專利名稱：一種同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株和變異株的試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明屬于動物保護和質檢領域，涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒 及其檢測方法，尤其涉及一種豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
2006年夏秋季節，江西、湖南、湖北、安徽及江蘇南京、無錫、揚州、蘇州等國內主 要養豬地區都會發生一種以高熱、食欲下降、呼吸困難和繁殖障礙為主要特征的傳染病，由 于病原尚未明確，根據病豬體溫升高的臨床特點，將該病稱為“豬無名高熱”或豬“高熱病” 等。高熱病廣泛蔓延，流行數月。13 25周齡的生長育肥豬多發。發病率10% 80%不 等，死亡率20% 50%不等。共同癥狀表現為體溫40. 5°C以上高燒不退，呼吸急促、咳嗽 或流鼻涕，多數病豬皮膚潮紅。不同豬群尚表現便秘、腹瀉、肢體麻痹、母豬流產和口鼻腔流 血等。所有病死豬都以表現嚴重的肺炎病變為典型特征，全身淋巴結水腫、出血，肝臟腫大 或有壞死點，脾臟腫大，皮下出血，胸腔和腹腔積水，胃底和小腸粘膜出血，心臟冠狀溝出血 點，心包積液及膀胱粘膜出血點或斑等。以磺胺藥為主或單純地當藍耳病、流感、豬瘟來防 治，結果均較差，對癥治療效果亦不佳。此次疫病的流行和發生給我國養豬業造成了巨大經 濟損失，一些疫情嚴重的地區豬存欄量減少60%以上，不少中小型豬場因此而倒閉。此次疫 情的流行造成病死及淘汰豬數量達數千萬頭，這對中國的養豬業而言不能不說確是一場災 難，這次災難造成的損失要遠大于1996年的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(藍耳病)(PRRSV) 和2002年豬圓環病毒2型感染所致的斷奶后多系統衰竭綜合征(PMWS)，并引起了國務院、 農業部和社會的高度關注，而且世界動物衛生組織(OIE)及國外獸醫界都投予了注視的目 光。2007年1月，豬“高熱病”主要病原最終確定為變異PRRSV(NSP2 1594 1680變異株)， 并定名為高致病性豬藍耳病。PRRSV變異株NSP2基因的第483位和535-563位氨基酸發生 缺失。目前臨床診斷豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)變異株和經典株的方法主要 是采用RT-PCR，主要可分為兩大類。一類是是分步檢測，一次只能檢測其中一種，譬如， 中國動物疫病預防控制中心的專利“豬繁殖與呼吸綜合征病毒超強變異株RT-PCR試劑 盒” [200710086548]，這類方法重復操作、耗時較長、實驗成本較高，容易帶入人為誤差，不 適合基層應用等特點。另一類是鑒別RT-PCR的方法，譬如，郝曉芳等建立的以NSP2為唯 一檢測目的基因，以目標條帶擴增大小為標準來鑒別PRRSV變異株和經典株[高致病性豬 繁殖與呼吸綜合征病毒RT-PCR鑒別診斷方法的建立，中國預防獸醫學報；2007，29(5) 704-709.]，何丹等建立的二重PCR診斷豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲株與NSP2變異株 [豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲株與NSP2變異株二重PCR診斷方法的建立及應用，廣西農 業科學2009，40 (1) 84-87.]，這類方法以NSP2為唯一檢測目的基因，但是NSP2是PRRSV基 因組中的高變區，存在較高的變異性，給實驗結果帶來潛在的不穩定性。非結構蛋白NSP9在不同PRRSV間同源性超過97. 5%，具有較高的保守性，可以作
4為PRRSV診斷的目的基因。本研究針對NSP2和NSP9基因序列設計兩對引物，建立一種一 次反轉錄后多重PCR鑒定區分PRRSV變異株和經典株的方法。通過實驗證明該方法具有敏 感性高、特異性好的特點，是一種快速準確檢測PRRSV的方法。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種能準確、快速、靈敏、結果易于判讀的用于 同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株和變異株的引物對。本發明還要解決的技術問題是提供包含上述引物對的同時檢測豬繁殖與呼吸綜 合征病毒經典株和變異株的試劑盒。