專利名稱：：一種螺旋霉素發酵工藝的制作方法
技術領域：
：本發明涉及螺旋霉素的發酵工藝優化方法。具體說是通過添加金屬離子提高螺旋霉素產量的一種發酵工藝。
背景技術：
：螺旋霉素是由生二鏈霉菌(Streptomycesambofaciens)所產生的多組分大環內酯類抗生素。螺旋霉素鏈霉菌生物合成螺旋霉素的過程受許多酶的調控作用。酰基激酶和?；o酶A合成酶是螺旋霉素內脂環合成的重要酶。由于合成酶的活性較小，推測其可能是大環合成的"瓶頸"，如果提高其活性，就有可能大幅度提高發酵效價。在發酵前期加入激活因子，乙酸激酶處于初級代謝中，活性提高對次級代謝影響不大，效價提高不明顯。在發酵中期加入激活因子，大大提高了參與次級代謝的乙酸激酶和乙酰CoA合成酶的活性，突破了大環合成的限制，從而明顯提高了螺旋霉素的發酵效價。毛全貴等人發表在中國抗生素雜志2005年11月第30巻第11期(文索編號1001-8689(2005)11-0647-02)金屬離子對螺旋霉素生物合成的影響一文也曾報道過在螺旋霉素產生菌產二素鏈霉菌(Streptomycesambofaciens)發酵過程中添加012+、Ca2+、Fe2+和Mg2+等無機金屬離子，測定不同離子濃度對螺旋霉素發酵水平的影響。研究表明Ci^對螺旋霉素生物合成有較強的抑制作用，C^+對螺旋霉素生物合成影3響不大，Fe2+、Mg^都有明顯激活作用，其中Fe"在添加濃度為2.5ug/ml時對螺旋霉素生物合成的促進作用最大，效價比對照組高18.3%;Mg^在濃度為3.0Pg/ml時效果最好，效價比對照組高出11.4%?，F有的螺旋霉素的發酵生產只是一些較常規的發酵生產方式，即不添加金屬離子的生產工藝，發酵工藝為將冷凍管接種于母瓶種子培養40-48h，子瓶培養24h，一級種子培養23-30h;二級種子培養20-32h;發酵培養100-136h放罐。所存在的突出問題是發酵單位較低，并且費時費力，往往達不到生產化的要求。本申請加入的錳離子相對于現有技術中未加入金屬離子相比，發酵單位可提高25%。
發明內容本發明的目的在于提供一種簡便的螺旋霉素生產工藝，在發酵過程中通過添加金屬離子達到提高螺旋霉素堿單位產量之目的。本發明是通過以下方式來實現在一種實施方案中，本發明提供了一種生產螺旋霉素堿的發酵工藝，所述工藝包括螺旋霉素產生菌采取種子培養和發酵過程，其特征在于在發酵過程中，添加錳離子的水溶液，使得發酵罐錳離子的濃度為15-40mM。在本發明中使用的發酵培養基重量配比為淀粉10~15%，黃豆餅粉12%，玉米漿2~3%，磷酸二氫鉀0.010.02%，氯化鈉11.5%，碳酸鈣11.2%，豆油0.5~0.8%。在本發明更進一步的技術方案中，發酵工藝包括將冷凍管接種于母瓶培養基，在27士0.5。C下培養40-48h，搖床轉速220—240轉/分；按6Q^接種量接種子瓶培養基，在27i0.5"C下培養24h，轉速220-240轉/分；當發酵進行到40小時左右時加入含有錳離子的溶液。優選錳離子的濃度為15-40mM。優選錳離子源為四水氯化錳。在本發明進一步的方法中，涉及工業化生產螺旋霉素的方法，其特征在于所述方法包括將冷凍管接種于母瓶培養基，在27士0.5'C下培養40-48h，搖床轉速220-240轉/分；按6%接種量接種子瓶培養基，在27士0.5。C下發酵24h，轉速220—240轉/分；按10%接種量接種于一級種子罐中進行發酵，在25-28.5'C下培養23-30h;按10。％移種量接種于二級種子罐中進行發酵，在20-28"C下培養20-32h;最后，按IO%移種量接種于發酵罐中進行發酵，在24-28.5。C下培養100-136h，當發酵進行到40小時時左右，添加錳離子的水溶液，使得發酵液中的錳離子濃度為15-40mM，最終獲得螺旋霉素，其發酵單位可提高大約25%。在上述實施方案中，優選發酵裝置為100m3不銹鋼罐，轉速的優選范圍120140轉/分，罐壓的優選范圍0.010.04MPa，風量的優選范圍15002000mVh。本發明與現有技術相比，具有如下特點(1)發酵水平高，已明顯超過原工藝的水平。(2)對組分沒有影響。(3)操作簡單。(4)成本低，便于大規模生可以看出這種方法有效地克服了國內現有生產螺旋霉素堿工藝的不足，適合大規模工業生產的需要。具體實施例方式下面通過實施例進一步說明本發明。應該理解的是，本發明實施例的制備方法僅僅是用于說明本發明，而不是對本發明的限制，在本發明的構思前提下，類似的制備方法都屬于本發明要求保護的范圍。除非另有說明，本發明中的百分數是重量百分數，另外，本發明說明書中的(w/w)是指重量比或者重量比濃度，(v/v)是指體積比或者體積比濃度，W/V是指重量與體積的比例(例如，克/毫升，g/ml或者千克/升)。