專利名稱：基因改造和RNAi的基礎上利用植物隱性基因的方法
技術領域：
本發明涉及基因改造和RNAi的基礎上利用植物隱性基因的方法。
背景技術：
RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術是一項基因沉默新技術，自20世紀 90年代被發現以來，已被廣泛應用到動植物功能基因組研究及醫學研究當中，現在 已逐漸成為分子生物學和細胞生物學研究的有用工具之一。
基因工程育種是分子育種的重要內容，也是未來育種的趨勢。基因工程中利用 大都是顯性抗病基因，至今尚未有通過基因工程手段利用隱性抗病基因僅改變植物 抗性但不影響植物其它農藝性狀的報道。這是由于在植物轉基因過程中很少發生同 源重組，因此通過基因工程手段將來源于植物的隱性抗病基因導入植物后，在轉基 因植株中由于顯性基因的存在而不能獲得抗病效果，另外大多數隱性抗病基因不僅 參與了抗病，還在植物的生長發育過程起著重要的作用，Chu等通過RNAi (RNA Interference)的方法驗證水稻白葉枯病隱性;ra^A 基因的功能時發現，轉基因水 稻的產量隨著M"表達量的降低而減少，水稻基因；ra5編碼一個基本轉錄因子 7F/W y的隱性抗病基因，通過RNAi方法抑制與《a5等位的顯性感病基因Xa5的 表達，可能影響水稻的生長發育和產量。因此， 一種能通過基因工程手段利用隱性 抗病基因只改良水稻抗性，不影響水稻其他農藝性狀的方法不僅具有重要的理論意 義，也為改良水稻抗性提供更多可利用的抗源和途徑。

發明內容
本發明的目的是提供一種基因改造和RNAi的基礎上利用植物隱性基因的方法。
本發明在基因改造和RNAi的基礎上利用植物隱性基因的方法是通過構建培育 抗病植物的DNA分子來實現的。
所述培育抗病植物的DNA分子包括RNA干擾表達盒和人工改造基因表達盒，所 述RNA干擾表達盒自上游至下游依次包括啟動子、表達發卡RNA的DNA分子和終止 子，所述表達發卡RNA的DNA分子由A、 B和C三個片段依次連接組成，所述A片 段選自目的蛋白的編碼基因的至少277bp，所述C片段與A片段反向互補；所述人工改造基因表達盒自上游至下游依次包括啟動子、人工改造的目的基因和終止子， 所述人工改造的目的基因編碼所述目的蛋白，并且沒有與A或C片段的任一段連續
19bp的互補區。
其中，所述RNA干擾表達盒和所述人工改造基因表達盒的轉錄方向最好相反。 啟動子和終止子沒有特別的要求，能在真核生物中具有啟動外源基因表達的啟 動子均可，當然如果針對單子葉植物可優先選擇玉米泛素(ubiquitin)基因的啟動子。
上述目的蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列4。針對該目的蛋白，所述A片 段的核苷酸序列具體可為序列表中的序列1，所述人工改造的目的基因為序列表中 的序列2。
所述B片段沒有特別的限制，可以選擇多種植物基因的內含子，如Race intron， 其核苷酸序列為序列表中的序列3。
含有所述DNA分子的重組載體、轉基因細胞系和重組菌也屬于本發明的保護范 圍。所述重組表達載體可為在植物表達載體的多克隆位點插入所述的DNA分子。
所述的DNA分子和所述的重組表達載體可用來培育抗病植物。
本發明的另一個目的是提供一種培育抗病植物的方法。
本發明所提供的培育抗病植物的方法，是將所述的DNA分子導入植物中獲得抗 病植物。
其中，所述植物可為水稻，所述抗病植物可為抗白葉枯菌的水稻。
本發明的培育抗病植物的DNA分子可構建到植物表達載體中導入植物中，獲得 抗病的植物。將本發明的培育抗病植物的DNA分子轉入水稻臺北309中，獲得的轉 基因株系，在成株期對白葉枯菌株P1具有高度抗性，同時其結實率不會受到影響， 說明利用本發明的DNA分子培育能調控水稻隱性基因改良水稻白葉枯的抗性， 同時不影響水稻其他農藝性狀的，獲得抗白葉枯菌且高產的水稻新品種，對農業生 產具有重要意義。


圖1為PXa5RNAi-xa5M載體圖譜。
圖2為轉pXa5,-xa5M載體水稻的分子檢測。
圖3為轉pXa5,-xa5M載體水稻抗白葉枯菌。
具體實施方式
下述實施例中如無特殊說明所用方法均為常規方法，所用試劑均可從商業途徑 獲得。
一、轉基因載體的構建
1) 顯性RNAi片段序列的獲得
以水稻品種IR24 (國際水稻所)為實驗材料，提取其葉片總RNA，將其反轉錄 成cDNA。以此cDNA為模板，以Xa5RNAiF(5' GACTAGTGGTACCATTCAAGTTCTTGTCCAG3') 和Xa5RNAiR(5， GGAGCTCGGATCCAGGTCTAGCAGAAGAG3')為引物，PCR擴增顯性Ja5 的RNAi片段(Xa5RNAi)。
PCR反應條件先94。C預變性4min;然后94。C變性45S; 55。C退火45S; 72°C 延30min，共29個循環；最后72。C延伸10min。
