專利名稱：用于產生降血壓肽的瑞士乳桿菌菌株的制作方法
用于產生降血壓肽的瑞士乳桿菌菌株本發明涉及能產生大量降血壓肽，特別是IPP、VPP和LPP的瑞士乳桿菌 (Lactobacillus helveticus)的新菌株。本發明也涉及含有三肽IPP_VPP_LPP和瑞士乳桿 菌菌株的混合物的發酵乳制品。本發明進一步涉及由三肽IPP、VPP和LPP組成的特定的肽 混合物，以及發酵的產物或肽的混合物在食品、食品補充劑或藥物組合物中用于降低或預 防高血壓的用途。
背景技術：
認為高血壓是心血管疾病(Cardio Vascular Disease)的主要危險因素之一。調 節血壓的一種機制是腎素-血管緊張素系統。這是一種導致血管緊張素II形成的反應級 聯，血管緊張素II具有強的血管收縮作用并由此引起血壓升高作用。抑制該級聯中的一種 關鍵酶血管緊張素I轉化酶(Angiotensin I Converting Enzyme) (ACE)降低了血管緊張 素II的形成并因此具有血壓降低作用。用來自瑞士乳桿菌(其作為用于奶制品的一般乳酸菌起始物已經用于生產發酵 乳很長時間)的蛋白酶降解乳蛋白產生了具有ACE抑制活性的肽，其在自發性高血壓大鼠 中具有顯著的抗高血壓作用(Yamamoto、Akino、& Takano，1994)。用含有瑞士乳桿菌的發 酵乳觀察到了相同的作用(Nakamura、Yamamoto、Sakai、Okubo 等，1995)。事實上，目前已經顯示，用瑞士乳桿菌(L. helveticus)發酵的乳含有抑制血管 緊張素轉化酶(ACE)的小肽例如異亮氨酰-脯氨酰-脯氨酸(Ile-Pro-Pro，IPP)和纈氨 酰-脯氨酰-脯氨酸(Val-Pro-Pro，VPP)。聲稱“適合于患輕度高血壓人群”的市售發酵乳制品是由日本的Calpis Food hdustry公司生產的用瑞士乳桿菌和釀酒酵母(Saccharomyces cervisiae)發酵的可爾 必思(Calpis)酸乳。另一個市售的發酵乳制品是由芬蘭的Valio生產的EV0LUS ，其聲稱是“幫助低血 壓”的第一個歐洲的功能性食品。兩種發酵乳制品都用瑞士乳桿菌菌株發酵。產品含有通過酪蛋白的蛋白水解產生 的負責體外ACE抑制的生物活性肽(VPP和IPP)。與其它乳酸菌相比，瑞士乳桿菌是最有效 的蛋白水解乳桿菌屬物種之一。然而，仍然存在對具有特別高產量的降血壓肽的瑞士乳桿菌屬的備選乳酸菌菌株 的需求，所述乳酸菌菌株可以容易地制備并以適合于服用的形式提供給消費者。發明概述因此，本發明的目的是提供瑞士乳桿菌和IPP-VPP-LPP的混合物或用所述菌株可 獲得的IPP、VPP和LPP的混合物的發酵乳制品。所述IPP-VPP-LPP的混合物優選地為大約 2 1 1至1 1 1的比率。此類具有抗高血壓特性的肽可以加入食品或藥物產品中 以預防或降低高血壓。本發明的另一個目的是提供瑞士乳桿菌的新乳酸菌菌株，即NCC 935-(CNCM 1-3997)、NCC1322 (LHlll) (CNCM 1-3998)和 NCC1649 (LH158) (CNCM 1-3999)，它們可以產生 由VPP、IPP和LPP組成的三肽混合物。此外，它們可以提供兩倍高于在市售的產品AmealS 中發現的濃度。根據本發明，也提供了含有發酵乳的食品、寵物食品組合物或營養補充劑，所述發 酵乳包含前述乳酸菌和/或由Val-Pro-Pro、Ile-Pro-Pro和Leu-Pro-Pro組成的三肽混合 物，所述混合物優選地為大約2 1 1至1 1 1的比率。在最后一個目的中，本發明 涉及此類食品、寵物食品或食品補充劑的抗高血壓特性的用途。在附圖中，