本發明最后要解決的技術問題是提供采用上述試劑盒同時檢測豬繁殖與呼吸綜 合征病毒經典株和變異株的方法。為解決上述技術問題，本發明的思路如下目前臨床RT-PCR診斷豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株，主要是針對0RF7 (N蛋白) 設計的引物，而RT-PCR診斷豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株，則需要針對NSP2基因，兩者 在基因上距離約13-14kb，而常見的反轉錄酶只能有效擴增8kb左右，所以無法一次反轉錄 后同時檢測變異株和經典株。非結構蛋白NSP9在不同PRRSV間同源性超過97.5%，具有較 高的保守性，可以代替0RF7作為PRRSV診斷的目的基因。而且0RF7在基因組上距離NSP2 約6kb，常見反轉錄酶能夠達到這個長度。本研究針對NSP2和NSP9基因序列設計兩對引 物，建立一種一次反轉錄后多重PCR鑒定區分PRRSV變異株和經典株的方法。通過實驗證 明該方法具有敏感性高、特異性好的特點，是一種快速準確檢測PRRSV的方法。本發明采用的技術方案如下一種用于同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)經典株和變異株的引物對， 如 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 所示的核苷酸序列。一種同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)經典株和變異株的試劑盒，包括 如 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO 4 所示的引物對。一種同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)經典株和變異株的試劑盒，包 括(1)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)變異株陽性對照細胞滅活毒和豬繁殖與呼 吸綜合征病毒(PRRSV)經典株陽性對照細胞滅活毒；(2)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)變異株和經典株特異性引物對針對NSP2基因上游引物Pl -M SEQ IDNO 1所示；下游引物P2 如SEQ ID NO 2所示；針對NSP9基因上游引物P3 如SEQ IDNO 3所示；下游引物P4 如SEQ ID NO 4所示；(3) RNA 提取試劑由 Trizol 12mL,無菌 DEPC 水 500 μ L, RNA 酶抑制劑 24 μ L 組 成；(4) RT-PCR反應試劑由RT反應液200 μ L，其中含反轉錄引物序列RT引物如SEQ ID NO :4 所示，RNA 酶抑制劑 24 μ L，AMV 反轉錄酶 12 μ L，5 Xbuffer 60 μ L, dNTP25y L, 2 X PCR Master Mix 200 μ L 組成；
(5)電泳檢測試劑由50 X TAE電泳緩沖液20mL, GoldView 100 μ L組成。利用上述試劑盒同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株和變異株的方法，包括 如下步驟(I)RNA 的提取(Ia)取待檢組織0. 5g，置于勻漿器或者研缽研碎后用1. 5mL D-Hanks液稀釋；取 已研磨好的待檢組織液，置1. 5mL滅菌離心管中，6000rpm離心5min ；(Ib)取步驟(Ia)離心得到的上清液300yL于1.5mL滅菌離心管中，加入ImL Trizol混勻，室溫下放置IOmin ；再加入200 μ L氯仿混勻，室溫下放置2min ；(Ic)將步驟(Ib)的滅菌離心管12000rpm離心lOmin，取600 μ L上層水相到另一 1.5mL滅菌離心管中，加入600 μ L異丙醇混勻，室溫下放置IOmin ；(Id)將步驟(Ic)的滅菌離心管12000rpm離心lOmin，去上清，加入_20°C預冷的 75 % (ν/ν)乙醇溶液500 μ L，旋渦震蕩混勻，7500rpm離心3min ；(Ie)去除步驟(Id)離心后的上清，37°C干燥，用30 μ L DEPC水溶解即用或_70°C 保存；(2)反轉錄取16 μ L mRNA 和如 SEQ ID NO 4 所示的 RT 引物 25pmol/U，0. 5 μ L 混勻于 PCR管中，放于PCR儀中65°C IOmin立即冰浴5min，再加入如下試劑5Xbuffer 5μ L, dNTP2 μ L, RNA酶抑制劑O. 