對PCR產物進行iy。瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得約300bp左右的片段。回收該 300bp左右的片段，連接到T-easy載體上，獲得重組載體命名為T-Xa5,。對T-Xa5, 進行測序300bp左右的片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
2) 人工改造的隱性抗病基因xa5編碼序列的獲得
根據氨基酸密碼子的簡并性，依據xa5基因的蛋白序列，在xs5 0RF (m，f) DNA序列基礎上，將編碼同一種氨基酸的不同密碼子位置兩兩對換，最后成單的氨 基酸密碼子用該氨基酸在義s5中出現頻率較高的密碼子代替，并兼顧GC含量與原 來xs^F相當，使之沒有任一段連續19bp完全匹配的區域。人工改造的隱性抗病基 因xa5編碼序列如序列表中序列2所示。為了便于基因操作，在ORF 5，端添加了 Ncol酶切點，3，端添加BstEII酶切位點，命名為X3A
由上海生物公司合成，將xa5M連接到T-easy載體上，獲得重組載體命名 為T-xa5Mc
3) 轉化載體的構建
分別將T-Xa5,和pTCK303 (ZHEN WANG、 CHANGBIN CHEN、 YUNYUAN XU、 RONGXI JIANG、 YE HAN、 ZHIHONG XU and KANG CH0NG， A Practical Vector for Efficient Knockdown ofGene Expression in Rice (Qryzs sa"'ra L ); 尸2朋f #o_/ec〃_/ar A'o7c^y/teparter 22: 409 -417， December 2004)(中國科學院遺傳與發育生物 學研究所)用Kpn I和BamH I雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳回收300bp左右的Xa5,片 段和13K左右的pTCK303大片段，獲得重組質粒命名為pXa5,-1。再用Sac I和Spe I 雙酶切pXa5隨-1和T-Xa5隨，回收300bp左右的Xa5隨i片段和13K左右的pXa5眺i-l載體
5片段，連接獲得重組質粒命名為pXa5,。用Nco I和BstE 1I雙酶切載體T-xa5M，回 收300bp左右片段，再將pXa5,先用BstE II完全酶切，然后用Nco I進行不完全酶 切，回收13000bp左右大片段，將300bp左右片段和13000bp左右大片段連接獲得重 組載體命名為pXa5,-xa5M(圖l)。
二、轉pXa5,-xa5M載體水稻的獲得
利用農桿菌介導的方法，將重組表達載體pXa5,-xa5M導入到水稻臺北309中， 獲得了 18個轉基因株系。
以Xa5隨F: 5' -GACTAGTGGTACCATTCAAGTTCTTGTCCAG-3'和Xa5隨R: 5' -GGAG CTCGGATCCAGGTCTAGCAGAAGAG-3'為引物，檢測Xa5 RNAi片段是否整合到水稻基因 組以及Xa5基因的表達水平。
以xa5卞5' —GAACTTTACAGGCGGTCTACG-3'和xa5MR: 5' -TGGCTAAGAAGCTTAGA ATCG-3'為引物，檢測人工合成基因xa5M是否整合到水稻基因組以及xa5M基因的表 達水平。
以hptF5' -TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3'和hptR 5' -TACACAGCCATCGGTCCAGA-
3'為引物，檢測潮霉素基因是否整合到水稻基因組和潮霉素基因的表達水平。
以引物Xa55(5， GGTCTCCTCCGCTCCTCCTC 3，)和(R: 5， GGGCGATGCGTGCGCCTAAA
C 3')檢測Js5基因的5'非翻譯區(縮寫Xa55)。
以引物Xa53(5， ATTGATAACTGCGAGGTCAG 3，)和(R: 5， GGTACCATTAACATAGGATC C 3')檢測i^5基因的3' UTR區(縮寫Xa53)。
以引物77T7>Iy1F (5， TGACAAGTCCAT GACTAGC 3，)禾卩7F/Z4y1R (5， CTCT TCTTTAGTCTCCAGC 3，)檢測與L5同源的位于第一染色體的成員7FiT力Yl的表達。
PCR檢測結果如圖2A所示，表明18個轉基因株系有10個株系能同時檢測到 、 xa5M和Xa5瞧i的目的條帶。
圖2A中，positive CK為以pXa5隨-xa5M載體為模板，Negative CK為以水為 模板，1-18分別表示18個T。代轉pXa5RNAl-xa5M載體水稻。
對同時檢測到力pf、 xa5"^和Xa5RNAi的目的條帶的轉pXa5,-xa5M載體水稻和未轉 基因的水稻臺北309進行RT-PCR分析結果如圖2B所示，2對分別位于5' UTR區、 3' UTR區的引物的PCR擴增均未出現擴增產物，說明7s5基因在轉pXa5,-xa5M載 體水稻中幾乎沒有表達，轉PXa5RNAl-xa5M載體水稻的中Xa5被沉默，以xa5MF和xa5MR 為引物的PCR擴增出現擴增產物，說明轉pXa5,-xa5M載體水稻的中xa5M表達。此 外與/s5同源的位于第一染色體的成員77^7Z4 y 1的表達在轉基因株系不受影響。圖2B中，1為分子量標準，2-6為同時檢測到知L xa5M和Xa5,的目的條帶的 轉pXa5,-xa5M載體水稻的不同株系，7為未轉基因的水稻臺北309。
