專利名稱：通過rna干擾引入復能基因而重編程細胞的制作方法
技術領域：
本發明的實施方案涉及細胞生物學、干細胞、細胞分化、體細胞核轉移和基于細胞 的治療法的領域。更具體地，本發明的實施方案涉及用于重編程細胞的方法、組合物和試劑 盒以及基于細胞的治療法。
背景技術：
再生醫學作為許多人疾病的治療極具潛力，但是還伴隨著現代科學研究中遇到的 一些最困難的技術挑戰。再生醫學的技術挑戰包括低克隆效率、可能的復能(pluripotent) 組織供應不足和對于如何控制細胞分化和哪種類型的胚胎干細胞可用于選擇的治療的知 識的普遍缺乏。盡管ES細胞具有極大的可塑性，但是未分化的ES細胞可以形成含有混合 組織類型的畸胎瘤(良性腫瘤)。此外，從一種來源向另一來源移植ES細胞將需要施用藥 物來防止新細胞的排斥。已經進行了嘗試來鑒定由非胎兒來源的組織產生干細胞的新途徑。一種方法包括 自體的成體干細胞的處理。使用自體的成體干細胞用于再生醫學的優點在于以下事實它 們來源并返回同一患者，并且因此不會經受免疫介導的排斥。缺點是這些細胞缺乏ES細胞 的可塑性和復能性并且因此它們的潛能是不確定的。另一方法著眼于將來自成體組織的體 細胞重編程以產生復能ES樣細胞。然而，這種方法是困難的，因為多細胞生物體中的每種 細胞類型具有獨特的表觀遺傳學標記，認為該標記在細胞分化之后或從細胞周期退出之后 是固定的。細胞DNA —般以染色質的形式存在，染色質是包含核酸和蛋白質的復合體。事實 上，大部分的細胞RNA分子還以核蛋白復合體的形式存在。如本領域的那些技術人員已知 的，染色質的核蛋白結構已成為廣泛的研究課題。一般而言，染色體DNA被包裝成核小體。 核小體包含核心和連接區。核小體核心包含核心組蛋白八聚體(H2A、H2B、H3和H4各兩個)， 約150個堿基對的染色體DNA纏繞在該八聚體周圍。此外，約50個堿基對的連接區DNA區 段與連接區組蛋白Hl締合。核小體被組織成更高階的染色質纖維并且染色質纖維被組織 成染色體。參見,例如,Wolffe" Chromatin Structure and Function(染色質結構和功 能)“3.sup. rd Ed. , Academic Press, San Diego,1998。染色質的結構不是靜止的，而是經受著統稱為染色質重建的過程的修飾。染色質 重建可以用于例如，從DNA區清除核小體；將核小體從一個DNA區移到另一個DNA區；改變核小體之間的間距；或添加核小體到染色體中的DNA區。染色質重建還可以導致更高階 結構的改變，從而影響轉錄活性的染色質(開放染色質(open chromatin)或常染色質)與 無轉錄活性的染色質(閉合染色質(closed chromatin)或異染色質)之間的平衡。染色體蛋白經受了大量類型的化學修飾。這些核心組蛋白的轉錄后修飾的一種機 制是高度保守的堿性N-末端賴氨酸殘基的氨基的可逆乙酰化。組蛋白乙?；姆€態 是由競爭性的組蛋白乙酰基轉移酶與組蛋白脫乙酰酶之間的動態平衡建立的，組蛋白脫乙 酰酶在本文稱為HDAC。早已將組蛋白乙?；c脫乙酰化與轉錄控制聯系起來。可逆的組蛋 白乙?；梢詫е氯旧|重建并且如此可以作為基因轉錄的控制機制起作用。一般而言， 組蛋白的高度乙?；欣诨虮磉_，而組蛋白脫乙?；瘎t與轉錄抑制相關聯。據顯示組 蛋白乙?；D移酶充當轉錄輔激活蛋白，而脫乙酰酶則被發現是屬于轉錄抑制途徑的。組蛋白乙酰化與脫乙酰化之間的動態平衡是正常細胞生長所需的。組蛋白脫乙酰 化的抑制導致細胞周期停滯、細胞分化、凋亡和轉化的表型逆轉。參與基因表達的調節的另一組蛋白是DNA甲基轉移酶(DNMT)，它們負責導致轉錄 沉默的基因組甲基化模式的產生。DNA甲基化對于許多哺乳動物過程是重要的，所述過程包 括胚胎發育、X失活、基因組印跡以及基因表達的調節。哺乳動物中的DNA甲基化是通過將 甲基從S-腺苷-甲硫氨酸轉移到胞嘧啶的C5位置達成的。這個反應是由DNA甲基轉移酶 催化的并且是對CpG 二核苷酸中的胞嘧啶特異的。在人基因組中CpG 二核苷酸中的所有胞 嘧啶的百分之七十是甲基化的并且傾向于脫氨化，從而導致胞嘧啶向胸腺嘧啶轉換。這個 過程導致鳥嘌呤和胞嘧啶的頻率總體降低至所有核苷酸的約40%，并且還將CpG 二核苷酸 的頻率降低至它們的期望頻率的約四分之一。已經在哺乳動物中鑒定了四種活性的DNA甲基轉移酶DNMT1、DNMT2、MMT3A和 DNMT3B。此外，DNMT3L是結構上與DNMT3A和DNMT3B極為相似的蛋白并且對于DNA甲基化 是關鍵的，但是其本身似乎是無活性的。在含有CpG島的啟動子區中胞嘧啶的甲基化導致 脊椎動物細胞中下游編碼序列的轉錄滅活。認為稱為甲基-CpG結合蛋白(MBD1至4)的蛋白家族在甲基化介導的轉錄沉默中 起重要作用。