5 μ L、AMV反轉錄酶0. 5 μ L，置PCR儀中50°C反轉錄lh，95°C 3min滅活反轉錄酶后，_20°C保存備用；(3) PCR 25口1^體系2\卩0 Master Mix 12. 5μ L ；ddH20 6.5 yL;上游引物 Pl 1 μ L ； 下游引物Ρ2 IyL;上游引物Ρ3 1^1^下游引物？4 1 μ L和模板(即步驟2的反轉錄 產物)2μ L ;PCR 反應條件95°C 3min ；94 °C 30s, 60 °C 30s, 72 °C 4 Os，35 個循環；72°C 8min ；(4)瓊脂糖凝膠電泳準確稱取0. 3g瓊脂糖，加入20mL TAE置錐形瓶于微波爐中完全溶解后加入核酸 染料GoldView 6. Ομ L并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后將PCR擴增產物取8μ L點于已 凝固的瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm電壓于TAE中電泳Ih ；(5)判斷結果如果擴增出約680bp和380bp特異性兩條片段，則表明待檢組織豬繁殖與呼吸綜 合征病毒(PRRSV)變異株陽性；如果僅擴增出了約380bp特異性片段，則表明待檢組織豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV)經典株陽性；如果沒有擴增出片段，則表明待檢組織豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)陰性。有益效果由于本發明采用的引物來自PRRSV不同基因中高度保守的區域，采用 該引物對能準確、快速、方便的判別病料中是否含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株和經 典株，靈敏度達IO2TCID5tl ；本研究針對NSP2和NSP9基因序列設計兩對引物，建立一種一次 反轉錄后多重PCR鑒定區分PRRSV變異株和經典株的方法。通過實驗證明該方法具有敏感 性高、特異性好的特點，是一種快速準確檢測PRRSV的方法。


圖1為特異性試驗電泳圖。其中，M:DL2000，1 :PRRSV變異株，2 :PRRSV經典株，3 陰性對照。圖2為退火溫度選擇試驗電泳圖。其中，1 :62°C，2 :60°C，3 :58°C，4 :56°C，5 54°C，6 陰性對照，M :DL2000。圖3 為敏感性試驗電泳圖。其中，M :DL2000,1 =IO4TCID50, 2 =IO3TCID50, 3 IO2TCID5。，4 =IO1TCID5。，5 IOciTCID5。，6 陰性對照。圖4為已知陽性病料驗證試驗電泳圖。其中，M :DL2000,1 6 :PRRSV變異株陽性 病料，7:陰性對照。
圖5為已知陽性病料驗證試驗電泳圖。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1 試劑盒的制備。1病毒株1. 1陰性對照樣品的制備取滅菌的DEPC水，置_20°C冰箱保存。1. 2豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株陽性對照樣品的制備1. 2. IRPMI-1640 培養基的配制RPMI-1640 粉一袋(10. 4g，購自 Invitrogen 公司)，溶于 IOOOmL 三蒸水中，加 Hepes 5. 96g，丙酮酸鈉0. llg, NaHCO3 2. 2g，攪拌充分溶解后，N2正壓濾過除菌，4°C保存備用。1. 2. 2細胞培養用試劑的配制(一)雙抗稱取青霉素lg，鏈霉素6.42g，溶于160mL雙蒸水，0. 22 μ m濾菌器濾 過除菌，分裝后-20°C保存備用。(二)0.2%胰酶溶液稱取胰蛋白酶0. 2g，溶解于IOOmL雙蒸水中，0.22 μ m濾菌 器過濾除菌，-20°C保存備用。(三)PBS緩沖液稱取氯化鈉 8. Og,氯化鉀 0. 2g，Na2HPO4 · 12H20 5. 367g， KH2PO4O. 2g，溶于IOOOmL雙蒸水，分裝后高壓滅菌，4°C保存備用。1. 2. 3病料的采集和處理無菌采集疑似高熱病發病豬場送檢的血液和脾臟、肺臟、淋巴結等組織，冷藏保 存，及時處理。血液離心后收集血清，無菌分裝成至少3等份，每份不少于0.5mL，編號 后-70°C保存備用；實質臟器剪碎，用玻璃研磨器研磨后加入MEM培養基稀釋至1 10的 懸液，-20°C和室溫反復凍融2次，加雙抗及兩性霉素，3000r/min離心lOmin，取上清用 0. 