圖1顯示了在不同的市售乳制品中存在的和用瑞士乳桿菌的不同菌株通過發酵 在乳中產生的VPP和IPP三肽的濃度。圖2顯示了在用瑞士乳桿菌LH53、LH111、LH158、LH157發酵18小時和24小時后， 在常規稀釋的乳基質(milk base)中存在的VPP和IPP三肽的濃度。發明詳述在本說明書的上下文中，詞語“包含”意指“包括，等等”。不應解釋為“僅由一種 組成”。而且，在本文中定義的“三肽VPP、IPP和LPP”包括VPP、IPP和LPP以及含有包含 VPP, IPP和VPP序列的3-25個氨基酸殘基的肽和這些肽的混合物。根據第一個目的，涉及發酵乳制品，其含有瑞士乳桿菌的乳酸菌菌株和 IPP-VPP-LPP的混合物。事實上，已經驚奇的發現，瑞士乳桿菌的一些菌株可以產生大量的三種三肽 VPP-IPP-LPP的混合物，優選地以依據發酵條件而變化的從大約2 1 1至1 1 1的比率。 在所有測試的菌株中，瑞士乳桿菌NCC 935 (LH53)、NCC1322 (LHl 11)和NCC 1649 (LH 158A)根據布達佩斯條約在2008年6月11日在巴斯德研究所(Pasteur hstitute)(法國)的國立微生物保藏中心(CNCM)分別以保藏號CNCM 1-3997、CNCM 1-3998 和 CNCM 1-3999 保藏。根據本發明的發酵乳制品可以通過包括用上述乳酸菌發酵培養基的方法制備，所 述培養基含有包含序列VPP、IPP和LPP的基于蛋白質的原材料。優選地，將乳用作為原材 料。乳原材料可以是任一乳、脫脂乳，只要它含有包含氨基酸序列VPP、IPP和/或LPP 的蛋白質。也可以使用動物乳如牛乳、山羊乳、駱駝乳、馬乳。不特別限制乳原材料中固體的含量，但是通常是5至20wt%。乳原材料可以是通 過混合水和乳成分，例如(脫脂)乳粉制備的復原乳。乳原材料可以含有添加劑，例如碳水 化合物等，只要這些添加劑不妨礙發酵。乳原材料的發酵可以在常規的發酵罐中實行，其中將乳原材料作為培養基用本發 明的瑞士乳桿菌接種。可以將瑞士乳桿菌優選地以具有足夠活性的預培養起始物的形式添 加入發酵。起始物的初始細胞數優選地是大約IO7至IO9個細胞/ml。并沒有特別限制接 種培養基所用的瑞士乳桿菌的量，但是其優選地是1至5 %，最優選地是起始物菌株的2 %。為了得到均勻的發酵培養基，可以以常規的方式混合發酵罐中的物質，包括瑞士 乳桿菌接種物和乳原材料。發酵有利地可以在25至50°C，優選地在30至45°C進行6至100小時，優選地15 至50小時。在一個最優選的實施方案中，發酵溫度是38-42°C，因為在這個溫度范圍內，形成了最大量的三肽VPP、IPP和LPP。而且，可以調整發酵期間的pH以便產生最大量的三肽。在發酵的乳中，根據本發明產生的三肽的總量可以依據用作為原材料的乳的來源 和優化的工藝條件而變。該種量例如可以包含大約10至50mg/l的總三肽，優選地15至 30mg/l。而且，通常用于制備稀釋的發酵乳飲品而實施的稀釋顯然減少了三肽的總量。在 制備常規的稀釋乳飲品的情況下，總三肽的量可以是最大約10mg/L的發酵乳飲品，優選地 4 至 8mg/L。測量了三肽在8°C保存1個月期間的穩定性，并且結果顯示，保存后三肽的濃度僅 稍微低于發酵結束時，因此表明，肽在8°C保存期間沒有降解。在另一個實施方案中，任選地巴氏滅菌的發酵乳可以用根據本發明的微生物補 充，所述微生物將不會在發酵培養基上進一步生長。例如，產物可以是酸奶，其是經熱處理 的，并且為了獲得具有本發明的特征的產物，向其加入不能在已發酵的、經熱處理的產物中 生長的微生物。因此，根據本發明的產物可以是天然的或具有額外的調味劑或成分如水果 的攪拌型或凝固型酸奶。根據本發明的產物也可以是貯藏穩定的新鮮奶酪。其它微生物可以任選地加入到發酵培養基中，例如益生細菌或酵母。發酵的乳制品可以就這樣使用，或者可以稀釋，它可以是經濃縮的，它可以是經純 化的和它可以是經干燥的，優選地是經噴霧干燥的或經冷凍干燥的。發酵的乳制品可以是 例如酸奶、酸性乳飲料或奶酪。發酵乳也可以在食品產品中作為食品成分使用。根據本發 明的食品產品可以是任一食品類型、寵物食品或營養補充劑。根據本發明的產品可以通過 技術人員基于普通的一般知識，使用發酵乳或發酵乳衍生的產物例如上述的IPP-VPP-LPP 混合物以合適的量作為成分來制備。該類食品產品的例子是焙烤商品、營養組合物和乳類 食品，特別是低脂乳制品、零食、飲品、含有發酵酸乳的食品、基于谷類的產品等。根據本發明的發酵的乳制品或衍生的食品產品可以是巴氏滅菌的或滅菌的。備選地，根據本發明的產品可以是例如糖漿、飲品、果汁例如蘋果、桔子或一般的 水果果汁。產品也可以是基于大豆的產品或基于谷類的產品。