專利名稱：從人干細胞中分離高活性干細胞的方法及由此分離的高活性細胞的制作方法
技術領域：
本發明涉及從人干細胞中分離高活性干細胞的方法、由該方法分離得到的干細胞 以及含有該干細胞的細胞治療劑和特定的培養基。
背景技術：
干細胞能夠分化成構成有機體組織的各種細胞，其通常指從胚胎、胎兒和成人組 織中獲得的未分化細胞。干細胞因特定的分化刺激(環境)而分化為特定的細胞；與已經 停止細胞分裂的分化細胞不同，干細胞能夠通過細胞分裂(自我更新)產生相同的細胞進 行增殖(擴增)；其特點是分化的可塑性，即它們能在不同的環境或分化刺激下可分化為其 他細胞。干細胞主要分為胚胎干細胞(ES細胞)和多能性多能成體干細胞；胚胎干細胞從 胚胎中獲得，其屬于多能干細胞，能夠分化為所有類型的細胞；多能性多能成體干細胞從組 織中獲得。胚胎發育早期胚囊期的內細胞群將來發育為胎兒，而從內細胞群中分離出的胚 胎干細胞理論上具有全能性，能夠分化為構成有機體的每一種組織的細胞。也就是說，與成 體干細胞不同，胚胎干細胞是未分化的細胞，其能夠無限增殖，可分化為所有細胞種類，而 且可通過形成生殖細胞而遺傳給下一代。人胚胎干細胞是通過分離和培養人胚囊的內細胞群而制備，全世界所有人胚胎 干細胞的制備都源自經無菌處理后冷凍保存的胚胎。由于其具備可分化為所有細胞的多 能性，這類細胞的特點為其可分化為每一種類型組織的細胞，而且可通過形成生殖細胞 而遺傳給下一代(Thomson 等.，Science，282 1145-1147，1998 ；及 Reubinoff 等，Nat. Biotechnol.，18 :399_404，2000)。使用多能性人胚胎干細胞作為細胞治療劑的各種方法仍然均未完全克服如致癌 作用和免疫排斥等問題。最近報道，間充質干細胞具有免疫調節作用并可成為解決這類問題的替代物。間 充質干細胞是多能性細胞，可分化為脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、神經細胞、心肌 細胞等，據報道其具有調節免疫反應的作用。它們可從多種組織中分離，但是，根據其來源 它們的能力和細胞表面標記彼此不同。因此，間充質干細胞目前確定能夠分化為骨細胞、軟 骨細胞、肌細胞、螺旋狀細胞，及SH2 (+)、SH3 (+)、CD34 (-)和CD45 (-)的基本細胞表面標記。細胞治療或細胞再生藥物中必需的最小細胞數目為約1X109。然而，還需要另外 數量的細胞以進行實驗確定條件和建立一個標準。就現有各種來源的間充質干細胞的情 況，獲得這個細胞數量至少需要轉代培養10代。那么，這些細胞就會老化和改變，如此會使 得它們不足以用于治療。這是當前間充質干細胞培養系統所涉及的問題之一。此外，甚至 當使用這些細胞確定了條件和標準后，在用于治療之前這些細胞就被耗盡了。這種情況下， 除了使用其他間充質干細胞外，就別無選擇了，而使用不同的細胞還需要另外進行實驗。因 此，人們需要新方法以便有可能使用現有間充質干細胞作為治療劑來解決上述問題。
韓國專利公開No. 2008-3418教導了一種誘導胚胎干細胞成為胰細胞的方法，韓 國專利No. 10-593397公開了一種含有間充質干細胞和/或P物質的愈傷或促愈傷制劑，或 細胞治療劑。發明概述因此，本發明的設計滿足上述需求，其目的是提供一種制備用于細胞治療和細胞 再生藥物的細胞，該方法克服了以前離體培養擴增人干細胞的局限，保持對老化細胞恢復 活力，應用于具有各種遺傳背景的細胞。根據本發明的一個方面，其提供用于從人干細胞中分離高活性干細胞的方法。進一步地，根據本發明的另一個方面，其提供所述方法分離的高活性干細胞。此外，根據本發明的另一個方面，其提供包含所述干細胞的細胞治療劑。再進一步地，根據本發明的另一個方面，其提供一種用于從人干細胞中分離高活 性干細胞的特定培養基。根據本發明，由于該方法可用于以前建立的間充質干細胞，以及目前提供的作為 間充質干細胞來源的、其他不同條件培養的各種來源人間充質干細胞，該方法在研制細胞 治療劑方面非常有用。


