專利名稱：一株煙曲霉及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株煙曲霉及其應用。
背景技術：
鬼臼毒素(podophyllotoxin)主要存在于小檗科鬼臼屬及其近緣植物中，是一 類具有廣泛生物學活性的天然化合物，有擬雌激素樣、抗雌激素樣、抗癌、抗病毒、
抗真菌、鎮靜、抑制植物生長和抗氧化等作用。特別是其具有較強的抗癌活性，其 作用機制是抑制微管蛋白的解聚作用以阻止細胞分裂以及抑制DNA拓撲異構酶的 活性。鬼臼毒素的糖苷衍生物etoposide和teniposide的毒性較低，對小細胞肺癌、 淋巴癌等多種腫瘤疾病均具有很好的療效而成為臨床應用的廣譜抗腫瘤藥物。
目前，鬼臼毒素主要是從野生鬼臼類植物的根莖中提取得到，而這類植物在全 世界僅有4屬15種，我國有3屬12種，主要生長在秦嶺、西藏等高海拔地區，其 生長緩慢，且鬼臼毒素類物質的含量較低。由于鬼臼毒素類物質在醫學和農林防治 等方面具有廣闊的應用前景，因而其需求量日益增加；對野生鬼臼類植物資源的大
量采集，已使其資源遭到嚴重破壞，造成生物多樣性和生態環境的不可逆的損失， 因此解決鬼臼毒素類物質的來源問題具有重要意義。
由于植物生長環境復雜，難以模擬，且其生長周期長，很難進行大規模的人工 栽培，而組織培養技術對于鬼臼類植物也不適用；加之，鬼臼毒素類物質化學結構 復雜，化學合成雖可進行，但成本太高，而通過基因工程學手段構建工程菌也由于 參與形成該類物質的酶數量過多而無法進行。所以利用內生菌具有產生和宿主相同 或相似的生物活性物質的性質，來解決鬼臼毒素的來源問題，可能是唯一也是最有 效的方法。
近年來，已有學者利用內生菌具有產生和宿主相同或相似的生物活性物質的性 質，對我國特有的一些鬼臼類植物的內生菌進行了研究，已有從川八角蓮、中華山 荷葉中分離到青霉屬的內生菌，其培養物經層析分析具有與鬼臼毒素相同的Rf值 的報道(中華山荷葉內生真菌的分離及其發酵產生藥用成分的初步研究，劉仕平、 曾松茸、郭仕平、楊春艷、張玲琪，中國藥物與臨床，2003.3 (3) : 227—228;川 八角蓮內生真菌產鬼臼毒素類似物的初步研究，郭仕平、蔣斌、蘇瑩珍、劉仕平、張玲琪，生物技術，2004.14 (2) : 55-56.)。
此外，由于鬼臼類植物中還含有多種黃酮類化合物，因而其內生菌也可能產生 黃酮類化合物。許多研究證實，黃酮類化合物在人體中具有多種生物活性，包括抗 氧化、抗癌、防癌、清除自由基、抗病毒、消炎和促進血管舒張等。此外，異黃酮 (如染料木黃酮和羥基異黃酮)還具有雌激素特性。黃酮類化合物的多種生理作用， 使其在醫藥、食品等行業具有廣泛的應用前景。

發明內容
本發明的目的是提供一株煙曲霉。
本發明所提供的煙曲霉是從甘肅省漳縣大草灘(海拔2700m)采集的植物桃兒 七(&'w; ocfo/ /zj;〃wm/zexflm/ram (7 o;;/e) J7"g)的根及根狀莖中分離、篩選、純化得 到的，根據其形態特征等證實屬于半知菌綱、叢梗孢目、叢梗孢科、曲霉屬，將其 命名為煙曲霄(T4s/ erg7'〃w^/^m/g"/2Ay) TEQA。煙曲霧(J5^erg///z^yi//wi^afus) TEQA 已于2009年6月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡 稱CGMCC，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)，保藏登 記號為CGMCCWe3115。