例如，它可以是大豆乳或大 豆飲品。例如，液體產品可以是乳的基于大豆的替代物。基于大豆的產品可以無乳糖。除發酵的乳制品外，它們可以包含合適量的普通食品成分，例如調味劑、糖、水果、 礦物質、維生素、穩定劑、增稠劑等。在一個優選的實施方案中，可以向組合物中加入額外的活性成分。該類成分優選 的是維生素D或維生素D的類似物。添加維生素D與根據本發明的三肽的混合物組合改善 了組合物的功效。維生素D的每日價值DV是大約400IU(對成年人而言)。根據另外的方面，本發明提供了使用有效量的上述瑞士乳桿菌菌株的發酵培養基 和/或它們的IPP-VPP-LPP混合物，優選地以1 1 1的比率(+/-10% )的混合物來預 防或治療高血壓的方法。根據本發明的食品的有效量通常可以是例如使得總三肽的每日攝 取是至少每天5. 2mgo例如，如果由LH53發酵產生了多于30mg/L的三肽，那么在150ml中， 發酵的稀釋乳基質就可以含有每日劑量。現給出本發明的特定實施例作為進一步的說明。實施例1 :LAB菌株的篩選本工作的目的是篩選一系列乳酸菌(LAB)在乳發酵期間具有產生更大量生物活 性三肽的潛力。
基于它們的生理學特性，選擇了一系列的30個菌株的瑞士乳桿菌、保加利亞乳 桿菌(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)禾口唾液鏈球菌(Streptococcus thermophilus).第一個考慮的標準是酸化能力(PA)，其是在M小時內產生的酸的量。這 種產生大量酸的潛能與生長行為和細菌在乳中的蛋白水解特性直接相關。有效的蛋白水解 系統對肽的釋放是必要的。第二個考慮的標準是在肽的產生和/或穩定性中發揮作用的菌 株的肽酶活性。在PA乳(10%脫脂乳粉在98-100°C巴氏滅菌35分鐘)中，從凍干原種中再活化 不同的菌株。然后，將PA乳用2%的每一種起始物菌株接種并在40°C溫育。對于每一種菌 株，在凝固時終止發酵并保存于4°C。然后將發酵產物進行處理用于如下述的VPP和IPP的定量。通過液相層析(LC)和質譜法(MS)定量三肽VPP和IPP樣品制備通過離心來澄清(去除凝固的蛋白質)不同的發酵產物，并將澄清的上清液等分 保存于_20°C。將500 μ 1等分試樣的澄清上清液用Ultrafree-O. 5單位(Millipore，截留 分子量10，OOODa)在12，OOOg通過離心20分鐘過濾。在固相萃取(SPE)前，將濾液通過用在 水中的 0. 三氟乙酸(TFA) 1 1 稀釋來酸化。將Cartridges tC18 Sep-Pak Plus (Waters Corp.，Milford, MA)用^il 0. 在乙腈中的TFA進行調整，然后用^il 0. 在水中的 TFA進行平衡。將Iml稀釋的濾液應用于SPE-柱體上，并用aiil 0. 1 %在水中的TFA洗滌。肽的洗脫用aiil 70%乙腈、0. 1 % TFA水溶液來完成。將洗脫液在Speedvac濃縮 器中干燥至完全，并儲存于-20°C直到進一步使用。需要將樣品預純化以除去與目標分析物 不利地相互作用的化合物。液相層析(LC)和質譜法(MQ分析將干燥的樣品在0. TFA中重新溶解，超聲15分鐘并離心。將12. 5μ 1當量的初 始發酵乳注射到HyperCarb柱(0. 32 X 150mm, 5 μ m)一種100%多孔石墨碳柱(HyperCarb 柱，Thermo Electron Corp.，Bellefonte, PA)上。將柱安裝在由 Rheos 2000 泵(Flux Instruments，瑞士)和HTC PAL自動取樣器(CTC Analytics，瑞士)組成的HPLC系統上。將柱的出口直接與LCQ 經典離子阱 MS (Thermo Electron Corp, Bellefonte, PA) 連接。溶劑A由0. TFA水溶液組成，溶劑B是在水中的80%乙腈、0. TFA。肽洗脫包 括用100%溶劑A的等度洗滌10分鐘，然后用30分鐘內從0-50%的B的線性梯度洗滌，流 速5 μ 1/分鐘。通過100%的B洗滌5分鐘再生柱，然后在下一次注射前再平衡15分鐘。