MeCP2是這種家族被鑒定的第一個成員并且其含有甲基-CpG結合結構域MBD) 和轉錄阻抑結構域(TRD)，它促進與甲基化的DNA的相互作用并將Sin3A/HDAC復合體靶向 甲基化的DNA。與MeCP2類似，據顯示MBD1、MBD2和MBD3是有效的轉錄阻抑蛋白。MBD4是 DNA糖基化酶，它修復G:T錯配。在哺乳動物細胞中，除了 MBD3之外的這種家族的每一個成 員與甲基化的DNA形成復合體，并且除了 MBDl和MBD4之外全部都位于已知的染色質重建 復合體中。幾種蛋白和蛋白復合體如Mi-2復合體將DNA甲基化與染色質重建和組蛋白脫 乙酰化偶聯起來。參與表觀遺傳性調節的另一組蛋白是組蛋白甲基轉移酶(HMT)，它們是催化將 一至三個甲基從輔因子S-腺苷甲硫氨酸轉移至組蛋白的賴氨酸和精氨酸殘基的酶，組蛋 白-賴氨酸N-甲基轉移酶和組蛋白-精氨酸N-甲基轉移酶。甲基化的組蛋白更緊密地結 合DNA，這抑制了轉錄。染色質的結構還可以通過稱為染色質重建復合體的大分子裝配體的活性來改變。 參見，例如 Cairns (1998) Trends Biochem. Sci. 23 20 25 ；Workman 等人(1998) Ann. Rev. Biochem. 67 545 579 ；Kingston 等人(1999) Genes Devel. 13 2339 2352 ；以及 Murchardt等人(1999)J. Mol. Biol. 293 :185 197。染色質重建復合體參與了核小體陣列的破壞或再 形成，從而導致轉錄的調控、DNA復制和DNA修復(Bochar等人(2000)PNAS USA 97(3) 1038 43)。這些染色質重建復合體的許多具有不同的亞基組成，但是重建活性全部都依賴 于ATP酶。還存在體內基因激活需要染色質重建復合體的活性的幾個實例。復能細胞或全能細胞向分化的、特化的表型的發育是由發育期間表達的特定組的 基因決定的?；虮磉_是直接由可以影響正調節或負調節的基因調節蛋白的序列特異性結 合介導的。然而，這些調節蛋白的任一種直接介導基因表達的能力至少部分取決于它們在 細胞DNA內的結合位點的可接近性。如上面所討論的，細胞DNA中序列的可接近性通常取 決于在其中包裝細胞DNA的細胞染色質的結構。因此，鑒定可以誘導復能性所需的基因表達的方法、組合物和試劑盒將是有用的， 包括可以抑制參與阻抑轉錄的基因的活性、表達或活性和表達二者的方法、組合物和試劑
品.ο發明簡述本發明涉及重編程細胞的方法、組合物和試劑盒。本發明的實施方案涉及包括誘 導復能基因或多能(multipotent)基因表達的方法。在又一實施方案中，本發明還涉及包 括制備重編程的細胞的方法。在再一實施方案中，本發明涉及包括抑制編碼參與轉錄阻抑 的蛋白的至少一種基因表達的方法。該方法還包括誘導復能基因或多能基因的表達以及重 編程細胞。本發明的實施方案還涉及重編程細胞的方法，所述方法包括使細胞、細胞群、細胞 培養物、來自細胞培養物的細胞亞群、同質細胞培養物或異質細胞培養物接觸阻礙編碼參 與轉錄阻抑的蛋白的基因表達的劑；誘導復能基因或多能基因表達；以及重編程細胞。所 述方法還包括使重編程的細胞再分化。阻礙編碼參與轉錄阻抑的蛋白的基因表達的劑包括但不限于shRNA分子、 shRNAmir分子、shRNA分子的組合、shRNAmir分子的組合以及shRNA和shRNAmir分子的組
口 O可以通過本發明的方法抑制編碼參與轉錄阻抑的蛋白的任何基因，包括但不限于 編碼下列蛋白的基因DNA甲基轉移酶、組蛋白脫乙酰酶、組蛋白乙?；D移酶、賴氨酸甲 基轉移酶、組蛋白脫甲基酶、賴氨酸脫甲基酶、sirtuirusirtuin激活蛋白、甲基結合結構域 蛋白、組蛋白甲基轉移酶、SWI/SNF復合體的組分、NuRD復合體的組分以及IN080復合體的 組分?？梢酝ㄟ^本發明的方法抑制單個基因或多于一種的基因，包括但不限于2種、3種、4 種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11-20種、21-30種、31-40種、41-50種和大于50種基 因。在另一實施方案中，本發明涉及重編程的方法，該方法包括將細胞暴露于干擾編 碼調節蛋白的基因表達的shRNA構建體；誘導復能基因或多能基因的表達；以及選擇細胞， 其中所述細胞已恢復分化潛能。在又一實施方案中，本發明涉及包括下列的方法將具有第一表型的細胞暴露于 干擾編碼調節蛋白的基因表達的shRNA構建體；比較細胞的所述第一表型與將所述細胞暴 露于所述shRNA構建體后所獲得的表型；以及選擇被重編程的細胞。在又一實施方案中，方 法包括比較在將細胞暴露于所述shRNA構建體之前的細胞基因型與將所述細胞暴露于所述shRNA構建體之后所獲得的細胞基因型。在再一實施方案中，方法包括比較在將細胞暴 露于shRNA構建體之前的細胞表型和基因型與將所述細胞暴露于所述shRNA構建體之后的 細胞表型和基因型。