專利名稱：啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供啟動子、載體、構(gòu)建體和藥物組合物及其在癌癥治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甲胎蛋白(AFP)的合成在出生后即迅速地下降。血液AFP在非妊娠的成年人中 幾乎檢測不到。肝癌、睪丸癌、畸胎瘤、消化道腫瘤和胰腺癌的癌癥細(xì)胞可以產(chǎn)生AFP。AFP 是診斷這些癌癥的指標(biāo)。AFP在乙型肝炎病毒陽性的肝癌患者中的升高尤為突出。肝癌
月干(Carcinoma, hepatocellular)、生月干(Carcinoma, pleomorphic hepatocellular)、肝細(xì)胞瘤(Hepatoma)。Bid是一種僅含BH3結(jié)構(gòu)域的促細(xì)胞凋亡的Bcl-2家族分子(LuoX，et al.，Bid, a Bcl2 interacting protein, mediates cytochrome c releasefrom mitochondria in response to activation of cell surface death receptors (作為 Bcl2 互作蛋白的 Bid 介導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素c，以應(yīng)答細(xì)胞表面死亡受體的活化)，Cell 1998，94 :481_90 ； Yin XM. Bid, a criticalmediator for apoptosis induced by the activation of Fas/ TNF-Rl deathrec印tors in h印atocytes (Bid是肝細(xì)胞Fas/TNF-Rl死亡受體活化誘導(dǎo)凋 亡中的關(guān)鍵介質(zhì))，J Mol Med 2000 ；78 203-11)。在Fas/TNF-Rl誘導(dǎo)的經(jīng)受體細(xì)胞凋亡 的途徑中，Bid可被CaspaseK又稱FLICE)激活，在Caspase-8的作用下，Bid被切割成 較小但活性較強(qiáng)的tBid。Bid已被認(rèn)為是一種腫瘤抑制分子(Zinkel SS, et al. ,Genes & Development2003,17 229~39 Ji Miao,et al.，Int.J. Cancer,2006，119，1985—1993)。增 加Bid的水平可誘導(dǎo)癌細(xì)胞的死亡進(jìn)而有助于癌癥的治療。概述第一方面提供啟動子，其序列為甲胎蛋白啟動子的片段。第二方面提供制備本發(fā)明的啟動子的方法。第三方面提供載體，所述載體包含一個或多個本發(fā)明的啟動子。第四方面提供構(gòu)建體，包含本發(fā)明的載體以及與所述載體可操作連接的一條或多 條目的序列，其中所述目的序列中的至少一條的轉(zhuǎn)錄受本發(fā)明的啟動子起始。第五方面提供藥物組合物，所述組合物包含本發(fā)明的構(gòu)建體和藥學(xué)上可接受的載 體。第六方面提供本發(fā)明的載體或構(gòu)建體在制備治療癌癥的藥物組合物中的用途。第七方面提供治療癌癥的方法，包括將有效量的本發(fā)明的構(gòu)建體或本發(fā)明的藥物 組合物對個體給藥。附圖簡述

圖1是由人肝組織分離的甲胎蛋白啟動子片段的活性檢測結(jié)果，檢測使用熒光素 酶基因作為報告基因。圖2顯示Ad/AFPtBid對鼠肝內(nèi)腫瘤生長的抑制作用，其中橫坐標(biāo)括號內(nèi)的數(shù)字 表示小鼠數(shù)目。將三種不同的癌癥細(xì)胞接種于鼠肝內(nèi)建立鼠肝腫瘤模型。圖2a使用產(chǎn)生甲胎蛋白的ifep3B細(xì)胞，圖2b使用不產(chǎn)生甲胎蛋白的SK-Ifep-I細(xì)胞及不產(chǎn)生甲胎蛋白的 大腸癌DLD-I細(xì)胞。Ad/AFPtBid可明顯地抑制H印3B細(xì)胞腫瘤的生長(圖2a) (ρ < 0. 05， 方差分析)，但并不抑制SK-Ifep-I細(xì)胞與DLD-I細(xì)胞腫瘤的生長(圖2b)。Ad/AFPtBid與 5-氟尿嘧啶(5-FU)或阿霉素(Dox)聯(lián)合使用，其抑制作用更為顯著(圖2a)。圖3表示甲胎蛋白啟動子片段的核苷酸序列及所用克隆引物的核苷酸序列。