45 μ m微孔濾器除菌，同上分裝，編號后-70°C保存備用。1.2. 4細胞培養將培養好的Marc-145細胞用胰酶消化，用加入10%胎牛血清、適量的雙抗及兩性霉素的RPMI-1640培養基重懸至適當濃度，接種于24孔板，置37°C、5% C02條件下培養。1.2. 5病毒分離用Mcar-145細胞進行病毒分離Marc_145細胞放入37°C、5% CO2條件下培養2d 長成單層后，吸棄培養基，用PBS緩沖液洗兩遍，然后將濾過的病料懸液接種于Marc-145細 胞上，每個樣品接種4個孔，接種量為100 μ L/孔，同時做陽性對照孔，各孔補充50 μ L無血 清的培養基，封好放入CO2培養箱中吸附60min。之后取出，棄除上清，加入0. 5mL的含2% 血清的維持液，重新置于37°C、5% CO2條件下培養，48h后觀察細胞病變，之后每天觀察細 胞，將出現病變的細胞培養孔做上標記。5 6d后將培養板放入-20°C凍存，第二天取出將 出現病變以及未出現病變的細胞培養液都收獲，分裝-70°C保存備用。1. 2. 6病毒的RT-PCR初步鑒定用北京世紀元亨動物防疫技術有限公司生產的PRRSV(NSP21594-1680變異株) RT-PCR檢測試劑盒檢測1. 2. 5獲得的細胞毒，操作方法和結果判斷按照試劑盒說明書進 行。1. 2. 7PCR產物回收測序與序列分析利用小量膠回收試劑盒純化PCR產物，然后按常規方法克隆于T載體，由大連寶生 生物工程公司測序，用Vector NTI和DNAStar軟件分析所插入的基因序列。NSP2蛋白的 第482位和533-561位氨基酸發生缺失29個氨基酸的確定為豬繁殖與呼吸綜合征病毒變 異株。1. 2. 8豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株滅活苗的制備取1. 2. 7鑒定的豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株1000 μ L，加入5 μ L甲醛溶液， 37°C作用12小時以上，-20攝氏度保存備用。1. 3豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株陽性對照樣品的制備1. 3. 1按照1. 2. 1至1. 2. 5方法操作分離病毒，_20°C保存備用；1. 3. 2病毒的RT-PCR初步鑒定用北京世紀元亨動物防疫技術有限公司生產的PRRSV(NSP2 1594-1680變異株) RT-PCR檢測試劑盒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-PCR檢測試劑盒檢測1. 3. 2獲得的細胞 毒，操作方法按照試劑盒說明書進行。PRRSV (NSP2 1594-1680變異株)RT-PCR檢測試劑盒 檢測陰性，豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-PCR檢測試劑盒檢測陽性的毒株確定為豬繁殖與 呼吸綜合征病毒經典株陽性。1. 3. 3豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株滅活苗的制備取1. 2. 7鑒定的豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株1000 μ L，加入5 μ L甲醛溶液， 37°C作用12小時以上，-20攝氏度保存備用。2試劑盒中其他成分的制造2. ITrizol 的制備購自Invitrogen 公司，200mL/ 瓶。2. 2RNA酶抑制劑的制備購自Takara 公司，10 μ L/管，50U/μ L。2. 3無菌DEPC水的制備
購自 Takara 公司，ImL/ 管。
取無水乙醇750mL，加入DEPC水250mL，混勻。2. 5AMV反轉錄酶的制備購自Promega 公司，100 μ L/ 管，IOU/ μ L。2. 62 X PCP master Mix 的制備購自南京博爾迪生物科技有限公司，ImL/管。2. 750 X TAE電泳緩沖液的制備0. 5mol/L乙銨四乙酸二鈉((EDTA)溶液(pH8. 0)配制EDTA18. 61g滅菌雙蒸水80mL氫氧化鈉調pH至8. 0滅菌雙蒸水加至100mL。50 X T AE電泳緩沖液配制三羥甲基氨基甲烷(Tris)242g冰乙酸57. ImL0. 5mol/L EDTA 溶液(ρΗ8· 0) IOOmL滅菌雙蒸水加至lOOOmL。使用時滅菌雙蒸水稀釋50倍。2. 8Glodview核酸染料的制備購自上海賽百盛基因技術有限公司，ImL/管。