在又一實施方案中，方法包括將選擇的細胞培養或擴增為細胞群。在又一實施 方案中，方法包括使用與由復能基因或多能基因所編碼的蛋白結合的抗體或使用與多能 標記物或復能標記物結合的抗體分離細胞，所述多能標記物或復能標記物包括但不限于 SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra_l_81。還可以使用有效分離細胞的任何方法分離細胞，包括 但不限于熒光細胞激活的分選儀、免疫組織化學和ELISA。在另一實施方案中，方法包括選 擇與原始細胞相比具有較低分化狀態的細胞。在又一實施方案中，本發明還包括比較暴露于所述shRNA構建體之前的復能基因 或多能基因的染色質結構與暴露于所述劑之后所獲得的染色質結構。在另一實施方案中，本發明涉及重編程細胞的方法，該方法包括將具有第一轉錄 模式的細胞暴露于shRNA構建體；誘導復能基因或多能基因的表達；比較細胞的所述第一 轉錄模式與暴露于所述shRNA構建體之后所獲得的轉錄模式；以及選擇細胞，其中所述細 胞已恢復分化潛能。在又一實施方案中，選擇細胞包括鑒定轉錄模式至少5-10%、10-20%、20_30%、 30-40%、40-50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-90%、90-94%、95%或 95-99%類似于分 析的胚胎干細胞的轉錄模式的細胞。不需要比較胚胎干細胞的整個轉錄模式，盡管這是可 以的。然而，可以比較的胚胎基因的亞組包括但不限于1_5個、5-10個、10-25個、25-50 個、50-100 個、100-200 個、200-500 個、500-1，000 個、1，000-2，000 個、2，000-2，500 個、 2，500-5, 000個、5，000-10, 000個和多于10，000個基因。轉錄模式可以以二元形式比較， 即，可以進行比較來確定基因是轉錄的還是未轉錄的。在另一實施方案中，可以比較每種基 因或基因亞組的轉錄速率和/或程度?？梢允褂帽绢I域中已知的任何方法來確定轉錄模 式，包括但不限于RT-PCR、定量PCR、微陣列、DNA印跡和雜交。在又一實施方案中，可以使用至少一種shRNA或shRNAmir序列來抑制DNA甲基轉 移酶、組蛋白脫乙酰酶、甲基結合結構域蛋白或組蛋白甲基轉移酶的表達。在再一實施方案 中，可以使用多于一種的shRNA或shRNAmir來抑制參與轉錄阻抑的多于一種蛋白的表達， 所述蛋白包括但不限于DNA甲基轉移酶、組蛋白脫乙酰酶、甲基結合結構域蛋白或組蛋白 甲基轉移酶。在又一實施方案中，本發明涉及重編程細胞的方法，該方法包括將細胞暴露于干 擾編碼第一調節蛋白的基因表達的shRNA構建體；將所述細胞暴露于抑制第二調節蛋白的 活性、表達或表達和活性的第二劑，其中所述第二調節蛋白具有與所述第一調節蛋白不同 的功能；誘導復能基因或多能基因的表達；以及選擇細胞，其中所述細胞已恢復分化潛能。 在另一實施方案中，細胞或細胞群可以同時或順序地暴露于第一劑和第二劑。所述第二劑 包括但不限于小分子、小分子抑制劑、小分子激活劑、核酸序列和shRNA構建體。本發明的實施方案還包括使用根據本文所公開的方法制備的重編程的細胞治療 多種疾病的方法。在又一實施方案中，本發明還涉及重編程的細胞和再分化的重編程的細 胞的治療用途。本發明的實施方案還涉及包括篩選參與重編程細胞的基因的方法。在又一實施方案中，方法還包括篩選編碼抑制轉錄的蛋白的基因。在再一實施方案中，方法包括篩選促使 細胞為復能或多能的基因。篩選可以使用適當的篩選試劑進行，所述篩選試劑包括但不限 于shRNA文庫或shRNAmir文庫。本發明的實施方案還涉及由本發明的方法制備的重編程的細胞。重編程的細胞可 以再分化為單個譜系或多于一種譜系。重編程的細胞可以是多能的或復能的。在又一實施方案中，本發明涉及根據包括下列步驟的方法制備的富集的重編程 的細胞群將細胞暴露于誘導復能基因或多能基因表達的shRNA構建體；和選擇細胞，其 中所述細胞已恢復分化潛能；以及培養所述選擇的細胞以制備細胞群。在又一實施方案 中，重編程的細胞表達選自由下列組成的組的細胞表面標記物SSEA3、SSEA4、Tra-1-60 和Tra-1-81。在又一實施方案中，重編程的細胞可以通過復能基因或多能基因的蛋白表 達來選擇，所述復能基因或多能基因包括但不限于Oct-3/4、Sox-2、Nanog和Klf4。在又 一實施方案中，重編程的細胞占富集的細胞群的至少5-10%、10-20%、20-30%、30-40%、 40-50%,50-60%,60-70%,70-80%,80-90%,90-95%,96-98% ；或至少 99%。本發明的實施方案還涉及用于制備本發明的方法和組合物的試劑盒。該試劑盒尤 其可用于重編程細胞和產生ES樣細胞和干細胞樣細胞。附圖