挑選上述能同時檢測到如f、 xa5M和Xa5,的目的條帶的8個株系、攜抗性基 因xa5的抗病對照IRBB5 (國際水稻所提供)和未轉基因的水稻臺北309，移栽到 海南陵水中科院遺傳與發育生物學研究所南繁基地，每個株系100株，隨機分成2 組，實驗組和對照組，每組設3個小區。
實驗組于成株期通過剪葉法對充分伸展的葉片接種白葉枯菌株P1 (國際水稻 所)。接種病原菌在PSA培養基(馬鈴薯300g/L， Ca(N03)2*4H20 0. 5g / L， Na2HPO 12H20 2. Og / L，蔗糖15g/L，瓊脂粉15g / L)上于28。C培養72h，調節濃 度至10tFU / mL，接種14d當病斑長度明顯而穩定時進行調查，每一植株測量三片葉。 接種14d后觀察各個株系的表型。
表型觀察結果如圖3所示，未轉基因的水稻臺北309的病斑長度約7cm (平均 值)，同時檢測到力pL xa5M和Xa5,的目的條帶的8個株系的病斑長度都不超過 lcm (平均值)，均表現出對白葉枯病的高度抗性。
圖3中，TP309為未轉基因的水稻臺北309， IRBB5是攜抗性基因；ra5的抗病 對照數字編號為同時檢測到知L xa5"和Xa5RNAl的目的條帶的轉PXa5RNAi-xa5M載體水 稻。
對轉基因植株的農藝性狀調査結果如表1，同時檢測到知t、 xa5M和Xa5RNAl的目
的條帶的株系3、 6、 17的結實率與對照相當，產量沒有受到影響。說明利用
pXa5,-xa5M載體系統是可以獲得高抗白葉枯病，但不影響產量的轉基因植株的。
表1.轉基因植株農藝性狀調査
株咼分蘗穩長每穗總粒數每穗實粒數結實率(％)
臺北30996. 78. 320.6887989.8
同時檢測27882088. 55056. 5
到力pt、3842618. 584. 57689. 9
xa5'和5781117.68438. 545. 8
Xa5'""'的6922720.3124. 5118. 595.2
目的條帶7674014.682. 000.0
的8個株882520.093. 339. 742. 6
系988.52618.8902831. 1
1786620. 110699. 393. 7
7序列表
<110>中國科學院遺傳與發育生物學研究所
〈120〉基因改造和RNAi的基礎上利用植物隱性基因的方法
<160> 4
〈210〉 1
<211> 277
〈212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉 <230〉
<400〉 1
attcaagttc ttgtccagtt tgataagtct atgacggaag ccttggagaa ccaagtcaag 60
agcaaggttt ctatcaaggg ccacctgcac acttacaggt tctgtgacaa tgtatggaca 120
ttcatcttga ctgaeigcatc attcaagaac gaggagacta cag肪caagt tggcaaggtg 180
aagattgtgg cctgtgattc caaactactc agccaataaa ttgataactg cgaggtcagg 240
gtttgcctgg tatttgttag tctcttctgc tagacct 277
<210> 2
<211> 321
<212〉 DNA <213〉人工序列
<220> 〈230〉<400> 2
atggccacgt tcgaacttta caggcggtct gacgaaa/tgg ttagcagcgg cacgctgtcc ttcgatsiaat cteitgaccga ggcattggaa ggccacctcc acacctaccg gttctgcgac agcttcaaaa acgaagagac aactgagcaa tctaagcttc ttagccaatg a
acgatcggca tgtgtctaac tgaaaccctt 60 ccggaacttg ccatccaagt cctcgaacag 120 ataccaagtgei aaagcaaggt ctcca_ttaaei 180 aatgtttgga ctttcatttt gaccgaggcc 240 gtcggcaaag tgaagatcgt cgcctgcgat 300
321
<210〉 3
〈211〉 477
〈212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉 <230>
gtcgacggtaagttactacaaacctttttg
tctcatgttccacgtatcactttaatgttc
ttagaggatcaagagtatatgcctgtctta
