驟一，青蒿a血i基因、p"基因、^基因的克隆① 青蒿基因組總RNA的提取取少量青蒿幼嫩葉片，用液氮速凍后，迅速用研缽研碎，加入盛有1 mL由美國GIBCO BRL公司生產(chǎn)的TRIzol Reagents于1. 5 mL Eppendorf管中，充分振蕩后，于室溫下放 置5min，加200叱氯仿，用力振蕩15sec，室溫放置2min-3 min后，于4。C、 12， 000g 離心15 min;將約600叱上清液吸入干凈的1. 5 mL Eppendorf管中，加入等體積的異 丙醇，顛倒混勻，室溫下放置10 miri后，于4°C、 12，000g離心10 min;棄上清，加 lmL75%(v/v)乙醇清洗，振蕩后，于4。C、 7， 500g離心5 min;室溫千燥15min-20 min 后溶于30叱-50 PL RNAase-free水中；用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分 光光度計(jì)上測定RNA含量。② 廣藿香基因組總RNA的提取取少量廣藿香幼嫩葉片，用液氮速凍后，迅速用研缽研碎，加入盛有l(wèi)mL由美國 GIBCO BRL公司生產(chǎn)的TRIzol Reagents于1. 5mL Eppendorf管中，充分振蕩后，于室用力振蕩15 sec，室溫放置2min-3 min后，于4。C、 12， OOOg離心15 min;將約600叱上清液吸入干凈的1. 5mL E卯endorf管中，加入等 體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫下放置10min后，于4'C、 12, OOOg離心10 miri;棄上 清，加1 mL75%(v/v)乙醇清洗，振蕩后，于4°C、 7, 500g離心5 min;室溫干燥15min-20 min后溶于3(HiL -50叱RNAase-free水中；用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后 在分光光度計(jì)上測定RNA含量。③ 擬南芥基因組總RNA的提取取少量擬南芥幼嫩葉片，用液氮速凍后，迅速用研缽研碎，加入盛有l(wèi)mL由美國 GIBCO BRL公司生產(chǎn)的TRIzol Reagents于1. 5mL Eppendorf管中，充分振蕩后，于室 溫下放置5min，加200叱氯仿，用力振蕩15 sec，室溫放置2min-3 min后，于4。C、 12， OOOg離心15 min;將約600叱上清液吸入干凈的1. 5mL Eppendorf管中，加入等 體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫下放置lOmin后，于4。C、 12， 000g離心10 min;棄上 清，加lmL 75%(v/v)乙醇清洗，振蕩后，于4°C、 7， 500g離心5 min;室溫干燥15min-20 min后溶于30叱-50叱RNAase-free水中；用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在 分光光度計(jì)上測定RNA含量。④ 青蒿ads基因的克隆將所獲的青蒿基因組總RNA通過反轉(zhuǎn)錄酶XL (細(xì)V)反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA，根據(jù) 青蒿ads基因的編碼序列(SEQIDN0. 1)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出含有部分ads編碼序列(SEQID NO. 1中1054bp到1427bp)的上下游引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi) 切酶位點(diǎn)Xbal / Xhol以及KpnI/HindIII，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以第一鏈cDNA為模板， 經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測序。DNA序列測定由上海英駿生物技術(shù)服務(wù)有限公司采用3730自動(dòng) 測序儀完成。測序結(jié)果表明，所克隆的部分序列與GenBank中所報(bào)道的青蒿ads基因的 編碼序列(SEQ ID NO. 1中1054bp到1427bp) 一致。⑤ 廣藿香p"基因的克隆將廣藿香基因組總RNA通過反轉(zhuǎn)錄酶XL (AMV)反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA，根據(jù)廣藿 香pts基因的編碼序列(SEQ ID NO. 2)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼框的上下游引物，并在 上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)NcoI和SacI，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以第 一鏈cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測序。DNA序列測定由上海英駿生物技術(shù)服務(wù)有限 公司采用3730自動(dòng)測序儀完成。