具體實施例方式在本文中，術(shù)語“目的序列，，指任何的多核苷酸序列。目的序列可以轉(zhuǎn)錄成RNA。 轉(zhuǎn)錄后的RNA可以作為反義RNA序列，也可以進(jìn)一步加工成siRNA。當(dāng)目的序列是編碼序列 時，轉(zhuǎn)錄后的RNA還可以被翻譯成氨基酸序列。在本文中，術(shù)語“啟動子”指一段能起始目的序列向RNA轉(zhuǎn)錄的核酸序列。啟動子 被RNA聚合酶識別，從而起始轉(zhuǎn)錄。啟動子一般位于目的序列的上游。將目的序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)編號為+1，并以從 +1逆數(shù)的負(fù)數(shù)編號轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游位點(diǎn)。例如-100代表上游位點(diǎn)100。大部分真核 生物啟動子包含TATA盒，即序列TATAAA，該序列會與TATA結(jié)合蛋白結(jié)合，以協(xié)助形成RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。TATA盒通常接近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，例如距離起始位點(diǎn)50個堿基對以內(nèi)。 真核生物啟動子還可以進(jìn)一步與其它調(diào)節(jié)區(qū)域，例如增強(qiáng)子、沉默子、邊界元件或絕緣子配 合，以調(diào)節(jié)目的序列的轉(zhuǎn)錄水平。在本文中，術(shù)語“載體”指在將目的序列與載體可操作連接之后，能夠使目的序列 轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞并使其轉(zhuǎn)錄的DNA分子，其中如果目的序列是編碼序列，則編碼序列還能 被表達(dá)。在本文中，載體與目的序列可操作連接而得到的制備物為“構(gòu)建體”。載體包括但不限于，病毒載體和質(zhì)粒載體。病毒載體以病毒顆粒的方式，通過病毒 包膜蛋白與宿主細(xì)胞膜的相互作用進(jìn)入細(xì)胞。質(zhì)粒載體則是借助于物理或化學(xué)的作用而導(dǎo) 入細(xì)胞。載體進(jìn)入細(xì)胞之后，或整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體，或以染色體外可自我復(fù)制的附加體 形式存在。在宿主細(xì)胞中，載體或穩(wěn)定地或瞬時地轉(zhuǎn)錄目的序列。在本文中，本發(fā)明的載體衍生自“起始載體”。起始載體的實例是哺乳動物雙 雜交系統(tǒng)，例如 PACT、pBIND、pACT-MyoD、pBIND—Id、pG51uc (Promega Corporation, WI,美國)；腺病毒系統(tǒng)，例如 pAdEasy-1、pShuttle-CMV、pShuttle(Stratagene Inc.，CA，美國)；腺相關(guān)病毒系統(tǒng)，例如 pAAV-MCS、pAAV-RC、pHelper、pAAV-LacZ、 pAAV-IRES-hrGFP、pCMV-MCS (Stratagene Inc.，CA，美國)；哺乳動物表面展示系統(tǒng)，例如 pDisplay (Invitrogen Corporation, CA，美國)；信號通路報告載體，例如 pGAS-TA-Luc、 pSTAT3-TA-Luc、pISRE_TA_Luc、ρTA-Luc> pi κ B-EGFP> pNFAT-TA-Luc (ClontechLabo ratories, Inc.，CA，美國)；逆病毒載體，例如 pLNCX2、pQCXIH、pMSCVpuro (Clontech Laboratories, Inc.，CA，美國)、pLVTH(AddgeneInc.