ctgeLt￡Ltt￡iaigatgaatttt
catagttcataattttaccctgttctcaat
cttgacattgatgatca^atattttctaga
ccacggcagttacccactgt
aaacctttgattgttcctataacacctaat
tacttatgtt ccagtgacaa ttatttgtgt 60
atggttgatc attgtaccgc ctcatctctt 120
actttttctt tctctggtcc agtctttccg 180
atgtgctgcc tgtgtatgaa ggttcagagg 240
taggaaatgt attttgcaag gtcataaagt 300
gctaaaattt cataatcaaa tatgacagtt 360
atatattagt atgaagatta acacttgaaa 420
gattgactat gacacggctg tttcgag 477
〈210〉 4 <211> 106 〈212〉 PRT
9<213>人工序列
<220〉 <230>
〈400〉 4
Met Ala Thr Phe Glu Leu Tyr Arg Arg Ser Thr lie Gly Met Cys Leu
15 10 15
Thr Glu Thr Leu Asp Glu Met Val Ser Ser Gly Thr Leu Ser Pro Glu
20 25 30
Leu Ala lie Gin Val Leu Glu Gin Phe Asp Lys Ser Met Thr Glu Ala
35 40 45
Leu Glu Asn Gin Val Lys Ser Lys Val Ser lie Lys Gly His Leu His
50 55 60
Thr Tyr Arg Phe Cys Asp Asn Val Trp Thr Phe lie Leu Thr Glu Ala 65 70 75 80
Ser Phe Lys Asn Glu Glu Thr Thr Glu Gin Val Gly Lys Val Lys lie
85 90 95
Val Ala Cys Asp Ser Lys Leu Leu Ser Gin 100 105
10
權利要求
1、一種DNA分子，包括RNA干擾表達盒和人工改造基因表達盒，所述RNA干擾表達盒自上游至下游依次包括啟動子、表達發卡RNA的DNA分子和終止子，所述表達發卡RNA的DNA分子由A、B和C三個片段依次連接組成，所述A片段選自目的蛋白的編碼基因的至少277bp，所述C片段與A片段反向互補；所述人工改造基因表達盒自上游至下游依次包括啟動子、人工改造的目的基因和終止子，所述人工改造的目的基因編碼所述目的蛋白，并且與A或C片段的沒有任一段連續19bp的互補區。
2、 根據權利要求1所述的DNA分子，其特征在于所述RNA干擾表達盒和所述 人工改造基因表達盒的轉錄方向相反。
3、 根據權利要求1或2所述的DNA分子，其特征在于所述目的蛋白的氨基酸 序列為序列表中的序列4。
4、 根據權利要求3所述的DNA分子，其特征在于所述A片段的核苷酸序列為 序列表中的序列1。
5、 根據權利要求4所述的DNA分子，其特征在于所述人工改造的目的基因為 序列表中的序列2。
6、 根據權利要求5所述的DNA分子，其特征在于所述B片段的核苷酸序列為 序列表中的序列3。
7、 含有權利要求1至6中任一所述DNA分子的重組表達載體、轉基因細胞系或 重組菌。
8、 權利要求1至6中任一所述的DNA分子、權利要求7所述的重組表達載體、 轉基因細胞系或重組菌在培育抗病植物中的應用。
9、 一種培育抗病植物的方法，是將權利要求1至6中任一所述的DNA分子導入 植物中獲得抗病植物。
10、 根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述植物為水稻，所述抗病植物 為抗白葉枯菌的水稻。
全文摘要
本發明公開了一種基因改造和RNAi的基礎上利用植物隱性基因的方法。該方法通過構建培育抗病植物的DNA分子來實現，該DNA分子包括RNA干擾表達盒和人工改造基因表達盒，所述RNA干擾表達盒自上游至下游依次包括啟動子、表達發卡RNA的DNA分子和終止子，所述表達發卡RNA的DNA分子由A、B和C三個片段依次連接組成，所述A片段選自目的蛋白的編碼基因的至少277bp，所述C片段與A片段反向互補；所述人工改造基因表達盒自上游至下游依次包括啟動子、人工改造的目的基因和終止子，所述人工改造的目的基因編碼所述目的蛋白，并且與A或C片段不互補。利用本發明的DNA分子能改良水稻白葉枯的抗性，同時不影響水稻其他的農藝性狀。
文檔編號C12R1/91GK101508991SQ20091008112
公開日2009年8月19日 申請日期2009年4月2日 優先權日2009年4月2日
發明者夏志輝, 江光懷, 翟文學, 高利芬 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所