煙曲霉"^^gZ〃z^/wm/g^^) TEQA CGMCC処3115在PDA瓊脂培養上生 長迅速、菌落中心稍凸起、無輻射狀皺紋；菌落質地絲絨狀到絮狀；分生孢子結構 大量，中部多、邊緣少，近于帶灰的橄欖綠或海貍灰；無滲出液；輕霉味；菌落反 面黃褐色或帶綠的淡黃色。
分生孢子頭幼時球形或半球形，成熟時呈致密的圓柱狀，150-350微米或更長； 分生孢子梗發生于基質，少量發生于氣生菌絲，通常前者的孢梗莖較長，后者的較 短，上部帶不同程度的綠色并逐漸膨大形成頂囊，壁平滑；頂囊燒瓶狀，直徑20-30 微米，但少數小頂囊的直徑僅有6.5-15微米，約1/2至lj3/4的表面可育，呈不同程 度的綠色或淺灰綠色；產孢結構單層，瓶梗5-8X2-2.5微米，近于平行；分生孢子 球形或近球形，直徑2.5-3微米或稍大，壁稍粗糙。
綜合上述特征，依據《真菌鑒定手冊》、《中國真菌志》等資料，上述分離得 到的菌株具有煙曲霉的基本特征，將其鑒定為煙曲霉(A^^7/^/謂^to)。
本發明的另一個目的是提供一種制備鬼臼毒素和/或表鬼臼毒素雙葡萄糖苷和 /或黃芪苷的方法。
本發明所提供的制備鬼臼毒素和/或表鬼臼毒素雙葡萄糖苷和/或黃芪苷的方法，是發酵培養上述煙曲霉(A;^g/〃船/wm^ ftw) TEQACGMCCWs3115，得到 鬼臼毒素(podophyllotoxin)禾n/或表鬼臼毒素雙葡萄糖苷(L-picropodophillotpxin 7'-0-( 0 -D-glucopyranosyl-(l—6)- P -D-glucopyranoside)禾口/或黃度苷(Astragalin)。
鬼臼毒素的結構式如式i所示，表鬼臼毒素雙葡萄糖苷的結構式如式n所示， 黃芪苷的結構式如式m所示
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上述方法中，所述發酵培養的培養基包括馬鈴薯葡萄糖培養基。
所述培養條件為26-30°C 、 100-150rpm振蕩培養5-9天，具體可為28°C 、 120rpm 振蕩培養7天。
煙曲霉(A/^g/〃ws/Mm/gaft^) TEQA CGMCC ]^3115在制備鬼臼毒素和/或 表鬼臼毒素雙葡萄糖苷和/或黃芪苷中的應用也屬于本發明的保護范圍。
本發明的煙曲霉"werg/〃M/wm/ga^s) TEQA CGMCC JYs 3115具有產生與桃 兒七相同的鬼臼毒素、表鬼臼毒素雙葡萄糖苷以及黃酮類物質黃芪苷的生理特性， 可用于鬼臼毒素類物質及黃度苷的制備；本發明的制備鬼臼毒素和/或表鬼臼毒素 雙葡萄糖苷和/或黃芪苷的方法，發酵條件簡單、菌種易培養、生產周期短，具有工業化規模生產的應用潛力；對鬼臼毒素類物質的資源開發提供了新途徑，對保護
植物生態多樣性具有重要意義。


圖1為煙曲霉(^perg/Z/ws/wm^m^) TEQACGMCC W2 3115的菌落形態 圖2為煙曲霉(^perg/〃ws/mm'gafws) TEQA CGMCC JVs 3115分生孢子頭形態 圖3為鬼臼毒素標準品的HPLC譜圖(流動相，甲醇水=60: 40) 圖4為表鬼臼毒素雙葡萄糖苷標準品的HPLC譜圖(流動相，甲醇水=60:
40)
圖5為黃芪苷標準品的HPLC譜圖(流動相，甲醇水=60: 40) 圖6為煙曲霉(v4^erg/〃^7W^"^y) TEQA CGMCC W 3115發酵液的氯仿提 取物的HPLC譜圖