，MA，美國)；慢病毒載體,例如 FUGW、 pCMV-dR8. 91、pCMV-VSV-G、pRSV-rev、pLentilox 3. 7、pMDLg、pRRE、pffPXL(Addgenelnc.， MA，美國)>pLVX-DsRed-Monomer-Nl (Clontech Laboratories, Inc. , CA，美國)、pLPl、pLP2、 pLP VSV-G, pVSV-G(InvitrogenCorporation, CA，美國)；RNAi 載體，例如 pSilencerl. O、 pSilencer 2. 1—U6 hygro、pSilencer 3. I-Hl hygro、pSilencer 3. I-Hl neo、pSilencer 4. I-CMV neo、pSilencer 4. I-CMV puro (Applied Biosystems,)、pSIREN-RetroQ (Clontech Laboratories, Inc.，CA，美國)；熒光蛋白報告載體，例如 pDsRedl-Cl、 pDsRedl-Nl、pDsRED-Monomer-NU pEYFP-Cl、pEYFP-Nl、pEGFP-1、pEGFP-Cl、pEGFP-Nl、 PEGFP-N3, pcDNA-EGFPl (Clontech Laboratories, Inc.，CA，美國)；哺乳動物表達(dá)載體，例 如 pcDNA (Invitrogen Corporation, CA,美國)。在本文中，“可操作連接”意指，例如，啟動子與目的序列的連接允許啟動子起始 目的序列的轉(zhuǎn)錄；再例如，啟動子與終止子的連接允許啟動子所起始的轉(zhuǎn)錄被終止子終止； 又例如，載體與目的序列的連接允許目的序列與啟動子可操作連接，并且允許該啟動子與 終止子可操作連接。在本文中，術(shù)語“一致性”是指比對兩條多核苷酸序列時，所述序列在相應(yīng)核苷酸 位置上具有相同的核苷酸，比對使用例如Blast (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/)。第一方面提供啟動子，其序列為甲胎蛋白啟動子的片段。在一些實施方式中，甲胎蛋白啟動子片段可以是如SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 9 或 SEQ IDNO 12 所示的序列。在另一些實施方式中，甲胎蛋白啟動子片段可以是如SEQ IDNO :4所示的序列。所 述片段還可以是通過對如SEQ ID NO :4所示的序列添加、替換或缺失一個或多個核苷酸而 獲得的具有如SEQ IDNO :4所示序列的啟動子活性的序列。所述片段也可以是與SEQ IDNO 4 所示的序列具有 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%或100% —致性的序列。甲胎蛋白啟動子片段也可以是如SEQ ID NO :6所示的序列。所述片段還可以是通 過對如SEQ ID NO :6所示的序列添加、替換或缺失一個或多個核苷酸而獲得的具有如SEQ ID NO :6所示序列的啟動子活性的序列。所述片段也可以是與SEQ ID NO :6所示的序列具 有 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% — 致性的序列。甲胎蛋白啟動子片段也可以是如SEQ ID NO :8所示的序列。所述片段還可以是通 過對如SEQ ID NO :8所示的序列添加、替換或缺失一個或多個核苷酸而獲得的具有如SEQ ID NO :8所示序列的啟動子活性的序列。所述片段也可以是與SEQ ID NO :8所示的序列具 有 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% — 致性的序列。甲胎蛋白啟動子片段也可以是如SEQ ID NO :10所示的序列。所述片段還可以是通 過對如SEQ ID NO 10所示的序列添加、替換或缺失一個或多個核苷酸而獲得的具有如SEQ ID NO :10所示序列的啟動子活性的序列。所述片段也可以是與SEQ ID N0:10所示的序列 具有 75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 一致性的序列。