2. 9上樣緩沖液的制備購自南京博爾迪生物科技有限公司，ImL/管。2. 10引物的制備引物由上海英俊合成，20D/管實施例2:檢測方法。利用實施例2的試劑盒同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)經典株和變異 株的方法，包括如下步驟(I)RNA 的提取(Ia)取待檢組織0. 5g，置于勻漿器或者研缽研碎后用1. 5mL D-Hanks液稀釋；取 已研磨好的待檢組織液，置1. 5mL滅菌離心管中，6000rpm離心5min ；(Ib)取步驟(Ia)離心得到的上清液300yL于1.5mL滅菌離心管中，加入ImL Trizol混勻，室溫下放置IOmin ；再加入200 μ L氯仿混勻，室溫下放置2min ；(Ic)將步驟(Ib)的滅菌離心管12000印111離心101^11，取60(^1^上層水相到另一 1.5mL滅菌離心管中，加入600 μ L異丙醇混勻，室溫下放置IOmin ；(Id)將步驟(Ic)的滅菌離心管12000rpm離心lOmin，去上清，加入_20°C預冷的 75 % (ν/ν)乙醇溶液500 μ L，旋渦震蕩混勻，7500rpm離心3min ；(Ie)去除步驟(Id)離心后的上清，37°C干燥，用30 μ L DEPC水溶解即用或_70°C 保存；(2)反轉錄
9
取16 μ L mRNA 和如 SEQ ID NO 4 所示的 RT 引物 25pmol/U，0. 5 μ L 混勻于 PCR管中，放于PCR儀中65°C IOmin立即冰浴5min，再加入如下試劑5Xbuffer 5μ L, dNTP2 μ L, RNA酶抑制劑0· 5 μ L、AMV反轉錄酶0. 5 μ L，置PCR儀中50°C反轉錄lh，95°C 3min滅活反轉錄酶后，_20°C保存備用；(3) PCR 25口1^體系2父？0 Master Mix 12. 5μ L ；ddH20 6.5 yL;上游引物 Pl 1 μ L ； 下游引物Ρ2 IyL;上游引物Ρ3 1仏；下游引物？4 1 μ L和模板(即步驟2的反轉錄產 物)2 μ L ；PCR 反應條件95°C 3min ； 94 °C 30s, 60 °C 30s, 72 °C 40s，35 個循環；72 °C 8min ；(4)瓊脂糖凝膠電泳準確稱取0. 3g瓊脂糖，加入20mL TAE置錐形瓶于微波爐中完全溶解后加入核酸 染料GoldView 6. 0μ L并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后將PCR擴增產物取8μ L點于已 凝固的瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm電壓于TAE中電泳Ih ；(5)判斷結果如果擴增出約680bp和380bp特異性兩條片段，則表明待檢組織豬繁殖與呼吸綜 合征病毒(PRRSV)變異株陽性；如果僅擴增出了約380bp特異性片段，則表明待檢組織豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV)經典株陽性；如果沒有擴增出片段，則表明待檢組織豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)陰性。實施例3:特異性試驗。1 材料1.1 樣品1. 1. 1其它豬易感病毒毒株日本乙型腦炎病毒(JEV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬細小 病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬圓環病毒(PCV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)，由本單 位保存。1. 1. 22份SPF豬肺和血清。1.1. 3PRRSV 北美型參考株(VR2332 毒株)。2 方法2.1特異性試驗方法用新型豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV) RT-PCR檢測試劑盒檢測6株其它豬易感 病毒毒株，2份SPF豬肺和血清。考查試劑盒檢測不同樣品的特異性。3 結果3. 1檢測其它豬易感病毒毒株、SPF豬樣品和其它豬繁殖與呼吸綜合征病毒結果用新型豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV) RT-PCR檢測試劑盒檢測其它豬易感病 毒毒株、SPF豬樣品和其它豬繁殖與呼吸綜合征病毒，結果均為陰性，PRRSV變異株擴增出 了約680bp和380bp特異性片段，經典株僅擴增出了約380bp特異性片段，表明該方法特異 性較好。結果見表1。表1特異性試驗檢測結果