簡述圖IA是報道在用DWTl shRNA感染的細胞中0ct_4的表達增加和DWTl的表達 降低的圖。圖IB是報道在用DNMTl shRNA感染并在hES培養基中培養的細胞中0ct_4的表 達增加和DNMTl的表達降低的圖。圖2A是在DNMTl的shRNA敲低之后形成的胚胎樣體的照片。圖2B是展示圖2A中所顯示的胚胎樣體內存在的細胞中的GFP定位的照片，它證 實了慢病毒感染。圖2C是在DNMTl的shRNA敲低之后形成的胚胎樣體的照片。圖2D是展示在圖2C所顯示的胚胎樣體中DNMTl的shRNA敲低所誘導的Sox2蛋 白表達的照片。圖2E是在DNMTl的shRNA敲低之后形成的胚胎樣體的照片。圖2F是展示在圖2E所顯示的胚胎樣體中DNMTl的shRNA敲低所誘導的0ct4蛋 白表達的照片。圖2G是在培養物中生長的成纖維細胞的照片。圖2H是展示在圖2G所顯示的胚胎樣體中DNMTl的shRNA敲低所誘導的SSEA4蛋 白表達的照片。圖3A是報道在用DNMTl shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細胞中0ct_4的表達增 加和DNMTl的表達降低的圖。圖3B是報道在用DNMTl shRNA感染并且在存在嘌呤霉素的條件下培養的人胎兒 皮膚成纖維細胞中Oct-4的表達增加和DNMTl的表達降低的圖。圖3C是報道在用DNMTl shRNA感染并且在存在嘌呤霉素和hES培養物的條件下 培養的人胎兒皮膚成纖維細胞中Oct-4的表達增加和DNMTl的表達降低的圖。圖4A是報道在用DNMTl shRNA感染的人新生兒皮膚成纖維細胞中0ct_4的表達增加和DNMTl的表達降低的圖。圖4B是報道在用DNMTl shRNA感染并且在存在嘌呤霉素的條件下培養的人新生 兒皮膚成纖維細胞中Oct-4的表達增加和DNMTl的表達降低的圖。圖4C是報道在用DNMTl shRNA感染并且在存在嘌呤霉素和hES培養物的條件下 培養的人新生兒皮膚成纖維細胞中Oct-4的表達增加和DNMTl的表達降低的圖。圖5A是報道在存在HDAC7a和HDACll shRNA的條件下成人皮膚成纖維細胞中 0ct-4mRNA的表達增加的圖。圖5B是報道在存在HDAC7a和HDACll shRNA的條件下人新生兒皮膚成纖維細胞 中0ct-4mRNA的表達增加的圖。圖5C是報道在存在HDAC7a和HDACll shRNA的條件下人胎兒皮膚成纖維細胞中 0ct-4mRNA的表達增加的圖。圖6A是報道在存在HDAC7a和HDACll shRNA的條件下成人皮膚成纖維細胞中 Nanog mRNA的表達增加的圖。圖6B是報道在存在HDAC7a和HDACll shRNA的條件下人新生兒皮膚成纖維細胞 中Nanog mRNA的表達增加的圖。圖6C是報道在存在HDAC7a和HDACll shRNA的條件下人胎兒皮膚成纖維細胞中 Nanog mRNA的表達增加的圖。圖7A是人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖7B是用DNMTl shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖7C是用HDAC7 shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖7D是用DNMTl和HDAC7 shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖7E是用DNMTl和HDACll shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖7F是用HDACl 1和HDAC7 shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖7G是人胚胎干細胞的照片。圖8A是人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖8B是用DNMTl shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖8C是用DNMTl和HDAC7 shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖8D是用DNMTl和HDACll shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖8E是用HDAC7 shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖8F是用HDACll和HDAC7 shRNA感染的人胎兒皮膚成纖維細胞的照片。