專利名稱：一種醬香型白酒大曲生產的質量控制方法
技術領域：
本發明涉及一種白酒大曲的質量控制方法，特別是醬香型白酒大曲上產中通過對 優勢菌群的檢測，控制白酒的質量。
背景技術：
大曲是指含有大量能發酵的活微生物或酶類的糖化發酵劑。制曲技術是我國特有 的一份民族遺產，在曲與酒的關系上，曲是占先導地位的。俗語說“有美酒必備佳曲”，“曲為 酒骨”。而且更重要的是關系到香型風味的重要成因。醬香型白酒大曲采用小麥為原料，經粉碎拌水后壓制成磚塊狀的曲坯。在制曲過 程中自然網羅環境中的微生物(或部分來源于母曲)接種，在控制條件下，曲坯中的微生物 彼消此長地生長繁殖，同時在曲坯內伴隨著酶的代謝和物質間的生化演化。因此微生物的 種類很多。然而，自然界中的微生物群體，除了酵母、根霉、曲霉、毛霉等有益菌外，同時也夾 帶著許多對釀酒有害的菌類，影響大曲酒出酒率和優質酒率。此外，自然微生物的種群和數 量常不以人的意志為轉移，從而導致大曲質量的不穩定。優質大曲中的優勢微生物菌群，是決定大曲質量的關鍵，利用PCR-DGGE技術可以 對制曲過程進行監控，可以發現優勢微生物菌群的變化，可以確定本周期曲的質量情況，若 質量下降，可以適時對工藝進行調整，有利于大曲質量的穩定。此方法克服了需要感官和各 種理化指標來進行模糊判斷的大曲鑒定方法。

發明內容
本發明提供一種醬香型白酒大曲生產過程中質量控制方法，該方法通過測定大曲生產過程中的半成品及成品中的DNA DGGE指紋圖譜，控制產 品的質量，符合規定圖譜的半成品及成品，屬于合格產品，反之則為不合格產品。大曲生產過程包括用小麥為原料，經粉碎拌水后壓制成磚塊狀的曲坯，入倉發酵 培養，此時的大曲稱為入倉曲，經過一段時間進行第一次翻倉，得到第一次翻倉曲，再經過 第二次翻倉，得到第二次翻倉曲，出倉時稱為出倉曲。制曲的生產過程如圖5在制曲的每個周期取樣，分別是母曲樣品，入倉曲樣品，一次翻曲樣品，二次翻曲 樣品，和出倉曲。為控制大曲生產過程的質量，本發明抽取在不同生產階段的產品樣品，進行DNA 提取并進行圖譜測定，進而進行質量控制分析。樣品的采集可以采集不同階段的樣品測定， 也可以不同階段的樣品混合在一起測定。為此，本發明提供一種醬香型白酒大曲生產過程中質量控制方法，所述方法包括 以下步驟步驟1，建立標準的合格的生產過程中的大曲樣品的優勢菌群的DGGE標準指紋圖 譜；
步驟2，提取生產過程中大曲樣品的總DNA，進行PCR擴增，測定DGGE指紋圖譜；步驟3，比較上述兩個圖譜，符合屬于合格產品，反之則為不合格產品。其中步驟1的測定方法如下1)取大曲不同生產階段的合格樣品；幻提取總DNA;3)以總DNA為模板，在專用引物的引導下進行PCR擴增；4)對目的片段進行變性梯度凝膠電泳，EB染色后得到DGGE標準指紋圖譜；其中步驟2的測定方法如下1)取大曲不同生產階段的合格樣品；2)提取待測樣品的總DNA ；3)以待測樣品的總DNA為模板，在專用引物的引導下進行PCR擴增；4)對目的片段進行變性梯度凝膠電泳，EB染色后得到DGGE指紋圖譜；其中所述提取總DNA，包括提取待測樣品中真菌的總DNA和細菌的總DNA，真菌DNA提取方法是提取緩沖液提取兩次；氯仿抽提一次；異丙醇沉淀過夜；離 心。其中提取緩沖液的加量是樣品量的3-6倍，所加氯仿的體積與上清液的體積相同，異丙 醇加量是上清液體積的0. 6-0. 7倍。細菌DNA提取方法提取緩沖液提取一次；加蛋白酶K和溶菌酶；氯仿抽提兩次； 異丙醇沉淀過夜。其中提取緩沖液的加量是樣品量的10-25倍，20mg/mL蛋白酶K和25mg/ mL溶菌酶的加量分別是50-100μ 1和0. 5_lml，氯仿加量與上清液相同，異丙醇加量是上清 液體積的0. 6-0. 7倍。所述專用引物，對于真菌總DNA的PCR擴增，其專用引物為GeoA2 5' -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3 ‘和 Geoll :5 ‘ -ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3 ‘。