10日本乙型腦炎病毒-豬瘟病毒-豬細小病毒-豬偽狂犬病毒-豬圓環病毒-豬傳染性胃腸炎病毒-SPF豬肺-SPF豬血清-實施例4 退火溫度選擇試驗。同實施例2的檢測方法，所不同的是PCR反應條件為95°C 3min ；94°C 30s, 54-62°C 30s, 72°C 40s，35 個循環；72°C 8min ；在 PCR 儀上設定退火溫度梯度54°C、56°C、 58°C、60°C、62°C。 紫外燈下觀察，發現在54 V、56 °C、58 V、60 V、62 V均能清楚看見目的條帶，但在 60°C時，條帶最亮，且特異性最高(見圖2)。實施例5:敏感性試驗。用DEPC 滅菌水將 PRRSV 變異株病毒稀釋成 IO0TCID50、IO1TCID50, IO2TCID50, IO3TCID50, IO4TCID50,檢測方法同實施例2。結果在IO4TCID5Q、IO3TCID5Q、K^TCID5qUO1TCID5q時仍然可以擴增出明顯目的條 帶，IO0TCID50幾乎看不見目的條帶，表明該試劑盒敏感性較高。(見圖3)。實施例6 陽性病料驗證試驗分別取6份采用北京世紀元亨動物防疫技術有限公司生產的PRRSV(NSP2 1594-1680變異株)RT-PCR檢測試劑盒(生產批號PRRS200807)檢測均為陽性的臨床病料 和6份采用北京世紀元亨動物防疫技術有限公司生產的PRRSV RT-PCR檢測試劑盒(生產 批號PRRS200807)檢測均為陽性的臨床病料，用實施例2的方法再次驗證。發現結果和北 京世紀元亨動物防疫技術有限公司生產的試劑盒的結果完全一致，如圖4、圖5所示。SEQUENCE LISTING<110>金陵科技學院<120>—種同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株和變異株的試劑盒及其檢測 方法<130>JIT091020<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>針對NSP2基因的上游引物Pl
11
<400>1aaagaccaga tggaggagga t 21<210>2<211>21<212>DNA<213>Artificial<220><223>針對NSP2基因的下游引物P2<400>2gatgatggct tgagctgagta21<210>3<211>24<212>DNA<213>Artificial<220><223>針對NSP9基因的上游引物P3<400>3atcttcttta tgaactcgcc tgtg24<210>4<211>20<212>DNA<213>Artificial<220〉<223>針對NSP9基因的下游引物P4<400>4tcttctttgg gtccgtctgg20
權利要求
一種用于同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株和變異株的引物對，其特征在于如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
2.一種同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株和變異株的試劑盒，其特征在于包括 權利要求1所述的引物對。
3.根據權利要求2所述的同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株和變異株的試劑 盒，其特征在于包括(1)豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株陽性對照細胞滅活毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒 經典株陽性對照細胞滅活毒各eoouL ；(2)豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株和經典株特異性引物對 針對NSP2基因上游引物P1 如SEQ ID NO 1所示；下游引物P2 如SEQ ID NO 2所示；針對NSP9基因上游引物P3 如SEQ IDN0 3所示；下游引物P4 如SEQ ID NO 4所示；(3)RNA 提取試劑由 Trizol 12mL,無菌 DEPC 水 450 ii L ；(4)RT-PCR反應試劑由RT反應液200ii L，其中含反轉錄引物序列:RT引物如SEQ ID NO 4 所示，RNA 酶抑制劑 24ii L，AMV 反轉錄酶 12 u L, 5 Xbuffer 60 u L, dNTP25 u L, 2XPCR Master Mix 200 u L 組成；(5)電泳檢測試劑由50XTAE電泳緩沖液20mL,GoldView 100 u L組成。