甲胎蛋白啟動子片段也可以是如SEQ ID NO :11所示的序列。所述片段還可以是通 過對如SEQ ID NO 11所示的序列添加、替換或缺失一個或多個核苷酸而獲得的具有如SEQ ID NO :11所示序列的啟動子活性的序列。所述片段也可以是與SEQ ID N0:11所示的序列 具有 75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 一致性的序列。在特定的實施方式中，添加和替換可以使用具有稀有堿基的核苷酸。稀有堿基是除主要堿基腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶之外的其它堿基，例如其它天然存 在于DNA中的堿基。稀有堿基包括但不限于主要堿基的甲基衍生物，例如5-甲基胞嘧啶和 5_羥甲基胞嘧啶。在一些實施方式中，甲胎蛋白啟動子片段還可以在其中的任何位點(diǎn)具有包括但不 限于硫代修飾的核苷酸。在另一些實施方式中，甲胎蛋白啟動子片段還可以在其5’端具有包括但不限于特 殊標(biāo)記的核苷酸。特殊標(biāo)記的實例是熒光標(biāo)記、生物素標(biāo)記、地高辛標(biāo)記、磷酸化標(biāo)記和放 射性標(biāo)記。熒光標(biāo)記例如使用FAM、ROX和TAMRA。在一些實施方式，本文所述的啟動子特異地在產(chǎn)甲胎蛋白的細(xì)胞中起始目的序列 的轉(zhuǎn)錄，而在正常細(xì)胞中不起作用。產(chǎn)甲胎蛋白的細(xì)胞包括但不限于，哺乳動物例如人的胎 兒肝細(xì)胞，哺乳動物例如人的畸胎瘤、肝癌、睪丸癌、消化道腫瘤和胰腺癌的癌癥細(xì)胞。所 述肝癌的實例是肝細(xì)胞癌、多形性肝細(xì)胞癌和肝細(xì)胞瘤。上述癌癥的細(xì)胞系例如保藏于 美國模式菌種保藏中心(ATCC) (Manassas, VA，美國)，并且具體描述于例如http//www. atcc. org/Portals/l/TumorLines. pdf (將其全部內(nèi)容通過引用并入本文)。所述細(xì)胞系 的實例是 C3A(ATCC 登錄號 CRL-10741)、SNU-398 (ATCC 登錄號 CRL-2233)、SNU-449 (ATCC 登錄號 CRL-2234)、SNU-182 (ATCC 登錄號 CRL-2235)、SNU-475 (ATCC 登錄號 CRL-2236)、 Hep 3B2. 1-7 (ATCC 登錄號 HB-8064)、HepG2 (ATCC 登錄號 HB-8065)、SNU-387 (ATCC 登錄號 CRL-2237)、SNU-423 (ATCC 登錄號 CRL-2238)以及 PLC/PRF/5 (ATCC 登錄號 CRL-8024)等。第二方面提供制備如本發(fā)明的啟動子的方法。在一些實施方式中，制備可以使用全序列合成。例如，使用可商購的DNA全序列合 成儀合成本發(fā)明的啟動子。在另一些實施方式中，制備可以采用分離。分離例如使用擴(kuò)增。擴(kuò)增所用模板可 以是第一方面中的產(chǎn)甲胎蛋白的細(xì)胞的基因組DNA。所述基因組DNA可以是從上述細(xì)胞提 取的基因組DNA，也可以是存在于上述細(xì)胞破碎產(chǎn)物中的基因組DNA。提取例如使用可商購 的DNA提取試劑盒。破碎例如使用可商購的超聲破碎儀或高壓破碎儀。第一方面中的產(chǎn)甲 胎蛋白的細(xì)胞可以是以細(xì)胞系形式存在的細(xì)胞，也可以以組織形式存在的細(xì)胞。擴(kuò)增例如使用PCR。PCR所用引物針對本發(fā)明的啟動子而設(shè)計。引物設(shè)計可以使用 軟件，例如 OLIGO 引物分析軟件(Molecular Biologylnsights, Inc.，C0，美國)和 Primer Premier (Premier Biosoft International，CA，美國)。引物例如是表 1 和圖 3 所示引物。 對于特定的待擴(kuò)增序列、模板和引物，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定PCR溫度和循環(huán)數(shù)。