圖7為表鬼臼毒素雙葡萄糖苷標準品的HPLC譜圖(流動相，甲醇水=50:
50)
圖8為煙曲霉C^perg/〃w/Mm/gato) TEQA CGMCC Ws 3115發酵液的正丁醇 提取物的HPLC譜圖
具體實施例方式
下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和生物 材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
實施例1、煙曲霉(^^rg/〃M>y>m/gfl<to) TEQA CGMCC3115的分離及鑒
定
將采集自甘肅省漳縣大草灘(海拔2700m)的植物桃兒七(&力o;w^^/z;/〃Mm /2ex朋Aww f7 o;;/^ 7z力g)的根及根狀莖分別用自來水洗凈，在超凈工作臺中用75% 體積百分含量的乙醇處理5min，然后無菌水沖洗3-5次；而后再用2.5%質量百分含 量的次氯酸鈉處理10min，再無菌水沖洗3-5次。用滅菌的鑷子和刀片將桃兒七的根 的外皮剝去，再切成0.5cmX0.5cm大小的小片種植于PDA固體培養基上，28"C培養 3-7天。同時將同樣滅菌處理過的桃兒七的根不做剝皮及切割，將桃兒七的根在PDA 培養基上滾動一周后，同條件培養作為對照觀察。
培養幾天后發現在桃兒七的根的切口處有菌絲長出，取切口處新長出的菌絲， 轉接到新鮮的PDA培養基上培養，待菌落出現后，根據菌落的形態、顏色的差異 及菌落長出時間的不同，分別挑取培養基邊緣的菌絲接種于新的PDA培養基上進行分離培養，直至篩選出單一的菌落，挑取單菌落作進一步研究。
將上述分離得到的單菌落接種至PDA培養基上，當細胞生長至對數生長后期， 菌落大小穩定后，進行單菌落平均狀態的描述。結果表明，上述分離得到的菌株 TEQA在PDA培養基上生長迅速，菌落中心稍凸起，無輻射狀皺紋；菌落質地絲 絨狀到絮狀，具體的菌落形態如圖1所示。
分生孢子結構大量，中部多、邊緣少，近于帶灰的橄欖綠或海貍灰；無滲出液; 輕霉味；菌落反面黃褐色或帶綠的淡黃色。分生孢子頭幼時球形或半球形，成熟時 呈致密的圓柱狀，150-350微米或更長；分生孢子梗發生于基質，少量發生于氣生
菌絲，通常前者的孢梗莖較長，后者的較短，上部帶不同程度的綠色并逐漸膨大形
成頂囊，壁平滑；頂囊燒瓶狀，直徑20-30微米，但少數小頂囊的直徑僅有6.5-15 微米，約l/2到3/4的表面可育，呈不同程度的綠色或淺灰綠色；產孢結構單層， 瓶梗5-8X2-2.5微米，近于平行；分生孢子球形或近球形，直徑2.5-3微米，或稍 大，壁稍粗糙。上述篩選得到的菌株的分生孢子頭形態如圖2所示。其中，A為10x40 倍放大倍數下的分生孢子頭形態，B為10x100倍放大倍數下的分生孢子頭形態。
綜合上述特征，依據《真菌鑒定手冊》、《中國真菌志》等資料，上述分離得 到的菌株具有煙曲霉的基本特征，將其鑒定為煙曲霉(^t7e/^K廳扭to)，其 分類屬于半知菌綱、叢梗孢目、叢梗孢科、曲霉屬。煙曲霉(A^e^7/w/wmZg"to) TEQA已于2009年6月11日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)， 保藏登記號為CGMCCW2 3115。
實施例2、利用煙曲霉(^perg/〃附/wm/ga^;y) TEQA CGMCC W 3115制備鬼 臼毒素、表鬼臼毒素雙葡萄糖苷和黃喪苷