圖8G是人胚胎干細胞的照片。優選實施方案詳述定義除非另外指明，否則本公開內容中的數字范圍是近似的，并且因此可以包括該范 圍之外的值。數字范圍包括來自以一個單位遞增中的下限值和上限值之間的所有值并且 包括下限值和上限值，前提條件是在任何下限值和任何上限值之間存在至少兩個單位的分 隔。作為實例，如果成分特征、物理特征或其他特征諸如分子量、粘度等是100至1，000，則 旨在清楚地列舉所有單個的值例如100、101、102等，和子范圍例如100至144、155至170、 197至200等。對于含有小于1的值或含有大于1的分數數字(例如，1. 1、1. 5等)的范圍，一個單位視情況被認為是0. 0001,0. 001,0. 01或0. 1。對于含有小于10的單數字的范圍 (例如，1至5)，通常認為一個單位是0. 1。這些僅是具體意指的實例，認為在所列舉的最低 值和最高值之間的所有可能的數值組合均清楚地在本公開內容中陳述。在本公開內容中尤 其提供的數字范圍是混合物中組分的相對量以及方法中所引用的各種溫度和其他參數范 圍。除非明確限制為相反的情況，否則細胞(“cell”或“cells”)包括任何體細 胞、胚胎干(ES)細胞、成體干細胞、器官特異性干細胞、核轉移(NT)單位以及干樣細胞 (stem-like cell)。細胞可以由任何器官或組織獲得。細胞可以是人或其他動物的。例如， 細胞可以是小鼠的、豚鼠的、大鼠的、牛的、馬的、豬的、綿羊的、山羊的等。細胞還可以來自 非人的靈長類。“培養基”或“生長培養基”意指能夠支持細胞生長的合適的培養基?！胺只币庵冈谂咛グl育期間細胞變得在結構和功能上特化的過程。"DNA甲基化”意指甲基(一CH3基團)連接到胞嘧啶上。這是作為保護自身DNA 免受為破壞外來DNA所產生的酶和化學物的破壞的方式和作為調節DNA中的基因轉錄的方 式常規進行的。“表觀遺傳學”意指關于在不改變核苷酸序列的條件下功能上的可遺傳改變的DNA 狀態。表觀遺傳學改變可以是由諸如甲基化和脫甲基化等DNA修飾引起的，而沒有任何DNA 核苷酸序列的改變?！敖M蛋白”意指存在于染色體中的一類蛋白質分子，它負責將DNA壓縮得足以使 DNA適于在核內?！耙种苹蚋蓴_基因的表達”意指降低基因的表達。在一些實施方案中，這種基因表 達的降低是至少約5-25%，更優選至少約50%，仍然更優選至少約75%，并且仍然更優選 至少約90 %。在其他實施方案中，基因表達降低了至少95 %，并且在又一實施方案中，基因 表達降低了至少99%?！扒玫汀币庵敢曰蛱禺愋苑绞阶枰只虻谋磉_。具有一種或多種基因被“敲低” 的細胞被稱為敲低生物體或簡單稱為“敲低”?！皬湍堋币庵改軌蚍只?胚層細胞類型或基本組織類型?！皬湍芑颉币庵复偈辜毎麨閺湍艿幕颉！皬湍芗毎囵B物”在表現出將它們與胚胎或成體來源的分化的細胞明顯區別開 的形態時被說成是“基本上未分化的”。復能細胞通常具有高的核/胞質比、突出的核仁以 及具有差的辨識度的細胞連接的緊密集落形成，并且容易被本領域的那些技術人員識別。 認識到未分化的細胞集落可以被分化的鄰近細胞環繞。然而，當在適當的條件下培養時， 基本上未分化的集落繼續存在，并且在分離培養的細胞后未分化的細胞構成了大部分的細 胞。本公開內容中描述的可用的細胞群含有任何比例的具有這些標準的基本上未分化的復 能細胞。基本上未分化的細胞培養物可以含有至少約20%、40%、60%或甚至80%未分化 的復能細胞(以群中總細胞的百分比計)。“調節蛋白”意指調節生物過程的任何蛋白，包括正向和負向的調節。調節蛋白可 以對生物過程具有直接或間接的作用，并且可以直接施加影響或通過參與到復合體中來施 加影響。
“重編程”意指移除核中的表觀遺傳學標記，然后建立不同組的表觀遺傳學標記。 在多細胞生物體的發育期間，不同的細胞和組織獲得不同的基因表達程序。這些不同的基 因表達模式表現為實際上由諸如DNA甲基化、組蛋白修飾和其他染色質結合蛋白的表觀遺 傳學修飾調節。因此多細胞生物體中的每種細胞類型具有獨特的表觀遺傳學標志，常規上 認為該標志在細胞分化后或退出細胞周期之后變成“固定的”和不變的。然而，一些細胞在 正常發育或某些疾病期間會進行主要的表觀遺傳學“重編程”?！叭堋币庵改軌虬l育成整個胚胎或器官。本發明的實施方案涉及包括誘導促使細胞為復能或多能的至少一種基因表達的 方法。另一實施方案中，本發明涉及包括誘導促使細胞為多能的至少一種基因表達的方法。 在一些實施方案中，方法包括誘導促使細胞為復能或多能的至少一種基因表達，和制備是 復能或多能的并且能夠定向分化成多個譜系的重編程的細胞。本發明的實施方案還涉及包括下列的方法修飾染色質結構和將細胞重編程為復 能或多能的。在又一實施方案中，修飾染色質結構包括抑制編碼參與阻抑復合體的蛋白的 至少一種基因表達。