PCR可 以在PCR儀中進(jìn)行，也可以在任何可控溫的設(shè)備例如水浴鍋中進(jìn)行。在特定實施方式中，第一方面中的添加、替換或缺失一個或多個核苷酸可以通過 常規(guī)的定點(diǎn)突變方法完成。第一方面中的硫代修飾和特殊標(biāo)記例如使用可商購的試劑盒完 成。第三方面提供載體，所述載體包含一個或多個本發(fā)明的啟動子。在特定實施方式中，載體還可以包含一個或多個另外的啟動子。所述另外的啟動 子可以在哺乳動物例如人的一種或多種細(xì)胞中起始目的序列的轉(zhuǎn)錄。另外的啟動子的實例 是SV40啟動子、人巨細(xì)胞病毒早期啟動子(CMV-IE)、人延伸因子1-亞基啟動子、Rous肉瘤 病毒基因長末端重復(fù)序列、人泛素C基因啟動子、snRNA啟動子、甲胎蛋白啟動子的全長序列以及上文所列起始載體中的啟動子。在一些實施方式中，載體還可以包含一個或多個其它元件。在某些實施方式中，所 述其它元件是終止子。載體包含一個或多個終止子，以致載體上的每一個啟動子可操作連 接至少一個終止子。所述終止子是至少能夠在第一方面中的產(chǎn)甲胎蛋白細(xì)胞中終止目的序 列轉(zhuǎn)錄的終止子，例如是CMV終止子、SV40終止子、甲胎蛋白終止子以及上文所列起始載體 中的終止子。在某些實施方式中，所述其它元件還可以包括轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生翻譯起始所需序列的多核 苷酸序列。所述翻譯起始所需序列例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)。在特定的技術(shù)方案中，載體還可 以包含轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的多核苷酸序列。在某些實施方式中，所述其它元件還可以包括能夠使目的序列與載體可操作連接 的位點(diǎn)或部分。特別地，載體包含能夠使目的序列插入載體的位點(diǎn)，例如單個限制性酶切位 點(diǎn)或多克隆位點(diǎn)。在某些實施方式中，所述其它元件還可以包括篩選標(biāo)志物序列。篩選標(biāo)志物序列 的實例是胸腺激酶基因、二氫葉酸還原酶基因、抗生素抗性基因和熒光蛋白報告基因。在某些實施方式中，所述其它元件還可以包括復(fù)制元件。復(fù)制元件是至少能夠在 第一方面中的產(chǎn)甲胎蛋白細(xì)胞中復(fù)制載體的復(fù)制元件，例如上文所列起始載體中的復(fù)制原
點(diǎn)ο在某些實施方式中，所述其它元件還可以包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域，例如增強(qiáng)子、沉默 子、邊界元件和絕緣子。在一些實施方式中，本發(fā)明的載體的制備可以通過衍生起始載體來完成。衍生使 起始載體包含一個或多個本發(fā)明的啟動子。衍生可以借助酶切和連接，也可以僅借助連接。 衍生所采用的策略和操作步驟為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在某些實施方式中，通過向起始載體添加一個或多個本發(fā)明的啟動子，或者使用 一個或多個本發(fā)明的啟動子替換起始載體上原有的啟動子來實現(xiàn)衍生。在特定實施方式中，衍生還可以包括向起始載體添加一個或多個本文所述的另外 的啟動子，或者使用一個或多個本文所述的另外的啟動子替換起始載體上原有的啟動子的步驟。在特定實施方式中，衍生還可以包括向起始載體添加一個或多個本文所述的其它 元件，或者使用一個或多個本文所述的其它元件替換起始載體上原有的同類元件的步驟。第四方面提供構(gòu)建體，包含本發(fā)明的載體以及與所述載體可操作連接的一條或多 條目的序列，其中所述目的序列中的至少一條的轉(zhuǎn)錄受本發(fā)明啟動子的起始。在特定實施方式中，所述目的序列中的一條或多條受本文所述的另外的啟動子所 起始。在一些實施方式中，所述多條目的序列可以間隔一個或多個核苷酸。特別地，所述 間隔的多個核苷酸是蛋白酶酶切位點(diǎn)的編碼序列。