結合附圖分別所示，通過以下描述，本發明的上述及其他目的和特征將更加明 顯圖1 該照片顯示由本發明方法產生的干細胞球。圖2 對本發明方法分離的干細胞，通過熒光激活細胞分選法(FACS)做細胞周期 測定，其證實了表明旺盛增殖的S(合成)期增長。圖3 本發明方法分離的干細胞的細胞因子分泌測定，其顯示IL-6、GM_CSF、VEGF、 HGF、IL-8、IFN-g 和 bGFG 的大幅增長。圖4 通過本發明方法增強干細胞特性，其顯示0CT-4和E-鈣粘連蛋白作為多能 細胞標記的增長。圖5 該圖示出本發明方法的過程。發明詳述以下詳述本發明。為實現本發明目的，本發明提供一種從人干細胞中分離高活性干細胞的方法，其 包括培養人干細胞以形成干細胞球。更特別地，該方法包括如下步驟(a)培養人干細胞以形成干細胞球；以及(b)將所述干細胞球與其他未形成球的細胞分離。在本發明方法中，步驟(a)可以使用低吸附皮氏培養皿在無牛血清培養基中實 施。所述無牛血清培養基可優選含有無牛血清DMEM(達爾伯克氏改良伊格爾培養基， Dulbecco's Modified Eagle's Medium)和20% SR(血清替代物)。所述低吸附皮氏培養 皿是導致其吸附貼壁生長細胞時吸附效率小于5%的皮氏培養皿。優選地，步驟(a)可通過用蛋白質酶處理人干細胞和將處理過的細胞懸浮于含有 無牛血清DMEM(達爾伯克氏改良伊格爾培養基)和20% SR的培養基中20 28h來實施，優選使用低吸附皮氏培養皿培養24h。所述蛋白質酶為，但不限于，胰蛋白酶。步驟(b)可通過使用，但不限于，過濾器來將所述干細胞球與其他未形成球的細 胞分離。所述干細胞優選為間充質干細胞。本文所用術語“干細胞”是指主細胞(master cell)，其可無限增殖以形成組織和 器官的特化細胞。干細胞是多能性或多能細胞。一個干細胞分裂為兩個子干細胞，或分裂 為一個子干細胞和一個過渡細胞，并不斷增殖成為一個成熟、完全的組織類型細胞。本文所用術語“間充質干細胞”是指其可分化為成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞和其 他細胞，特征為其漩渦形狀和其標準細胞表面標記SH2 (+)、SH3 (+)、CD34 (-)和CD45 (-)的 表達量。本發明方法包括使用吸附率的皮氏培養皿在無牛血清培養基中培養人干細胞以 形成干細胞球。在所述步驟中，所述用于形成干細胞球的無牛血清培養基是DMEM標準培養 基和血清替代物(SR)的組合。本領域技術人員可以理解，根據情況多種細胞因子可以被加 入其中。本發明方法使用的血清替代物(SR)被用于替代FBS，在人胚胎干細胞培養中其目 的是去除源自動物的因素。在本發明中，SR用于提供營養和懸浮細胞，而FBS是有助于貼 壁細胞的吸附率。本發明還提供由所述方法分離的高活性干細胞。所述分離的干細胞表現出增強的 細胞因子分泌，以及增強的干細胞基因表達、細胞存活和細胞生長(參見圖2 4)。熒光激活細胞分選法(FACS)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)和實時PCT擴增證實，本 發明方法分離的干細胞與不同來源的干細胞顯示相似的結果。進一步地，本發明提供包含有本發明方法分離的干細胞的細胞治療劑。特別地，所述細胞治療劑可用于產生脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、神經細 胞、心肌細胞和其他細胞。本發明所用術語“細胞治療劑”是指包含經分離、培養和特定操作制備的人細胞 或組織并用于治療、診斷和預防(美國FDA指南)的藥物；更特別地，是指任何方法制備的 用于治療、診斷和預防的藥物，該方法包括在體外對自體、同源或異源的細胞進行增殖或分 選，或修改細胞的生物學特性以恢復細胞或組織的功能。根據其分化水平，細胞治療劑主要 分為體細胞治療劑和干細胞治療劑，而本發明涉及一種干細胞治療劑。本發明還提供一種含有SR等的、用于從干細胞中分離高活性干細胞的培養基。所 述培養基優選地可含有無牛血清DMEM(達爾伯克氏改良伊格爾培養基)和20% SR。所述 干細胞優選為間充質干細胞。本領域技術人員可以理解，所述培養基還可含有其他支持性組分以從所述干細胞 中分離高活性干細胞。本發明由下列實施例進一步說明。可以理解，這些實施例輔以圖示的方式展示的 僅為本發明的優選實施方式，并非旨在限制本發明的范圍。實施例干細胞球的形成將離體培養維持的人干細胞用蛋白質酶(0.25%胰蛋白酶/EDTA)處理，并懸浮 于使用低吸附皮氏培養皿(SPL)、含有無牛血清DMEM(達爾伯克氏改良伊格爾培養基)和 20% SR(GIBCO)的培養基中 24h。干細胞球的分離使用過濾器將通過懸浮所述細胞24h形成的干細胞球與其他未形成球的干細胞 分離。