在另一實施方案中，方法包括抑制編碼參與轉錄阻抑的蛋白的至少一種基因表 達，以及誘導促使細胞為復能或多能的至少一種基因表達。在又一實施方案中，方法包括 抑制編碼參與轉錄阻抑的蛋白的至少一種基因表達以及制備重編程的細胞。本發明的方法 可以抑制編碼參與任何類型的阻抑的蛋白的基因表達，所述蛋白包括但不限于活性阻抑 蛋白、修飾基本轉錄機構的阻抑蛋白、修飾募集阻抑蛋白的結構的蛋白、募集阻抑蛋白的蛋 白、修飾核小體或染色質結構的蛋白、修飾組蛋白的蛋白、修飾DNA的蛋白、以及參與染色 質重建復合體的蛋白。在又一實施方案中，本發明涉及重編程細胞的方法，該方法包括將細胞暴露于 干擾編碼調節蛋白的基因表達的shRNA構建體；誘導復能基因或多能基因的表達；以及選 擇細胞，其中所述細胞已恢復分化潛能。復能基因或多能基因可以被誘導為表達增加任何 倍數，包括但不限于 0. 25-0. 5,0. 5-1,1. 0-2. 5,2. 5_5、5_10、10-15、15-20、20-40、40_50、 50-100、100-200、200-500和大于500。在另一實施方案中，方法包括鋪板分化的細胞；將 所述分化的細胞暴露于干擾編碼調節蛋白的基因表達的shRNA構建體；培養所述細胞；以 及鑒定已被重編程的細胞。shRNA構建體可以任何量干擾調節蛋白的表達，包括但不限于 1-5%,5-10%, 10-20 %、20-30 %、30-40 %、40-50 %、50-60 %、60-70 %、70-80 %、80-90 %、 90-95%和 95-9999-200200-300300-400400-500% 以及大于 500%。在又一實施方案中，方法還包括使用針對由復能基因或多能基因編碼的蛋白或蛋 白片段的抗體或針對復能或多能表面標記物的抗體選擇細胞?？梢允褂萌魏晤愋偷目贵w， 包括但不限于單克隆的、多克隆的、抗體片段、肽模擬物、活性區域的抗體以及蛋白保守區 域的抗體。在又一實施方案中，方法包括選擇細胞，以及將所述細胞擴增或培養為復能細胞 培養物或多能細胞培養物。在又一實施方案中，方法還包括使用由復能基因或多能基因驅動的報道分子或復 能或多能表面標記物選擇細胞。可以使用任何類型的報道分子，包括但不限于熒光蛋白、 綠色熒光蛋白、青色熒光蛋白(CFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、細菌螢光素酶、水母發光蛋白、 增強型綠色熒光蛋白、turbo GFP、氯霉素乙酰轉移酶(CAT)、dsRED、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶。在又一實施方案中，方法還包括使用抗性作為選擇標記物來選擇細胞，所述抗性 包括但不限于抗生素抗性、殺真菌劑抗性、嘌呤霉素抗性、潮霉素抗性、二氫葉酸還原酶抗 性、胸苷激酶抗性、新霉素抗性(neo)、G418抗性、麥考酚酸抗性(gpt)、博來霉素(zeocin) 抗性蛋白和鏈霉素抗性。在又一實施方案中，方法還包括比較在將細胞暴露于shRNA構建體之前細胞的復 能基因或多能基因的染色質結構與用所述shRNA構建體處理之后所獲得的復能基因或多 能基因的染色質結構?？梢员容^染色質結構的任何方面，包括但不限于常染色質、異染色 質、組蛋白乙?；?、組蛋白甲基化、組蛋白或組蛋白組分的存在和不存在、組蛋白的定位、組 蛋白的排列以及與染色質締合的調節蛋白的存在或不存在。可以比較基因任一區域的染色 質結構，包括但不限于增強子元件、激活子元件、啟動子、TATA框、轉錄起始位點的上游區 域、轉錄起始位點的下游區域、外顯子和內含子。抑制編碼參與轉錄阻抑的蛋白的基因表達可以通過任何合適的機制來完成，所述 機制包括但不限于RNA干擾(RNAi)。RNAi經由通過以序列特異性方式降解靶mRNA的普遍 機制來調節基因表達。小干擾RNA鏈(siRNA)是RNAi過程的關鍵，并且具有靶RNA鏈的互 補核苷酸序列。特定的RNAi途徑蛋白通過siRNA被導向靶向的信使RNA(mRNA)，它們在此 處將靶“裂解”，將靶降解為不能再被翻譯成蛋白的較小的部分。在另一實施方案中，方法包括使細胞接觸短發夾RNA(shRNA)，以及抑制編碼參與 轉錄阻抑的蛋白的至少一種基因表達。在又一實施方案中，方法還包括制備重編程的細胞。 重編程的細胞可以是復能或多能的。ShRNA是產生可用于沉默基因表達的緊密發夾彎(hairpin turn)的RNA序列； shRNA的使用是實現RNA干擾的一種方法。在一些實施方案中，可以將shRNA摻入到具有啟 動子的載體中以確保shRNA被表達，所述啟動子包括但不限于U6啟動子。載體通常被傳到 子代細胞，從而容許基因沉默被遺傳。shRNA發夾結構被細胞機構裂解為短的干擾RNA，所 述短的干擾RNA然后結合至RNA誘導的沉默復合體(RISC)。