所述蛋白酶是在哺乳動物細(xì)胞、特別是 人細(xì)胞、更特別是人肝癌細(xì)胞中不喪失活性的蛋白酶。在一些實施方式中，目的序列可以是編碼序列，例如可以是其產(chǎn)物能夠引起細(xì)胞 凋亡、死亡或傷害的序列。特別地，目的序列是促凋亡蛋白編碼序列。促凋亡蛋白包括但不 限于，Bid、tBid、Bad、Bax、Bim和Caspase-7。目的序列的制備可以通過全序列合成或從細(xì)胞分離，并且其制備方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在一些實施方式中，可以通過將目的序列插入本發(fā)明的載體而制備構(gòu)建體。所述 插入例如借助酶切和連接。酶切和連接可以針對本文所述的單個限制性酶切位點(diǎn)或多克隆 位點(diǎn)。在另一些實施方式中，可以通過將目的序列與本發(fā)明的載體直接連接而制備構(gòu)建 體。第五方面提供藥物組合物，所述組合物包含本發(fā)明的構(gòu)建體和藥學(xué)上可接受的載 體。在一些實施方式中，藥物組合物還包含其它治療劑，例如抗癌藥。抗癌藥的實例是 Dox、5-FU 禾口 TNFa。在一些實施方式中，藥學(xué)上可接受的載體例如是與藥物給藥相容的任何溶劑、分 散介質(zhì)、包被物、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等張劑和吸收延遲劑。在一些實施方式中，所述藥物組合物的制備使用例如在美國藥典以及類似參考文 獻(xiàn)中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法。所述藥物組合物可以以各種劑型存在，包括但不限于片劑、丸劑、懸 浮劑、霜劑和糊劑。第六方面提供本發(fā)明的載體或構(gòu)建體在制備治療癌癥的藥物組合物中的用途。第七方面提供治療癌癥的方法，包括將有效量的本發(fā)明的構(gòu)建體或本發(fā)明的藥物 組合物對個體給藥。在一些實施方式中，癌癥是癌癥細(xì)胞能夠產(chǎn)生甲胎蛋白的癌癥，例如是畸胎瘤、肝 癌、睪丸癌、消化道腫瘤和胰腺癌。肝癌包括P53抗性(p53-resistent)的肝癌和p53敏感 的肝癌。肝癌的實例是肝細(xì)胞癌、多形性肝細(xì)胞癌和肝細(xì)胞瘤。上述癌癥的細(xì)胞系例如是 第一方面中的癌癥的細(xì)胞系。在一些實施方式中，所述構(gòu)建體或藥物組合物可以用于例如腸胃外、吸入、局部或 全身性給藥。腸胃外給藥例如靜脈、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、直腸或陰道給藥。吸入給藥例如鼻 內(nèi)或口腔吸入給藥。局部給藥例如向表皮外部、口腔給藥，以及向耳、眼和鼻中以及不顯著 進(jìn)入血流的部位滴注給藥。全身性給藥例如口服、靜脈、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)給藥。在特定實施方 式中，所述構(gòu)建體或藥物組合物可以通過靜脈或皮下給藥。治療有效量是足以誘發(fā)對受治個體的治療性作用的量。治療有效量的變化取決于 給藥途徑、藥學(xué)上可接受的載體以及與其它治療劑或其它治療性療法的可能的共同應(yīng)用。在一些實施方式中，所述構(gòu)建體的治療有效量為MOI不低于10，特別地，所述構(gòu)建 體的MOI為100。在特定實施方式中，所述構(gòu)建體可以使癌細(xì)胞在給藥4天后顯著死亡。在 一些實施方式中，所述構(gòu)建體的治療有效量為不低于IX 109pfu，特別地為lXlOlfu。在一些實施方式中，所述藥物組合物中的其它治療劑，例如Dox、5-FU和TNFa的 治療有效量分別為不低于5ng/ml、不低于5 μ g/ml和不低于lng/ml。特別地，Dox、5-FU和 TNFa的治療有效量分別為50ng/ml、50y g/ml和lOng/ml。在特定實施方式中，所述藥物組 合物可以使癌細(xì)胞在給藥2天后顯著死亡。在另一些實施方式中，所述藥物組合物中的Dox 或5-FU的治療有效量分別為不低于lmg/kg或不低于4mg/kg，特別地為10mg/kg或40mg/