實施例1、2、3為搖瓶實驗，是將斜面種子轉接搖瓶種子培養基擴大培養，在搖瓶中進行發酵；實施例4、5和6為放大試驗，種子經一級、二級種子罐擴大培養而來，在1001113發酵罐中進行發酵。實施例1將斜面(即菌種)接種于搖瓶種子培養基中，在27t:下培養48h，搖床轉速220r/min;按6%接種量接入搖瓶發酵培養基中，轉速為220r/min，在27。C下，旋轉式搖床培養96h。發酵培養基按常規方法配制(發酵培養基淀粉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硝酸銨、碳酸鈣、玉米漿、豆油，其比例為淀粉10~15%，黃豆餅粉12%，玉米漿23%，磷酸二氫鉀0.010.02%，氯化鈉11.5%，碳酸f丐11.2%，豆油0.50.8%)，當發酵進行到35小時時，一次性投入含一定量錳離子的四氯化錳水溶液與發酵液中，使得投入到發酵搖瓶中的錳離子濃度為30mM。實施例2如實施例1的方法，當發酵進行到40小時時一次性投入含一定量錳離子的水溶液與發酵液中，此時投入到發酵搖瓶中的錳離子濃度為35mM。實施例3如實施例1的方法，當發酵進行到45小時時一次性投入含一定量錳離子的水溶液到發酵液中，此時發酵搖瓶中的錳離子濃度為40mM。表l.錳離子添加工藝在搖瓶上的實驗結果沒有添加過Mr^+搖瓶對照Mr^+添加濃度(mM)Mn2+搖瓶對照<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>效價與螺旋霉素的含量相對應，而效價的高低是評價發酵水平的標志。按干燥品計算:每lmg螺旋霉素相當于卯0螺旋霉素的效價單位。由此可見，在上述發酵過程中，加入錳離子之后顯著提高了螺旋霉素的含量。實施例4如實施例l的方法，按6%接種量接入搖瓶發酵培養基中，轉速為220r/min，在27。C下，旋轉式搖床培養27h。按10%接種量接種于lm3—級種子罐中進行發酵，25-28.5'C培養23-30h;按10%移種量接種于101113二級種子罐中進行發酵，20-28"C培養20-32h;按10%移種量接種于100m3發酵罐中進行發酵，24-28.5'C培養100-136h。當發酵進行到35小時一次性投入含一定量錳離子的水溶液(四氯化錳水溶液)與發酵液中，使得此時投入到發酵搖瓶中的錳離子濃度為30mM。實施例5如實施例4的方法，當發酵進行到40小時時一次性投入含一定量錳離子的水溶液與發酵液中，此時投入到發酵搖瓶中的錳離子濃度為35mM。實施例6如實施例4的方法，當發酵進行到45小時時一次性投入含一定量錳離子的水溶液與發酵液中，此時投入到發酵搖瓶中的錳離子濃度為35mM。表2.錳離子添加工藝在1001113發酵罐上的實驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從上表可以看出在100m3發酵罐上試驗，發酵前期(40小時左右)加入錳離子濃度為15-40mM，加入錳離子的發酵單位比對照高出大約25.0%。權利要求1.一種添加金屬離子提高螺旋霉素堿產量的發酵工藝，發酵工藝為將冷凍管接種于母瓶培養基，27±0.5℃培養40-48h，轉速220--240轉/分；按6％接種量轉接子瓶培養基，27±0.5℃培養24h，轉速220--240轉/分；按10％接種量接種于一級種子罐中進行發酵，25-28.5℃培養23-30h；按10％移種量接種于二級種子罐中進行發酵，20-28℃培養20-32h；按10％移種量接種于發酵罐中進行發酵，24-28.5℃培養100-136h；其特征在于在發酵的過程中，添加錳離子的水溶液，使得發酵液中錳離子的濃度為15-40mM。2.如權利要求l所述的發酵工藝，其特征在于，當發酵進行到40小時左右時，添加錳離子的水溶液，使得發酵液中的錳離子濃度為15-40mM。全文摘要一種添加金屬離子提高螺旋霉素堿產量的發酵工藝。本發明是在按常規方法配置發酵培養基后，添加一定量的錳離子溶液，用本發明所建立的發酵工藝進行螺旋霉素堿的發酵水平已明顯超過原工藝的水平，不僅效價高，而且操作簡單成本低，便于大規模生產，有效地克服了現有發酵方法的不足，并為下一階段的工業產業化的實現奠定了良好基礎。文檔編號C12P19/62GK101497907SQ200910118920公開日2009年8月5日申請日期2009年3月6日優先權日2009年3月6日發明者唐慧慧,孔德周,李武德,李翠平,毛全貴,焦國華,偉王,祝立新申請人:河南天方藥業股份有限公司