這種復合體結合并裂解與其所 結合的siRNA匹配的mRNA?？梢詫hRNA整合到慢病毒構建體中。慢病毒是逆轉錄病毒科的一類緩慢的病 毒，它由長孵育期間表征。慢病毒可以遞送大量遺傳信息給宿主細胞DNA，并且因此是基因 遞送載體的有效方法。在另一實施方案中，shRNA文庫可用于本發明的方法以鑒定參與轉錄阻抑的因子、 參與染色質重建的因子以及促使細胞為復能或多能的因子。在又一實施方案中，shRNA文 庫可以來自RNAi聯盟(TRC)，RNAi聯盟是11個世界上有名的學院和公司的生命科學研究 組的協會團體，他們的任務是制造用于功能基因組研究的全面工具并使它們廣泛可用于全 世界科學家。在麻省理工和哈佛的Broad學院發展的TRC集團目前包括靶向16，000種注 釋的人基因的159，000種預克隆的shRNA構建體。shRNA構建體、文庫和載體可以常規制備或可以購自商業來源，包括但不限于從 Dharmacon RNAi technologies (Thermo Scientific，Lafayette，CO)獲得的 SMART 載體 shRNA 慢病毒技術；從 Sigma Aldrich (St. Louis, MO)獲得的 MISSION TRC shRNA;從 Open Biosystems (Huntsville, AL)獲得的TRC慢病毒shRNA文庫；具有組成型或誘導型啟動子、不同的選擇標記物和病毒遞送選擇的BLOCK-iT RNAi載體，其用慢病毒載體和腺病毒載體 (Invitrogen, Carlsbad, CA)可獲得。此外，針對于特定靶的shRNA分子還可以從諸如OriGene (Rockvi 1 Ie，MD)和Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California)的商業來源獲得。誘導型 shRNA 也可從 Clonetech(Mountainview,CA)獲得。敲除誘導型RNAi系統緊密地調節哺乳動物細胞中有 功能的短發夾RNA(shRNA)的表達以便沉默靶基因。敲除誘導型RNAi系統在基因的阻抑是 致死的從而阻止其分析的情況下是可用的。有幾種可用的形式敲除單載體誘導型RNAi系 統和敲除Tet RNAi系統H和P。在另一實施方案中，方法包括使細胞接觸shRNAmir以及抑制參與轉錄阻抑的至 少一種基因表達。在又一實施方案中，方法還包括制備重編程的細胞。重編程的細胞可以 是復能或多能的。微RNA(miRNA)是長度為約21_23個核苷酸的單鏈RNA分子，它調節基因表達。 miRNA由DNA轉錄而來的基因編碼但是不翻譯成蛋白(非編碼RNA)；而是他們由被稱 為pri-miRNA的初級轉錄物加工為被稱為pre-miRNA的短的莖環結構并最終加工為功能 miRNA。成熟miRNA分子與一種或多種信使RNA(mRNA)分子部分互補，并且它們的主要功能 是下調基因表達。哺乳動物RNAi的shRNAmir觸發子是基于對內源微RNA生物發生途徑的現有知 識。shRNAmir構建體被設計為模擬天然的微RNA初級轉錄物，從而使得能夠被內源RNAi途 徑特異性加工并產生有效的基因敲低?；蚪M范圍的shRNAmir文庫以增加基因敲低的效 力和特異性為目標整合了幾種特征，從而提供了多種RNAi應用的方法。shRNAmir文庫可用于本發明的方法。在又一實施方案中，shRNAmir文庫可以來自 RNAi 聯盟(TRC)。shRNAmir和shRNAmir文庫可以常規制備或購自商業來源。例如，Expression Arrest 微RNA改造的shRNA (shRNAmir文庫)、逆轉錄病毒shRNAmir文庫、慢病毒shRNAmir 文庫、TRIPz慢病毒誘導型shRNAmir文庫、pSM2逆轉錄病毒shRNAmir文庫全部從Open Biosystems (Huntsville, AL)可獲得。在另一實施方案中，本發明的方法還包括使細胞接觸shRNA、shRNA文庫、 shRNAmir、shRNAmir文庫或shRNA構建體的組合，抑制參與轉錄阻抑的至少一種基因的表 達或活性，以及鑒定已被抑制的所述基因?？梢允褂脝蝹€ShRNA或shRNAmir來靶向單個基因的抑制，或者使用多于一種的 shRNA或shRNAmir來靶向單個基因的抑制。在又一實施方案中，單個shRNA或shRNAmir 可用于靶向多于一種基因的抑制。在再一實施方案中，可以使用多于一種的shRNA或多于 一種的shRNAmir來靶向多于一種基因的抑制。可以使用shRNA構建體和shRNAmir構建體 的混合物?？梢酝ㄟ^本發明的方法抑制單個基因或多于一種的基因，包括但不限于2種、3 種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、11-20種、21-30種、31-40種、41-50種和大于50 種基因?？