馬鈴薯葡萄糖液體培養基的組成為去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，加水定容 至1000mL。
配制方法如下將馬鈴薯去皮，切成約2ci^的小塊，放入燒杯中煮沸30min， 然后用雙層紗布過濾，取濾液加入葡萄糖，再補足水，pH自然。
將100ml制備好的馬鈴薯葡萄糖液體培養基裝于250ml三角瓶中，滅菌備用。 挑取上述實施例1篩選得到的煙曲霉(A^erg/〃^/Mm/g加w)TEQA CGMCC Ws 3115 的單菌落接種于上述滅菌好的馬鈴薯葡萄糖液體培養基中，28°C、 120r/min搖床培 養7天。用抽濾器將上述發酵液抽濾兩次，分別收集菌絲體與發酵液。將發酵液先后用 等體積的氯仿和正丁醇萃取，隨時取萃取液于紫外吸收檢測器下檢測，直至萃取液 在紫外吸收檢測器下無熒光，合并萃取液，減壓蒸餾回收，分別得到發酵液的氯仿 提取物和正丁醇提取物。
將上述獲得的發酵液的氯仿提取物和正丁醇提取物分別采用高效液相色譜法
(HPLC)進行檢測。同時以鬼臼毒素標準品(購自中國藥品生物制品檢定所)、 表鬼臼毒素雙葡萄糖苷標準品(Changqi ZHAO, Akito NAGATSU, Keiichiro HATANO， Naohiro SHIRAI, Setsuko KATO, and Yukio OGIHARA ， New Lignan Glycosides from Chinese Medicinal Plant: Sinopodophillum emodi ， CT em. /Vwrm. 51 (3):55-261(2003))和黃芪苷標準品(購自中國藥品生物制品檢定所)作為對照， 具體的檢測方法如下-
高效液相色譜儀AglientllOO型；
色譜柱Aglient 1100 Eclipse XDB-C18 (5|im， 4.6x150mm); 檢測器紫外檢測器；檢測波長254nm;
色譜條件流動相甲醇水=60: 40 (用于發酵液氯仿提取物的HPLC分析)；
甲醇水=50: 50(用于發酵液正丁醇提取物的HPLC分析)；
流速0.5ml/min; 進樣量5^1; 柱溫室溫；
標準品鬼臼毒素、表鬼臼毒素雙葡萄糖苷、黃底苷。 檢測前，將鬼臼毒素標準品、表鬼臼毒素雙葡萄糖苷標準品和黃芪苷標準品以 及上述煙曲霉(Aperg///w/i^/gflft ) TEQACGMCC地3115發酵液的氯仿提取物 和正丁醇提取物分別用甲醇充分溶解，0.45pm微孔濾膜過濾，采用外標法對上述發 酵液進行HPLC分析，每個樣品至少重復三次。實驗設三次重復，結果如圖3-8所 示。其中，圖3為鬼臼毒素標準品的HPLC譜圖(流動相，甲醇水=60: 40)， 圖4為表鬼臼毒素雙葡萄糖苷標準品的HPLC譜圖(流動相，甲醇水=60: 40)， 圖5為黃芪苷標準品的HPLC譜圖(流動相，甲醇水=60: 40)，圖6為煙曲霉 /w仿/g"加力TEQA CGMCC W 3115發酵液的氯仿提取物的HPLC譜圖， 圖7為表鬼臼毒素雙葡萄糖苷標準品的HPLC譜圖(流動相，甲醇水=50: 50)， 圖8為煙曲霉(v4^e/^〃站/wm/g"加)TEQA CGMCC Ws 3115發酵液的正丁醇提取物的HPLC譜圖。
將煙曲霉(A;^g/〃^/Mm/gfl^y) TEQACGMCC W 3115發酵液的氯仿提取物和 正丁醇提取物的HPLC譜圖分別與鬼臼毒素標準品、表鬼臼毒素雙葡萄糖苷標準品 和黃芪苷標準品的HPLC譜圖進行比對。