PCR 擴增條件為巢式PCR擴增先加入擴增18S rDNA全長的引物和反應體系進行第一步擴增； PCR反應條件為94°C預變性4min，然后在94°C變性45s, 50°C _55°C引物復性45s，72°C引 物延伸1. 5min，循環30次，72°C終延伸IOmin ；取其產物進行100倍稀釋后作為模板，以16S rDNA V3可變區為目標進行擴增，PCR反應條件為94°C預變性％iin，然后在94°C變性45s， 50-55°C引物復性45s，72°C引物延伸lmin，循環30-35次，72°C終延伸IOmin0對于細菌總DNA的PCR擴增，其專用引物為8-27F :5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，和 1378-1401R :5’-TACCTTGTTACGACTT-3，。PCR 擴 增條件為巢式PCR擴增先加入擴增16S rDNA全長的引物和反應體系進行擴增；PCR反 應條件為94°C預變性％iin，然后在94°C變性45s，50°C -55°C引物復性45s，72°C引物延 伸1.5min，循環30次，72°C終延伸IOmin ；取其產物進行100倍稀釋后作為模板，以16S rDNA V3可變區為目標進行擴增，PCR反應條件為94°C預變性％iin，然后在94°C變性45s， 50-55°C引物復性45s，72°C引物延伸lmin，循環30-35次，72°C終延伸IOmin0所述4)中，是對經過純化的目的片段進行變性梯度凝膠電泳(DGGE)，銀染后得到 DGGE指紋圖譜；所述DGGE標準指紋圖譜，是跟蹤制曲生產過程，總結優質大曲生產過程中的 PCR-DGGE譜圖，得出標準譜圖。通過真菌和細菌的PCR-DGGE譜圖，就可以比較準確的確定曲的質量，有利于指導生產。


圖1醬香白酒制曲過程中優勢細菌的PCR-DGGE標準譜2醬香白酒制曲過程中優勢真菌的PCR-DGGE標準譜3樣品真菌的PCR-DGGE譜4樣品細菌的PCR-DGGE譜5制曲的生產流程
具體實施例方式以下通過實施例進一步說明本發明，但不作為對本發明的限制。實施例1取一個生產周期的某一倉的大曲樣品入倉曲，第一次翻倉曲，第二次翻倉曲，出 倉曲ο首先提取待測樣品中真菌的總DNA和細菌的總DNA，真菌DNA提取方法是提取緩沖液提取兩次；氯仿抽提一次；異丙醇沉淀過夜；離 心。其中提取緩沖液的加量是樣品量的3-6倍，所加氯仿的體積與上清液的體積相同，異丙 醇加量是上清液體積的0. 6-0. 7倍。對于真菌總DNA的PCR擴增，其專用引物為 5' -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3 ‘和 Geoll :5 ‘ -ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3 ‘。PCR 擴增條件為巢式PCR擴增先加入擴增18S rDNA全長的引物和反應體系進行第一步擴增； PCR反應條件為94°C預變性4min，然后在94°C變性45s, 50°C _55°C引物復性45s，72°C引 物延伸1. 5min，循環30次，72°C終延伸IOmin ；取其產物進行100倍稀釋后作為模板，以16S rDNA V3可變區為目標進行擴增，PCR反應條件為94°C預變性％iin，然后在94°C變性45s， 50-55°C引物復性45s，72°C引物延伸lmin，循環30-35次，72°C終延伸IOmin0基因組DNA的純化方法為采用美國OMEGA BIO-TEK公司生產的PCR產物純化試劑 盒，按照用戶使用說明來進行。