kg ο治療有效量的構(gòu)建體或藥物組合物可以是無副作用的。所述副作用包括但不限于，消化障礙出現(xiàn)的胃腹胞脹、食欲減退、惡心干嘔、腹瀉等；骨髓抑制所出現(xiàn)的白細(xì)胞下 降、血小板減少、貧血；機(jī)體衰弱導(dǎo)致的全身疲乏、四肢無力、精神不振、甚至心慌、氣短、失 眠、出虛汗、口干舌燥及脫發(fā)；以及發(fā)燒，患部疼痛、靜脈炎、口腔炎、食管粘膜充血水腫及潰 瘍等炎癥反應(yīng)。在一些實施方式中，所述構(gòu)建體或藥物組合物可以與例如治療癌癥的其它藥劑或 其它治療性療法聯(lián)用。所述聯(lián)用可以是在同一時間或不同時間下進(jìn)行。以下實施例意在闡述本發(fā)明的實施方案，而不應(yīng)被理解為對發(fā)明范圍的限定。實施例實施例1甲胎蛋白啟動子片段的克隆利用基因組DNA提取試劑盒(QIAGEN，Hilden，德國)，從原發(fā)性肝癌患者的肝癌組 織中提取基因組DNA。利用表1及圖3所示引物的具體位置和序列，通過PCR擴(kuò)增獲得SEQ ID NOs :1-12。所得序列如表1和圖3所示。表1 從人肝癌組織中分離并克隆的甲胎蛋白啟動子的片段
權(quán)利要求
啟動子，其序列為甲胎蛋白啟動子的片段。
2.如權(quán)利要求1所述的啟動子，其中所述甲胎蛋白啟動子的片段選自如SEQID NO :2、 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO 12 所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的啟動子，其中所述甲胎蛋白啟動子的片段選自如SEQID NO :4、 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 10 和 SEQ ID NO 11 所示的序列，或者是通過對選 自如 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:10 禾口 SEQ ID N0:11 所示的序 列添加、替換或缺失一個或多個核苷酸而獲得的具有該序列的啟動子活性的序列。
4.載體，包含一個或多個如權(quán)利要求1-3中任一項所述的啟動子。
5.如權(quán)利要求4所述的載體，其中所述載體衍生自起始載體，優(yōu)選衍生自腺病毒載體、 慢病毒載體和PcDNA載體。
6.如權(quán)利要求4或5所述的載體，還包含一個或多個終止子，以致每一個所述的啟動子 可操作連接至少一個終止子。
7.構(gòu)建體，包含如權(quán)利要求4-6中任一項所述的載體以及與所述載體可操作連接的一 條或多條目的序列，其中所述目的序列中的至少一條的轉(zhuǎn)錄受所述甲胎蛋白啟動子的片段 起始。
8.如權(quán)利要求7所述的構(gòu)建體，其中所述目的序列為促凋亡蛋白的編碼序列，優(yōu)選促 凋亡蛋白Bid或tBid的編碼序列。
9.藥物組合物，包含如權(quán)利要求7或8所述的構(gòu)建體和藥學(xué)上可接受的載體。
10.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，還包含抗癌藥，優(yōu)選包含阿霉素、5-氟尿嘧啶或 TNFa。
11.如權(quán)利要求4-6中任一項所述的載體、或權(quán)利要求7或8所述的構(gòu)建體在制備治療 癌癥的藥物組合物中的用途。
12.如權(quán)利要求11所述的用途，所述癌癥選自睪丸癌、畸胎瘤、消化道腫瘤和胰腺癌， 優(yōu)選肝癌，更優(yōu)選肝細(xì)胞癌、多形性肝細(xì)胞癌和肝細(xì)胞瘤。
全文摘要
本申請涉及甲胎蛋白啟動子，包含所述啟動子的載體，以及包含所述載體的構(gòu)建體及其在治療癌癥中的用途。本申請還涉及藥物組合物及其在治療癌癥中的用途，所述組合物包含所述構(gòu)建體和藥學(xué)上可接受的載體。
文檔編號C12N15/63GK101988057SQ20091016402
公開日2011年3月23日 申請日期2009年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月4日
發(fā)明者賴寶山, 陳功 申請人:香港中文大學(xué)