分離細胞的特件測定1)用實時PCT擴增進行基因表達量測定從分離細胞的總RNA合成了 cDNA，使用與干細胞基因相關的引物進行實時PCT擴增。2)通過抗原_抗體反應進行細胞因子測定在分離細胞的培養基中使用抗體測定各種細胞因子分泌能力。3)通過熒光激活細胞分選法(FACS)進行細胞周期測定通過細胞核染色確定分離細胞的細胞周期。實施例1 從源自人臍帶血的間充質干細胞分離高活件干細胞根據本發明方法，高活性的間充質干細胞分離自源于人臍帶血的間充質干細胞。 將離體培養維持的所述干細胞用蛋白質酶(0. 25%胰蛋白酶/EDTA)處理，并懸浮于使用 低吸附皮氏培養皿(SPL)、含有無牛血清DMEM(達爾伯克氏改良伊格爾培養基)和20% SR(GIBCO)的培養基中24h。使用過濾器將通過懸浮所述細胞24h形成的干細胞球與其他 未形成球的干細胞分離。從分離細胞的總RNA合成了 cDNA，使用與干細胞基因相關的引物 進行實時PCT擴增，測定與所述干細胞標記相關的基因表達的水平。在分離細胞的培養基 中使用抗體測定各種細胞因子分泌能力，并通過細胞核染色確定分離細胞的細胞周期。結果發現，在干細胞球形成后與干細胞相關基因表達的水平增加了，在S(合成) 期與干細胞相關基因表達的水平也大大增加了。同樣與血管生成和生長相關的細胞因子也 大大增加了。實施例2 從源自人胚胎干細胞的間充質干細胞分離高活性干細胞根據本發明方法，高活性的間充質干細胞分離自源于人胚胎干細胞的間充質干細 胞。將離體培養維持的所述干細胞用蛋白質酶(0.25%胰蛋白酶/EDTA)處理，并懸浮于使 用低吸附皮氏培養皿、含有無牛血清DMEM(達爾伯克氏改良伊格爾培養基)和20% SR的 培養基中24h。使用過濾器將通過懸浮所述細胞24h形成的干細胞球與其他未形成球的干 細胞分離。從分離細胞的總RNA合成cDNA，使用與干細胞基因相關的引物進行實時PCT擴 增，測定與所述干細胞標記相關的基因表達的水平。在分離細胞的培養基中使用抗體測定 各種細胞因子分泌能力，并通過細胞核染色確定分離細胞的細胞周期。結果發現，在干細胞球形成后與干細胞相關基因表達的水平增加了，在S(合成) 期與干細胞相關基因表達的水平也大大增加了。同樣與血管生成和生長相關的細胞因子也 大大增加了。盡管本發明已通過上述特定實施方式針進行了描述，但應能理解，本領域技術人 員可對本發明做出各種修改和變化，其也應落入本發明所附權利要求書所限定的保護范圍。
權利要求
1.一種從人干細胞中分離高活性干細胞的方法，其包括步驟(a)培養人干細胞以形成干細胞球；以及(b)將所述干細胞球與其他未形成球的細胞分離。
2.根據權利要求1的方法，其中，步驟(a)是通過利用低吸附皮氏培養皿在無牛血清培 養基中實施的。
3.根據權利要求2所述的方法，其中，所述無牛血清培養基含有無牛血清的DMEM和 20% SR (血清替代物)。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟(a)是通過利用低吸附皮氏培養皿，用蛋白 質酶處理人干細胞及將處理過的細胞懸浮于含有無牛血清的DMEM和20% SR的培養基中 20 28h來實施的。
5.根據權利要求1所述的方法，其中，所述干細胞為間充質干細胞。
6.通過權利要求1 5中任一項所述方法分離的高活性干細胞。
7.用于產生脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、神經細胞或心肌細胞的細胞治療劑， 其包含權利要求6所述的高活性干細胞。
8.用于由人干細胞中分離高活性干細胞的培養基，其含有無牛血清的DMEM和20%SR。
全文摘要
本發明涉及從人干細胞中分離高活性干細胞的方法、通過該方法分離得到的干細胞、含有該干細胞的細胞治療劑，以及用于由含有特定細胞因子的干細胞中分離高活性干細胞的培養基。根據本發明，該方法可用于從各種來源的間充質干細胞中分離高活性干細胞。此外，由于本發明的方法可應用于在不同條件下培養的、各種來源的干細胞，其在開發高活性的細胞治療劑方面非常有用。基于體外數次轉代培養增加的老化干細胞可被有效地挑選出來，因而本發明的方法可用于活化干細胞。
文檔編號C12N5/0775GK102112599SQ200980129793
公開日2011年6月29日 申請日期2009年7月17日 優先權日2008年7月28日
發明者姜炫在, 李銀珠, 金孝洙 申請人:首爾大學醫院