真菌的PCR擴增及產物回收、純化對純化后的DNA進行PCR擴增，第一步擴增采用的引物為GeoA2 5 ‘ -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3‘和 Geo11 5 ‘ -ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3‘第二步擴增采用的引物為NS31-GC:5' -CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGC ACGGGGGTTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC-3‘ Glol 5' -GCCTGCTTTAAACACTCTA-3‘。以上引物全部由上海生工生物工程技術有限公司合成。先加入擴增18S rDNA全長的引物和反應體系進行第一步擴增，50 μ 1的PCR反 應體系組成如下=IOng的DNA模板(一般用1 μ 1)、50pmol每種引物、1 μ 1 dNTPs、5 μ 1的 10 X PCRbuffer、2. 5mmol/L 的 MgCl2U. 5-3U 的 Taq DNA 聚合酶，適量的雙蒸水補足 50 μ 1。 PCR反應條件為94°C預變性％iin，然后在94°C變性45s，50°C引物復性45s，72°C引物延伸 1. 5min，循環30次，72°C終延伸IOmin ；取其產物進行100倍稀釋后作為模板，以18S rDNA 為目標進行擴增，PCR反應條件為94°C預變性％iin，然后在94°C變性45s，55°C引物復性45s，72°C引物延伸lmin，循環35次，72°C終延伸IOmin, 18S rDNA全長序列擴增產物用 1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測；取其產物進行100倍稀釋后作為模板，以18S rDNA為目標進行 擴增，PCR反應條件為94°C預變性4min，然后在94°C變性45s，55°C引物復性45s，72°C引 物延伸lmin，循環35次，72°C終延伸lOmin，目的產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳緩 沖液為IX TAE緩沖液。取全部樣品進行2%瓊脂糖凝膠電泳(80V，50min)，在紫外燈下切膠回收230bp的 目的條帶，用CyCle-Pure DNA純化試劑盒并按照試劑盒說明書對目的片段進行純化，純化 后取3ul純化產物進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果表明獲得了純度較高的目的 片段。真菌變性梯度凝膠電泳(DGGE)及凝膠成像掃描與分析采用DCODE 系統(BIO-RAD)構建DGGE指紋圖譜，具體方法為將獲得的樣品的 18S擴增純化產物(約230bp)混合，取200ng用10 %變性聚丙烯酞胺凝膠電泳進行分離 (丙烯酞胺濃度35-60%,電泳緩沖液0. 5 χ TAE, 80V，IOh)，然后切下目的泳道區域，用E. B 對變性聚丙烯酞胺凝膠染色，用Vilber凝膠成像掃描系統對銀染條帶進行照像，得到真菌 的PCR-DGGE譜圖結果如圖3所示，從圖3中可以看出，本倉中曲的生產過程中真菌的優勢菌群變化跟標準譜圖是一 致的，說明本倉生產過程中真菌的變化是正常的，曲的質量是達標的。細菌DNA提取方法提取緩沖液提取一次；加蛋白酶K和溶菌酶；氯仿抽提兩次； 異丙醇沉淀過夜。其中提取緩沖液的加量是樣品量的10-25倍，20mg/mL蛋白酶K和25mg/ mL溶菌酶的加量分別是50-100μ 1和0. 5_lml，氯仿加量與上清液相同，異丙醇加量是上清 液體積的0. 6-0. 7倍。以待測樣品的總DNA為模板，在專用引物的引導下進行PCR擴增，擴增結束后，對 目的片段進行回收及純化。總DNA的提取及純化稱取5g 樣品置 50ml 的三角瓶中，加 13. 5mL DNA 的 extraction buffer，加 20mg/ mL的蛋白酶KlOOul，25mg/mL的溶菌酶1ml，37 °C，225rpm，水平搖動30min，搖完后加入 4. 