測序結(jié)果表明，所克隆的序列與GenBank中所報(bào)道的 廣藿香pts基因的編碼序列(SEQ ID NO. 2) —致。⑥擬南芥^基因的克隆將擬南芥基因組總RNA通過反轉(zhuǎn)錄酶XL (AMV)反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA，根據(jù)所述 擬南芥tp基因的編碼序列(SEQ ID NO. 3)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整功能的上下游引物，并在 上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)SacI和BaraHI，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以第 一鏈cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測序。DNA序列測定由上海英駿生物技術(shù)服務(wù)有限 公司采用3730自動(dòng)測序儀完成。測序結(jié)果表明，所克隆的序列與GenBank中所報(bào)道的 擬南芥tp基因的編碼序列(SEQ ID NO. 3) —致。步驟二，含質(zhì)體定位的p"和s血/基因的植物雙元表達(dá)載體的構(gòu)建① 中間載體pHANNBAL:: p35S-hairpin ads-nos的構(gòu)建選用pHA麗BAL為基本元件，構(gòu)建具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的中間載體pHANNBAL:: p35S-hairpin ads-no。具體地，Xhol/Hindlll以及Kpnl/Xbal分別進(jìn)行雙酶切pGEM T-easy+ads和pCAMBIA2300: :p35S_pdk_nos，其中pdk是pyruvate orthophosphate dikinase的簡稱，是一種內(nèi)含子，回收ads部分片段和pHA麗BAL大片段，連接轉(zhuǎn)化， 挑取單克隆，提取質(zhì)粒做PCR檢測和酶切驗(yàn)證。② 中間載體pCAMBIA2300: :p35S-gus-nos的構(gòu)建選用pBI121和pC腦BIA2300為基本元件，構(gòu)建雙元植物表達(dá)載體 pCAMBIA2300: :p35S-gus-nos。利用HindIII和EcoRI雙酶切pBI121和pCAMBIA2300質(zhì) 粒；回收pBI121的GUS表達(dá)盒和pCAMBIA2300大片段；連接回收產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化篩選，抽 質(zhì)粒酶切驗(yàn)證。③ 植物表達(dá)載體pCAMBIA2300: :p35S-hairpin ads-nos的構(gòu)建以pCAMBIA2300: :p35S-gus-nos為表達(dá)載體，用hairpin ads基因替換其上gus基 因。利用BamHI/SacI雙酶切pGEM T-easy+hairpin ads和pCAMBIA2300: :p35S_gus-nos， 回收hairpin ads和pCAMBIA2300::p35S-gus-nos大片段，連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，提 取質(zhì)粒做PCR檢測和酶切驗(yàn)證。 植物表達(dá)載體pCAMBIA2300: :p35S-tp-pts-nos的構(gòu)建以pCAMBIA2300: :p35S-gus-nos為表達(dá)載體，用tp-pts基因替換其上gus基因。 利用BamHI/SacI雙酶切pGEM T-easy+tp-pts和pCAMBIA2300: :p35S-gus-nos，回收 tp-pts和pC細(xì)BIA2300::p35S-gus-nos大片段，連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，提取質(zhì)粒做 PCR檢測和酶切驗(yàn)證。步驟三，將含s血i和質(zhì)體定位的； "基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌將步驟二中含3fl^'和質(zhì)體定位的基因的植物雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌， 如EHA105。取lug左右的質(zhì)粒DNA加入到200mlEHA105感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后，冰浴 30min， -70。C放置10min 。再在37。C水浴5min或42。C水浴lmin，接著冰浴2min，加 入800ml LB液體培養(yǎng)基28°C ， 175rptn搖培3hr后涂在含50 u g/ml Kanaraycin的LB平 板上。28'C培養(yǎng)到形成單菌落。