4.采用權利要求1所述的試劑盒同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株和變異株 的方法，其特征在于它包括如下步驟(1)RNA的提取(la)取待檢組織0. 5g，置于勻漿器或者研缽研碎后用1. 5mL D-Hanks液稀釋；取已研 磨好的待檢組織液，置1. 5mL滅菌離心管中，6000rpm離心5min ；(lb)取步驟(la)離心得到的上清液300 ii L于1. 5mL滅菌離心管中，加入lmL Trizol 混勻，室溫下放置lOmin ；再加入200 u L氯仿混勻，室溫下放置2min ；(lc)將步驟(lb)的滅菌離心管12000rpm離心lOmin，取600ii L上層水相到另一 1. 5mL 滅菌離心管中，加入600 iiL異丙醇混勻，室溫下放置lOmin ；(Id)將步驟(lc)的滅菌離心管12000rpm離心lOmin，去上清，加入_20°C預冷的75 % (v/v)乙醇溶液500 u L，旋渦震蕩混勻，7500rpm離心3min ；(le)去除步驟(Id)離心后的上清，37°C干燥，用30iiL DEPC水溶解即用或_70°C保存；(2)反轉錄取16 ii L mRNA和如SEQ ID NO 4所示的RT引物25pmol/U、0. 5 u L混勻于PCR管中， 放于PCR儀中65°C lOmin立即冰浴5min，再加入如下試劑:5Xbuffer 5 ii L、dNTP2 ii L、RNA 酶抑制劑0. 5 ii L、AMV反轉錄酶0. 5 ii L，置PCR儀中50°C反轉錄lh，95°C 3min滅活反轉錄 酶后，-20°C保存備用；(3)PCR 25ii L 體系2XPCR Master Mix 12. 5u L ；ddH20 6. 5 ii L ；上游引物 PI 1 ii L ；下游引 物P2 11^;上游引物卩3 11^;下游引物？4 lyL禾口模板2iiL ；PCR 反應條件:95°C 3min ；94°C 30s,60°C 30s,72°C 40s, 35 個循環；72°C 8min ；(4)瓊脂糖凝膠電泳準確稱取0. 3g瓊脂糖，加入20mL TAE置錐形瓶于微波爐中完全溶解后加入核酸染料 GoldVieW6. Oil L并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后將PCR擴增產物取8ii L點于已凝固的 瓊脂糖凝膠孔中，以5V/cm電壓于TAE中電泳lh ；(5)判斷結果如果擴增出約680bp和380bp特異性兩條片段，則表明待檢組織豬繁殖與呼吸綜合征 病毒變異株陽性；如果僅擴增出了約380bp特異性片段，則表明待檢組織豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典 株陽性；如果沒有擴增出片段，則表明待檢組織豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株和經典均陰性。
全文摘要
本發明公開了一種用于同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株和變異株的引物對，如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。本發明還公開了一種包含上述引物對的同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株和變異株的試劑盒，及采用該試劑盒同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒經典株和變異株的方法。本發明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒中的引物具較強的特異性、靈敏性及穩定性，為豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測提供了快速、靈敏、特異的方法。
文檔編號C12N15/11GK101928782SQ20091023402
公開日2010年12月29日 申請日期2009年11月19日 優先權日2009年11月19日
發明者何小明, 張志成, 戴鼎震, 方光遠, 范紅結, 陳鐘鳴 申請人:金陵科技學院