梢酝ㄟ^本發明的方法抑制編碼參與基因表達阻抑的蛋白的任何基因，所述蛋白 包括但不限于組蛋白脫乙酰酶、甲基結合結構域蛋白、甲基腺苷轉移酶、DNA甲基轉移酶、 組蛋白甲基轉移酶和甲基循環酶、核受體、孤兒核受體、Esrr β和EssRy。可以通過本發明的方法抑制的基因的代表性列表提供于表I中。例如，甲基結合結構域蛋白如MeCP2結合甲基化的胞嘧啶并募集組蛋白脫乙酰 酶，然后組蛋白脫乙酰酶將組蛋白脫乙?；?，從而導致凝聚的染色質結構，該結構抑制轉 錄。本發明的方法可以抑制編碼阻抑復合體中的蛋白的基因表達，并從而誘導復能基因的 轉錄。表I.參與阻抑和阻抑復合體的基因的代表性列表
權利要求
1.一種重編程細胞的方法，所述方法包括將細胞暴露于干擾編碼調節蛋白的基因表 達的shRNA構建體；誘導復能基因的表達；以及選擇細胞，其中所述細胞已恢復分化潛能。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述選擇所述細胞包括比較所述細胞暴露于所述 shRNA構建體之前和之后的表型，以及鑒定具有與恢復的分化潛能一致的表型的細胞。
3.如權利要求1所述的方法，所述方法還包括將選擇的細胞擴增為細胞群。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述選擇細胞包括使用針對于由復能基因編碼的 蛋白的抗體或針對于細胞表面標記物的抗體分離細胞。
5.如權利要求4所述的方法，其中所述細胞表面標記物選自由下列組成的組SSEA3、 SSEA4、Tra-1-60 和 Tra-1-81。
6.如權利要求1所述的方法，所述方法還包括在選擇所述細胞之前，比較暴露于所述 shRNA構建體之前所述復能基因的染色質結構與暴露于shRNA構建體之后所獲得的染色質 結構。
7.如權利要求1所述的方法，其中所述基因編碼選自由下列組成的組的調節蛋白 DNA甲基轉移酶、組蛋白脫乙酰酶、賴氨酸甲基轉移酶、組蛋白脫甲基酶、賴氨酸脫甲基酶、 sirtuin,甲基結合結構域蛋白、組蛋白甲基轉移酶。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述復能基因選自由下列組成的組0ct-4、SOX-2和Nanog0
9.一種重編程細胞的方法，所述方法包括將具有第一轉錄模式的細胞暴露于小分子 抑制劑；誘導復能基因的表達；比較細胞的所述第一轉錄模式與暴露于所述抑制劑之后所 獲得的轉錄模式；以及選擇細胞，其中所述細胞已恢復分化潛能。
10.如權利要求9所述的方法，其中暴露于所述抑制劑之后的所述轉錄模式與從胚胎 干細胞分析的基因的轉錄模式至少50%相似。
11.如權利要求9所述的方法，其中在比較轉錄模式之前，比較所述細胞暴露于所述 shRNA構建體之前和之后的表型。
12.如權利要求9所述的方法，所述方法還包括將選擇的細胞擴增為細胞群。
13.如權利要求9所述的方法，其中選擇所述細胞包括使用針對于由復能基因編碼的 蛋白的抗體或針對于復能標記物的抗體分離細胞。
14.如權利要求9所述的方法，其中選擇所述細胞包括使用報道分子或對選擇標記物 的抗性分離細胞。
15.如權利要求9所述的方法，其中所述復能基因選自由下列組成的組0ct-4、Sox-2 禾口 Nanog0
16.一種富集的重編程的細胞群，所述重編程的細胞群根據包括下列步驟的方法制備 將細胞暴露于干擾編碼調節蛋白的基因表達的shRNA構建體；誘導復能基因的表達；以及 選擇細胞，其中所述細胞已恢復分化潛能。
17.如權利要求16所述的富集的重編程的細胞群，其中所述重編程的細胞表達選自由 下列組成的組的細胞表面標記物SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra_l_81。
18.如權利要求16所述的富集的重編程的細胞群，其中所述復能基因選自由下列組成 的組0ct-4、Nanog 和 Sox_2。
19.如權利要求16所述的富集的重編程的細胞群，其中所述重編程的細胞占所述群的至少60%。
全文摘要
本發明涉及重編程細胞的方法、組合物和試劑盒。在一個實施方案中，本發明涉及誘導促使細胞為復能或多能的至少一種基因表達的方法。在又一實施方案中，方法包括抑制編碼參與轉錄阻抑的蛋白的基因表達。在又一實施方案中，本發明涉及重編程的細胞或富集的重編程的細胞群，該重編程的細胞或富集的重編程的細胞群可以具有ES樣細胞的特征，它可以再分化或轉分化為分化的細胞類型。
文檔編號C12N15/113GK102083982SQ200980121404
公開日2011年6月1日 申請日期2009年4月7日 優先權日2008年4月7日
發明者K·J·埃勒特森, 瓊·S·瑞姆, 瑞秋·A·帕沃爾 申請人:紐珀滕索有限公司