步驟四，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)a血i和尸J55"啟動(dòng)子啟動(dòng)的質(zhì)體定位p"基因轉(zhuǎn)化青蒿① 外植體的預(yù)培養(yǎng)青蒿種子用75% (v/v)乙醇浸泡lmin;再用20% (v/v) NaClO浸泡20 min;無菌 水沖洗3-4次；用無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無激素的MS固體培養(yǎng)基中，MS由 Murashige和Skoog在1962年發(fā)明，可以通過公開的商業(yè)渠道取得；25'C、 16小時(shí)白 天和8小時(shí)的黑夜培養(yǎng)，培養(yǎng)3天即可獲得青蒿無菌苗。待苗長至5 cm時(shí)，剪取無菌苗 葉片外植體用于轉(zhuǎn)化。② 農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)將所述的葉片外植體，轉(zhuǎn)到1/2 MS和IOO Pmol/L AS組成的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，滴 加含活化好的所述含a血和p"基因植物雙元表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌 的1/2MS懸液，使外植體與菌液充分接觸，28'C暗培養(yǎng)3d，以滴加在不帶有目的基因的 根癌農(nóng)桿菌的1/2 MS液體培養(yǎng)基懸液的葉片外植體為對照。③ 抗性再生植株的篩選將所述的共培養(yǎng)3d的青蒿外植體轉(zhuǎn)入到MS 、 0. 5 mg/L 6-BA 、 0. 05 mg/L NM、 50 mg/L Kan和500mg/L Cb組成的發(fā)芽篩選培養(yǎng)基上于25°C 、 16h/8h光照培養(yǎng)，每兩 周繼代培養(yǎng)一次，經(jīng)過2次-3次繼代后即可獲得Kan抗性叢生芽。將生長良好的抗性叢 生芽剪下轉(zhuǎn)入1/2MS0和125mg/LCb組成生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)至生根，從而獲得Kan抗性 再生青蒿植株。④ 轉(zhuǎn)基因青蒿植株的PCR檢測根據(jù)目的基因所在表達(dá)盒p35s-adsi-nos序列A fe和a血i分別設(shè)計(jì)正向引物設(shè)計(jì) 和反向引物對目的基因進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，利用所設(shè)計(jì)的PCR特異引物，能擴(kuò)增出 958bp的特異DNA片段。而以非轉(zhuǎn)化青蒿基因組DNA為模板時(shí)，沒有擴(kuò)增出任何片段。根據(jù)目的基因所在表達(dá)盒p35s-tp-pts-nos序列p35s和tp-pts分別設(shè)計(jì)正向引物 設(shè)計(jì)和反向引物對目的基因進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，利用所設(shè)計(jì)的PCR特異引物，能擴(kuò)增 出2966bp的特異DNA片段。而以非轉(zhuǎn)化青蒿基因組DNA為模板時(shí)，沒有擴(kuò)增出任何片段。步驟五，對獲得的轉(zhuǎn)基因青蒿中廣藿香醇含量進(jìn)行HPLC-ELSD測定① HPLC-ELSD條件及系統(tǒng)適用性以及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制HPLC:采用water alliance 2695系統(tǒng)，色譜柱為C-18反相硅膠柱，此硅膠柱是 由Waters公司生產(chǎn)SymraetryShieldTMC18，具體規(guī)格為膜厚5pm，長度x內(nèi)徑250mm x 4.6mm;流動(dòng)相為甲醇與水，其中甲醇與水的體積比為70:30，此比例下廣藿香醇的 保留時(shí)間為5. 1 min，峰型良好；柱溫30。C;流速1. OmL/min;進(jìn)樣量10 ^L;靈敏度 AUFS=1. 0;理論塔板數(shù)按廣藿香醇峰計(jì)算不低于2000。ELSD:采用water alliance 2420系統(tǒng)，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度40°C,放大 系數(shù)為7，載氣壓力5 bar;稱取2. 0 mg Sigma公司生產(chǎn)的廣藿香醇標(biāo)準(zhǔn)品用lmL甲醇完全溶解，得到2 mg/mL 廣藿香醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，保存于-2(TC備用。② 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將對照品溶液在相應(yīng)色譜條件下分別進(jìn)樣2(Ld、 4pl、 6(lJ、 8pl、 10^1，記錄圖譜 及色譜參數(shù)，分別以峰面積(Y)對標(biāo)準(zhǔn)品含量(X， pg)進(jìn)行回歸分析。結(jié)果標(biāo)明，廣藿香 醇在4pg-20ng范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的log-log線性關(guān)系，廣藿香醇對照品的log-log線性 回歸方程為Y=1.28e+000X+4. 71e+000， R=0. 979546。