5ml 10%的SDS (加量是總體積的3% )，65°C水浴保育2h，每15-20min，緩慢搖動一次， 盡量打散，然后8000轉室溫離心lOmin，收集上清液，轉到50ml離心管中，加入相同體積 的氯仿，離心收集水相，加0.6倍體積的異丙醇，-20°C沉淀過夜，然后12000轉4°C離心 20min，收集沉淀，用70%冷乙醇沖洗(洗后離心才能去上清液)，吹干，用IXTE懸浮，定容 到 20-40ul。基因組DNA的純化方法為采用美國OMEGA BIO-TEK公司生產的PCR產物純化試劑 盒，按照用戶使用說明來進行。3、PCR擴增及產物回收、純化對純化后的DNA進行PCR擴增，第一步擴增采用的引物為8-27F 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘和 1378-1401R :5 ‘ -TACCTTGTTACGACTT-3 ‘。第二步擴 增采用的引物為:968FGC 5' -CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCGGGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3，禾口 R1041 :5，-CGGTGTGTACAAGACCC-3，，以上引物全部由上海 生工生物工程技術有限公司合成。先加入擴增16S rDNA全長的引物和反應體系進行第一步擴增，50 μ 1的PCR反應體系組成如下10ng的DNA模板(一般用1 μ 1)、50pmol每種引 物、1μ 1 dNTPs、5y 1 的 10XPCRbuffer、2. 5mmol/L 的 MgCl2、3U 的 iTaq DNA聚合酶，適量的 雙蒸水補足50μ 1。PCR反應條件為94°C預變性％iin，然后在94°C變性45s，50°C引物復 性45s，72°C引物延伸1. 5min，循環30次，72°C終延伸IOmin ；取其產物進行100倍稀釋后 作為模板，以16S rDNA V3可變區為目標進行擴增，PCR反應條件為94°C預變性％iin，然 后在94°C變性45s，55°C引物復性45s，72°C引物延伸lmin，循環35次，72°C終延伸IOmin, 16S rDNA全長序列擴增產物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測；取其產物進行100倍稀釋后作 為模板，以16S rDNA V3可變區為目標進行擴增，PCR反應條件為94°C預變性％iin，然后在 94°C變性45s，55°C引物復性45s，72°C引物延伸lmin，循環35次，72°C終延伸IOmin,目的 產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳緩沖液為IXTAE緩沖液。將各樣品16S rDNAv3區擴增純化產物在10%聚丙烯變性膠中分離(丙烯酞胺濃 度 35% -60%，電泳緩沖液 0. 5-1 χ TAE)，100V, 12h，樣品點樣量 200ng DNA0跑樣結束后，用快E. B染法對其進行染色。在vilber凝膠成像掃描系統中對染色 條帶進行照像，得到細菌的PCR-DGGE譜圖如圖4圖4中可以看出，本倉曲的生產過程中，細菌的優勢菌群PCR-DGGE譜圖跟標準譜 圖基本一致，此生產過程中細菌的優勢菌群是達標的。
權利要求
1.一種醬香型白酒大曲生產過程中質量控制方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟步驟1，建立標準的合格的生產過程中的大曲樣品的優勢菌群的DGGE標準指紋圖譜；步驟2，提取生產過程中大曲樣品的總DNA，進行PCR擴增，測定DGGE指紋圖譜；步驟3，比較上述兩個圖譜，符合屬于合格產品，反之則為不合格產品。
2.權利要求1的質量控制方法，其特征在于，其中步驟1的測定方法如下1)取大曲不同生產階段的合格樣品；2)提取總DNA；3)以總DNA為模板，在專用引物的引導下進行PCR擴增；4)對目的片段進行變性梯度凝膠電泳，EB染色后得到DGGE標準指紋圖譜。