結果表明，在保留時間為8.276分鐘時，發酵液的氯仿提取物具有吸收峰，而鬼 臼毒素標準品在8.336分鐘時具有吸收峰，說明發酵液的氯仿提取物中含有鬼臼毒 素；在保留時間為3.402分鐘時，發酵液的氯仿提取物具有吸收峰，而表鬼臼毒素 雙葡萄糖苷標準品在3.400分鐘時具有吸收峰，說明發酵液的氯仿提取物中含有表 鬼臼毒素雙葡萄糖苷；在保留時間為4.879分鐘時，發酵液的氯仿提取物具有吸收 峰，而黃芪苷標準品在4.965分鐘時具有吸收峰，說明發酵液的氯仿提取物中含有 黃芪苷。而且，在保留時間為4.962分鐘時，發酵液的正丁醇提取物具有吸收峰， 而表鬼臼毒素雙葡萄糖苷標準品在4.854分鐘時具有吸收峰，說明發酵液經氯仿萃 取后再經正丁醇萃取，提取物中含有表鬼臼毒素雙葡萄糖苷。以上結果表明，發酵 液的氯仿提取物中含有鬼臼毒素、表鬼臼毒素雙葡萄糖苷和黃芪苷這三種化合物； 而發酵液經氯仿萃取后再經正丁醇萃取，提取物中只含有表鬼臼毒素雙葡萄糖苷。
權利要求
1、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)TEQA，其保藏登記號為CGMCC № 3115。
2、 煙曲霉C4^er^7/us/wm/gflft^) TEQA CGMCC Ws 3115在制備鬼臼毒素和/ 或表鬼臼毒素雙葡萄糖苷和/或黃芪苷中的應用。
3、 一種制備鬼臼毒素和/或表鬼臼毒素雙葡萄糖苷和/或黃度苷的方法，是發 酵培養權利要求1所述煙曲霉C4werg/〃us/wm/g^^) TEQA CGMCC 3115 ，得 到鬼臼毒素和/或表鬼臼毒素雙葡萄糖苷和/或黃芪苷。
4、 根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述發酵培養的培養基為馬鈴 薯葡萄糖培養基。
5、 根據權利要求3或4所述的方法，其特征在于所述發酵培養的條件為 26-30。C、 100-150rpm振蕩培養5-9天。
6、 根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述發酵培養的條件為28°C、 120rpm振蕩培養7天。
7、 根據權利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述方法還包括將發 酵液進行萃取的步驟。
8、 根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述萃取的萃取劑為氯仿或正 丁醇。
全文摘要
本發明公開了一株可產生鬼臼毒素、表鬼臼毒素雙葡萄糖苷和黃芪苷的煙曲霉及其應用。本發明的煙曲霉(Aspergillus fumigatus)TEQA CGMCC № 3115具有產生與桃兒七相同的鬼臼毒素、表鬼臼毒素雙葡萄糖苷以及黃酮類物質黃芪苷的生理特性，可用于鬼臼毒素類物質及黃芪苷的制備；本發明的制備鬼臼毒素、表鬼臼毒素雙葡萄糖苷和黃芪苷的方法，發酵條件簡單、菌種易培養、生產周期短，具有工業化規模生產的應用潛力；對鬼臼毒素類物質的資源開發提供了新途徑，對保護植物生態多樣性具有重要意義。
文檔編號C12P19/00GK101575576SQ200910086919
公開日2009年11月11日 申請日期2009年6月18日 優先權日2009年6月18日
發明者朱妍妍, 嫦 艾, 栗 賈, 趙長琦 申請人:北京師范大學