③ 樣品的制備和廣藿香醇含量的測定廣藿香醇的提取過程基于((Journal of Chromatography A》(色譜雜志A) 2006年 6月23日第1118巻第2期180-187頁由Van Nieuwerburgh等人報(bào)道的方法取 lg-2g鮮重的青蒿葉片，于50ml試管中將其浸沒在10ml氯仿中搖蕩1分鐘，將浸出液 倒入新的試管中使氯仿?lián)]發(fā)完全，取3 ml無水乙醇充分溶解提取物，用于HPLC檢測。采用HPLC-ELSD測定廣藿香醇含量，樣品進(jìn)樣體積為2(^1,根據(jù)峰面積代入線形回 歸方程計(jì)算出樣品中的廣藿香醇含量(mg)，再除以樣品的青蒿葉濕重(g)，從而計(jì)算出 青蒿植株中廣藿香醇的含量。結(jié)果表明，本實(shí)施例青蒿中廣藿香醇的含量達(dá)到濕重的1%， 是非轉(zhuǎn)化普通青蒿的1000倍。實(shí)施例2本實(shí)施例中步驟一、步驟三及步驟五均同實(shí)施例l，本實(shí)施例與實(shí)施例1所不同之 處在于步驟二中①、②和③均同實(shí)施例1，不同之處在于，④ 中間載體pCAMBIA2300: :cyp71avl promoter-gus-nos的構(gòu)建-gus-nos，回收cyp71avl promoter和pCAMBIA2300: :p35S -gus-nos大片段，連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，提取質(zhì)粒做PCR檢測和酶切驗(yàn)證。⑤植物表達(dá)載體pCAMBIA2300:: cyp71avl promoter -tp-pts-nos的構(gòu)建以pCAMBIA2300:: cyp71avl promoter -gus-nos為表達(dá)載體，用tp-pts基因替換 其上gus基因。利用BamHI/SacI雙酶切pGEM T-easy+tp-pts和pCAMBIA2300:: cyp71avl promoter -gus-nos， 回收tp-pts禾口 pCAMBIA2300:: cyp71avl promoter -gus-nos大 片段，連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，提取質(zhì)粒做PCR檢測和酶切驗(yàn)證。步驟四中①、②和③均同實(shí)施例1，不同之處在于，④轉(zhuǎn)基因青蒿植株的PCR檢測根據(jù)目的基因所在表達(dá)盒cyp71avl promoter- hairpin ads -nos序歹!j c/p77sW promoter和力w'r貝'77aA分別設(shè)計(jì)正向引物設(shè)計(jì)和反向引物對目的基因進(jìn)行檢測。結(jié)果 表明，利用所設(shè)計(jì)的PCR特異引物，能擴(kuò)增出990bp的特異DNA片段，而以非轉(zhuǎn)化青蒿 基因組DNA為模板時(shí)，沒有擴(kuò)增出任何片段。根據(jù)目的基因所在表達(dá)盒cyp71avl promoter-tp-pts-nos序歹ij cyp71avl promoter 和tp-pts分別設(shè)計(jì)正向引物設(shè)計(jì)和反向引物對目的基因進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，利用所 設(shè)計(jì)的PCR特異引物，能擴(kuò)增出2998 bp的特異DNA片段，而以非轉(zhuǎn)化青蒿基因組DNA 為模板時(shí)，沒有擴(kuò)增出任何片段。結(jié)果表明，本實(shí)施例青蒿中廣藿香醇的含量達(dá)到濕重的1.02%，是非轉(zhuǎn)化普通青蒿 的1020倍。<110〉上海交通大學(xué)<120>利用p"基因和RNA干擾a&基因提高青蒿廣藿香醇含量的方法<160> 3<170> Patentln version 3. 1<210> 1<211> 1641<212> ■〈213〉 青蒿(Artemisia annua L )〈400〉 1atgtcacttaacctattcgccccattgccaactttcctcc犯gcatttgg60gg卿tcagtttctcatctagt卿gc犯ggggtgg犯C3gateigtg犯t120gatttaaaaa犯g卿tgcggcaactactatggatattcctatga犯cat180gCC犯ttt3ttgaagctgattgatga犯tccaacgccttgg冊t3CCgt3tcactttgaa240cggg卿ttgatcatgcattgcaatgtattctgg犯tggt300gaccgctcttccttatggttccgtcttatgcggLaagcaaggatattatgttacatgtgat360gttttcaataca犯犯tggagcgttcaagc犯tcgttsgct犯tgatgtt420g卿gUtgcttgagttgtacg33gcaacttc城gagggt3CCtgggg3ga/ttatatta480g犯gatgctcttggttttacacgatctcgtcttagcsttatgctttttct540ac犯3ccccgctctttttaccga犯tax:a^cgggcactaaagcaacccct600ttgCC33g犯t卿ggcggcgC3gt3C3ttcctttctatcttctcataac660ttaaacttgct犯gtt3gagttcaatttgcttcagtcattgcacaaggaa720gagctcagccatgtgtgc犯3tggtgg犯3gctttcgatacgcaccttgt780g犯ttgttgaatgctacttttgggg3Ct3ggttC3ggCt3tgagccacag840tattcccgggctagagttttcttcacaa犯gctgttgctgttataactcttatagatgac900acttatgatgcgtatggtaccttaagatctttactgaagctgttgaa鄉(xiāng)960tggtcaattacatgcttagacacacttccacaaattattc翻atggataca/tgg33ga^tttcttgcaaagg3ggg犯g犯Ca^gatctattt1080aactgcggcfi38g犯tttgtga犯gagtttgttagaaacctg3tggttg3agcaaaatgg1140gC3冊tg3gggacacataccgagcatgatccagttgtaatcattactggc1200ggtgctaacctgcttacaacaacttgtta/tcttggcatgagtgatatatt1260tctgtcgaatgggctgtctctgcacctcctctttttagatactcaggtatacttggtcga1320cgcctaaatgatctcstgacccac朋ggccttcatcgagc1380cttgaaagttatatgaagga8Ltat犯tgtCatgcccaaaccttgatttac1440^gg卿tog卿atgtgtgtaaaaacat t1500ccaaggccgttattgatggctgtgatctatttgtgccagtttcttgaagttcaatatgca1560acttC3cacgtatggg,cgtctctactc1620gtttatcctatgagteit^tga 1641〈110〉上海交通大學(xué)<120>利用p"基因和RNA干擾^fe基因提高青蒿廣藿香醇含量的方法<160〉 3<170〉 Patentln version 3. 1〈210〉 2<211> 1689<212〉 DNA<213> 廣藿香(Pogostemon cablin)<400> 2ggggg8柳tctagctgcatg卿gagctcatggagttgtatgcccaaagtgttggsgtg60ggtgctgcttctcgtcctcttgcgaattttcatccatgtgtgtgggg卿caaattcatt120gtctac肌cccac肌tcatgcc鄉(xiāng)ctggag卿gag鄉(xiāng)鄉(xiāng)ctgaggagctga卿tg180g卿gctg犯ggaagcatcagac肌ctacatgcggcaactgaaaatggtg240ggLtgcaatac3gLCg3tt3ggcattgeictatctttttgtgg犯g3tgttgstga^gctttg300aagaatctgtttg肌atgtttgatgctttctgc犯g肌tagcacgccact360gctctcagctttcgccttctcagacaacatgg咖c卿gtttcatgtga8gtttttg犯420aagttt犯gg3tggca犯gagttccaaatg郷atggsgcggttgcagtc480cttgaattcttcgaagccacgcatctC3gagtccstggag犯gacgtccttgat冊tgct540tttgacttcactaggaactacttggaatcagtctatgc犯ctttgaacgatcc犯ccgcg600aaacaagtcc3caacgcattg犯tgagttctcttttcgaagaggattgccacgcgtgg犯660gcaaggaagtacatatcaatctacgagc肌tacgcatctccttgctcaaa720cttgctaagctgg3tttC犯cttggtacaagCtttgC3C3g犯ggg鄉(xiāng)tgagtg卿at780tctaggtggtggaagactttac犯gtgcccac犯eigctatcattcgttag3g3tCg3ttg840gtggagtcctacttctgggcttcgggatcttstttcga3Ccgaatta/ttcggt3gCt3gg900atgattttagcaaaagggctggctg城tatctcttatggatgatgtgtatgatgcatat960ggt3Cttttg犯tgttcacagatgc犯tcg犯鄉(xiāng)tggg3tgcttcatgt1020ttagat犯acttccag3ttacatgaaaatagt3t3C33ggcccttttggatgtgtttgag1080g卿Ugacg鄉(xiāng)3gttgatcaagctaggcgcaccatatcgagcctactaitggaaaagaa1140gccatg犯atacgccgcgagagcttacatggaeigaggccc犯tggaggga1200aaacccacaacc肌ggsgtatatgaagctggcaaccaagacatgtggctacataactcta1260ataatattatcatgtcttgg敏gg犯gagggC3ttgtgaCC犯3g肌gCcttcgattgg1320gtgttctcccgacctcctttcatcgaggctacattaatcattgccaggctcgtcaatga/t1380attacaggacscgagtttgagagcacgttcgcactgcagtagaa/tgctac1440atggaagagc8C犯3gtgggg卿c卿aggtggtgtctgcca犯tggag1500tcagcatggatgaggggttcttgaatttccaatccctcta1560ctttatcttattctcaattc3gtCCg33C3Cttg3ggtt3ttt3ca犯g3gggcgattcg1620tatacacacgtgggtcctgcagttgtaccttcaxxctgtt1680ccatattaa 