MS系統在單位分辨率從m/z 250-1600掃描；毛細管電壓設定為4kV且溫度為 140°C。用)(calibur 1. 3使用來自MS層析圖的質量跡線(對于VPP提取的質量為m/z 312.1 和對于IPP為m/z 326. 1)的手工積分來進行系統控制和數據分析。將標準峰的積分面積 用作為單個校準點以計算樣品中兩種三肽的含量。如果省去了用Ultrafree-0. 5單位(10，OOODa截留)的樣品過濾，那么峰形和強 度都會顯著地降低，而且兩種肽的定量是不可行的(未顯示數據)。精確的樣品純化和適應 的層析條件對獲得可重復的和定量的結果是關鍵的。MS檢測的特異性是必需的，以測量在 發酵產物的復雜混合物中的兩種肽。結果
結果顯示，大多數選擇的菌株產生了少于lmg/L的三肽(表1)。在經測試的不同 乳酸菌中，只有一些瑞士乳桿菌菌株產生了多于lmg/L直到幾乎5mg/L如LH111。在菌株的 蛋白水解特性和三肽的產生之間不存在直接的相關性。表1 定量由不同的唾液鏈球菌(S. thermophilus) (Sfi和S)、、保加利亞乳桿 菌(L. delbrueckii subsp bulgaricus) (Yl、Lfi 和 LD)和瑞士乳桿菌(LH)菌株產生的 VPP+IPP。(PA 酸化能力(NCC Bionumerics) ；ρ印低至高肽酶活性，1-4 ;coag 以小時計 的凝固時間；VPP+IPP 在產物中的濃度(以mg/L計)；nd 未測定)
權利要求
1.發酵乳制品，所述發酵乳制品含有選自瑞士乳桿菌(LactcAacillushelveticus) CNCM 1-3997、瑞士乳桿菌CNCM 1-3998和瑞士乳桿菌CNCMI-3999的瑞士乳桿菌的乳酸菌 菌株和三肽IPP、VPP和LPP的混合物。
2.根據權利要求1的發酵乳制品，其中三肽IPP、VPP和LPP的比例是大約2:1:1 至 1 1 1。
3.根據權利要求1或2中任一項的發酵乳制品，其中三肽的總量是大約10至50mg/l， 優選地是15至30mg/l。
4.根據權利要求1至3中任一項的發酵乳制品，所述發酵乳制品就這樣使用，或者經稀 釋、濃縮、純化或干燥，優選地經噴霧干燥或冷凍干燥。
5.根據權利要求1至4中任一項的發酵乳制品，所述發酵乳制品進一步含有維生素D。
6.三肽IPP、VPP和LPP的混合物，其中三肽IPP、VPP和LPP的比例是大約2:1:1 至1 1 1，所述混合物可通過瑞士乳桿菌菌株的發酵獲得。
7.根據權利要求7的三肽IPP、VPP和LPP的混合物，其中瑞士乳桿菌的菌株是瑞士乳 桿菌 CNCMI-3997、瑞士乳桿菌 CNCM 1-3998 或瑞士乳桿菌 CNCM 1-3999。
8.根據權利要求6或7的三肽的混合物，其進一步含有維生素D。
9.食品或藥物產品，其含有根據權利要求6的三肽IPP、VPP和LPP的混合物或者根據 權利要求1至5中任一項的發酵食品。
10.根據權利要求9的食品或藥物產品，其中所述食品是任一食品類型、寵物食品或食 品補充劑。
11.根據權利要求9或10的食品或藥物產品，其進一步含有維生素D。
12.瑞士乳桿菌的新菌株，其根據布達佩斯條約的規定于2008年6月11日保藏于法 國的CNCM，所述新菌株是瑞士乳桿菌CNCM 1-3997、瑞士乳桿菌CNCM 1-3998和瑞士乳桿菌 CNCM 1-3999。
13.根據權利要求1的發酵乳制品或根據權利要求6的三肽的混合物或者根據權利要 求12的菌株的用途，用于制備具有抗高血壓特性的食品或藥物產品。
全文摘要
本發明涉及能產生大量的降血壓肽，特別是IPP、VPP和LPP的瑞士乳桿菌的新菌株。本發明也涉及含有三肽IPP-VPP-LPP的混合物和瑞士乳桿菌菌株的發酵乳制品。本發明進一步涉及由三肽IPP、VPP和LPP組成的特定的肽混合物以及發酵產物或肽的混合物在食品、食品補充劑或藥物組合物中用于降低或預防高血壓的用途。
文檔編號A23L1/305GK102098923SQ200980120912
公開日2011年6月15日 申請日期2009年6月8日 優先權日2008年6月12日
發明者J-E·格爾蒙德, M·格里戈羅夫, M·阿福爾特爾, S·托納德 申請人:雀巢產品技術援助有限公司