3.權利要求1的質量控制方法，其特征在于，其中步驟2的測定方法如下1)取大曲不同生產階段的合格樣品；2)提取待測樣品的總DNA；3)以待測樣品的總DNA為模板，在專用引物的引導下進行PCR擴增；4)對目的片段進行變性梯度凝膠電泳，EB染色后得到DGGE指紋圖譜；
4.權利要求1的質量控制方法，其特征在于，其中所述提取總DNA，包括提取待測樣品 中真菌的總DNA和細菌的總DNA。
5.權利要求4的質量控制方法，其特征在于，其中真菌DNA提取方法是提取緩沖液提 取兩次；氯仿抽提一次；異丙醇沉淀過夜；離心，其中提取緩沖液的加量是樣品量的3-6倍， 所加氯仿的體積與上清液的體積相同，異丙醇加量是上清液體積的0. 6-0. 7倍，細菌DNA提取方法提取緩沖液提取一次；加蛋白酶K和溶菌酶；氯仿抽提兩次；異丙 醇沉淀過夜，其中提取緩沖液的加量是樣品量的10-25倍，20mg/mL蛋白酶K和25mg/mL溶 菌酶的加量分別是50-100 μ 1和0. 5-lml，氯仿加量與上清液相同，異丙醇加量是上清液體 積的0. 6-0. 7倍。
6.權利要求1的質量控制方法，其特征在于，其中所述專用引物，對于真菌總 DNA 的 PCR 擴增，其專用引物為 GeoA2 5 ‘ -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3 ‘和 Geoll 5' -ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC-3‘，PCR擴增條件為巢式 PCR擴增先加入擴增 18S rDNA 全長的引物和反應體系進行第一步擴增；PCR反應條件為94°C預變性％iin，然后在94°C變 性45s，50°C _55°C引物復性45s，72°C引物延伸1. 5min，循環30次，72°C終延伸IOmin ；取 其產物進行100倍稀釋后作為模板，以16S rDNA V3可變區為目標進行擴增，PCR反應條件 為94°C預變性4min，然后在94°C變性45s，50_55°C引物復性45s，72°C引物延伸lmin, ff 環 30-35 次，72°C終延伸 IOmin0
7.權利要求1的質量控制方法，其特征在于，其中對于細菌總DNA的PCR擴增，其專用 引物為 8-27F :5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，和 1378-1401R :5，-TACCTTGTTACGACTT-3，， PCR擴增條件為巢式PCR擴增先加入擴增16S rDNA全長的引物和反應體系進行擴增；PCR 反應條件為94 V預變性％iin，然后在94 °C變性45s，50 V -55 V弓丨物復性45s，72 °C引物 延伸1. 5min，循環30次，72°C終延伸IOmin ；取其產物進行100倍稀釋后作為模板，以16S rDNA V3可變區為目標進行擴增，PCR反應條件為94°C預變性％iin，然后在94°C變性45s， 50-55°C引物復性45s，72°C引物延伸lmin，循環30-35次，72°C終延伸IOmin0
8.權利要求2或3的質量控制方法，其特征在于，其中所述4)中，是對經過純化的目的 片段進行變性梯度凝膠電泳(DGGE)，銀染后得到DGGE指紋圖譜；
9.權利要求1的質量控制方法，其特征在于，所述DGGE標準指紋圖譜，是跟蹤制曲生產 過程，總結優質大曲生產過程中的PCR-DGGE譜圖，得出標準譜圖。
10.權利要求1的質量控制方法，其特征在于，其中步驟1的測定方法如下通過真菌 和細菌的PCR-DGGE譜圖，就可以比較準確的確定曲的質量，有利于指導生產。
全文摘要
本發明涉及一種白酒大曲的質量控制方法，特別是醬香型白酒大曲上產中通過對優勢菌群的檢測，控制白酒的質量。
文檔編號C12Q1/68GK102071124SQ20091022870
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月25日 優先權日2009年11月25日
發明者張春輝, 李季, 李長文, 梁慧珍, 閆希軍 申請人:貴州仁懷茅臺鎮金士酒業有限公司