1689 <110>上海交通大學(xué)〈120>利用pts基因和RNA千擾a&基因提高青蒿廣藿香醇含量的方法 <160> 3〈170> Patentln version 3.1 <210> 3 <211〉 177 <212> DNA<213〉 擬南芥(Aribdopsis) <400> 3atggcttcct ctatgctctc ctccgccgct gtggttacat ccccggctca ggccaccatg 60 gtcgctccat tcaccggctt gaagtcatcc gctgcattcc cggtcacccg caagaccaac 120 aaggacatc3 cttccatcgc aagc肌cggg ggaag3tcta gctgcatgaa gg8gctc 17權(quán)利要求
1、一種利用pts基因和RNA干擾ads基因提高青蒿廣藿香醇含量的方法，其特征在于，包括步驟為步驟一，獲得青蒿素生物合成途徑關(guān)鍵酶基因ads部分序列，廣藿香醇生物合成途徑關(guān)鍵酶基因pts全部閱讀框序列和擬南芥中質(zhì)體定位信號(hào)肽的tp片段；步驟二，將獲得的ads基因部分序列構(gòu)建成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，然后將發(fā)夾結(jié)構(gòu)和質(zhì)體定位的pts基因分別連于表達(dá)調(diào)控序列上，得到含adsi和質(zhì)體定位的pts基因的植物表達(dá)載體；步驟三，用含adsi和質(zhì)體定位的pts基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌；步驟四，利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿外植體，PCR檢測，獲得轉(zhuǎn)基因青蒿植株；步驟五，對獲得的轉(zhuǎn)基因青蒿中廣藿香醇含量進(jìn)行測定。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用p"基因和RNA干擾a血基因提高青蒿廣藿香醇含 量的方法，其特征是，步驟二中，所述質(zhì)體定位的p"基因由/^55或cj^77aW基 啟 動(dòng)子啟動(dòng)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用pts基因和RNA干擾s血基因提高青蒿廣藿香醇含 量的方法，其特征是，步驟四中，所述PCR檢測具體為，分別設(shè)計(jì)合成檢測a血 和檢 測質(zhì)體定位的p"基因的引物，進(jìn)行DNA擴(kuò)增，紫外線下觀察到目的條帶為陽性的植株 即為轉(zhuǎn)基因青蒿植株。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用p"基因和RNA干擾a血基因提高青蒿廣藿香醇含 量的方法，其特征是，步驟五中，所述測定具體為HPLC-ELSD法檢測，色譜柱C-18 反相硅膠柱，流動(dòng)相為甲醇與水，柱溫30。C，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10 ^L，蒸發(fā)光 散射檢測器漂移管溫度4(TC，放大系數(shù)為7，載氣壓力5bar。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用p"基因和RNA干擾a血基因提高青蒿廣藿香醇含 量的方法，其特征是，所述的流動(dòng)相中甲醇與水的體積比為70:30。
全文摘要
一種生物技術(shù)領(lǐng)域的利用pts基因和RNA干擾ads基因提高青蒿廣藿香醇含量的方法，具體步驟為獲得基因ads部分序列和基因pts全部閱讀框序列以及擬南芥中質(zhì)體定位信號(hào)肽的tp片段；將構(gòu)建成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的ads基因部分序列和質(zhì)體定位的pts基因分別連于表達(dá)調(diào)控序列上，形成含adsi和質(zhì)體定位的pts基因的植物表達(dá)載體；利用構(gòu)建的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌；利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿外植體；HPLC-ELSD測定轉(zhuǎn)基因青蒿中廣藿香醇的含量。本發(fā)明建立了一種提高廣藿香醇含量的方法，為利用轉(zhuǎn)基因青蒿大規(guī)模生產(chǎn)廣藿香醇以及除青蒿素外的其他萜類等次生代謝物奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101597620SQ20091005078
公開日2009年12月9日 申請日期2009年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月7日
發(fā)明者唐克軒, 唐岳立, 王玥月 申請人:上海交通大學(xué)