專利名稱：柳枝稷生物學防范的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于轉基因植物的生物防范的方法和材料。具體而言，本發明屬于可用于使柳枝稷(SWitchgrass)中不必要的轉基因傳遞最小化的方法和材料。
背景技術：
柳枝稷是黍科的一種耐寒的多年生暖季草。柳枝稷原產于美國和加拿大中部平原，并且能生長到高達1.8m至2. 2m。柳枝稷通過根莖和小穗上生成的種子繁殖。通常認為一片柳枝稷生長三年才能達到其完全的潛力。柳枝稷使用C4碳固定途徑，所述C4碳固定途徑允許其生長期期間水利用效率的改善，這在干旱和高溫條件下提供了優勢。一旦建立， 柳枝稷還耐受水淹，而且生長快速，捕獲相當大量的太陽能，并將其轉化成木質纖維素組分形式的儲能。柳枝稷作為牧草、作為控制侵蝕的地被物及作為家畜飼料使用。柳枝稷在氮固定方面是高度有效的，而且可以在作物輪作中種植以補充被其它作物(諸如玉米)自土壤消耗的營養物。柳枝稷也可以作為能源作物使用。柳枝稷作為能源作物提供了重要的優點，這部分是因為它可以液化、氣化或直接燃燒。一旦在田地中建立，它通常每年或每半年收獲，在再種植前持續10年或更長。自柳枝稷的乙醇生產可提供的凈能量輸出比玉米多20倍，而且自空氣除去相當多的C02。柳枝稷具有每公噸植物材料生產多達100加侖(380升)乙醇的潛力，與來自甘蔗蔗糖的665加侖乙醇和來自玉米淀粉的400加侖相比，這給予柳枝稷每英畝生產1000加侖乙醇的潛力。柳枝稷顆粒的燃燒可以導致僅剩余初始質量的3%至4%作為灰燼，這部分是由于與涼季草相比，柳枝稷的硅和氯含量較低。可以通過讓柳枝稷在田地里過冬，由此進一步經由淋洗過程來降低硅和氯含量，從而進一步降低灰分含量。與粘土形成對比，從灰分含量觀點來看，在砂類土中生產柳枝稷也有優點，這又基于硅和氯含量。現在，轉基因植物在農業產業中是常見的。柳枝稷中期望的轉基因性狀包括昆蟲抗性、應激耐受性和增加的生物質產率。隨著轉基因柳枝稷植物得到開發并引入環境中，控制轉基因性狀從轉基因柳枝稷植物向其它傳統的和轉基因的柳枝稷品種或者甚至其它植物物種的不期望的擴散是重要的。雖然已經采用物理隔離和花粉捕捉邊行來控制研究條件下的其它物種的轉基因植物，但是這些方法都很麻煩，而且對于柳枝稷而言是不實際的。在沒有機械干預的情況下，有效控制轉基因性狀的傳遞和表達的方式對于管理生物質制備中使用的轉基因柳枝稷植物會是有用的。發明概述本發明的特征在于可用于控制轉基因性狀在柳枝稷植物中傳遞的方法和材料。本發明的方法和材料使轉基因性狀從一種轉基因柳枝稷植物群體向其它柳枝稷群體的不必要的傳遞最小化或者甚至消除，因此便于栽培轉基因柳枝稷。在一個方面，本發明的特征在于一種用于生成柳枝稷種子的方法和通過所述方法生成的F1種子和植物。該方法包括雜交在傳粉方面接近多個第二柳枝稷植物處種植的多個第一柳枝稷植物。第一柳枝稷植物對于第一外源核酸是純合的，所述第一外源核酸包含與植物不育序列可操作連接的轉錄因子激活序列。第二柳枝稷植物對于第二外源核酸是純合的，所述第二外源核酸包含與結合激活序列的轉錄因子的編碼序列可操作連接的調節區。所述方法還包括收集在第一柳枝稷植物和/或第二柳枝稷植物上形成的F1種子。 自F1種子種植的F1柳枝稷植物表達植物不育序列，而且是不育的。第一柳枝稷植物、第二柳枝稷植物或第一和第二柳枝稷植物兩者是克隆繁殖性植物。例如，第一柳枝稷植物可以是克隆繁殖性植物，而第二柳枝稷植物是遺傳異質植物群體。或者，第一柳枝稷植物和第二柳枝稷植物兩者可以是克隆繁殖性植物。作為另一個備選，第一柳枝稷植物可以是異質植物群體，而第二柳枝稷植物可以是克隆繁殖性植物。在一些實施方案中，第一柳枝稷植物是克隆繁殖性四倍體植物，而且展現出小于 0. 3%的平均自交親和性百分比。在一些實施方案中，第一柳枝稷植物是八倍體克隆繁殖性植物，而且展現出小于1. 3%的自交親和性百分比。在一些實施方案中，第二柳枝稷植物是四倍體克隆繁殖性植物，而且展現出小于0. 3%的平均自交親和性百分比。在一些實施方案中，第二柳枝稷植物是八倍體克隆繁殖性植物，而且展現出小于1. 3%的平均自交親和性百分比。在一些實施方案中，自第一柳枝稷植物和第二柳枝稷植物兩者收集F1種子。在一些實施方案中，F1植物生成平均每株植物小于0. 5個能育種子。在一些情況中，F1植物不能生成雄配子、雌配子或雄配子和雌配子兩者。第一柳枝稷植物和第二柳枝稷植物間的平均雜交性百分比可以是約69%至約 95%。例如，第一柳枝稷植物和第二柳枝稷植物可以是四倍體，低地生態型的，而且具有約 80%至約95%的平均雜交性百分比，例如約86%至約91%。第一柳枝稷植物可以展現出緊密的花序，而第二柳枝稷植物展現出散開的花序。 第一柳枝稷植物可以展現出一致的開花時間，而第二柳枝稷植物展現出不一致的開花時間。第二柳枝稷植物可以展現出緊密的花序，而第一柳枝稷植物展現出散開的花序。第二柳枝稷植物可以展現出一致的開花時間，而第一柳枝稷植物展現出不一致的開花時間。相對于自第二柳枝稷植物收集的種子，自第一柳枝稷植物收集的種子可以具有統計上顯著升高的平均種子重量。相對于自第一柳枝稷植物收集的種子，自第二柳枝稷植物收集的種子具有統計上顯著升高的平均種子重量。在一些實施方案中，種植步驟包括以第一柳枝稷植物第二柳枝稷植物大于 4 1的比率種植柳枝稷植物。種植步驟可以包括以第二柳枝稷植物第一柳枝稷植物大于4 1的比率種植柳枝稷植物。第一柳枝稷植物和第二柳枝稷植物可以是四倍體植物。 第一柳枝稷植物和第二柳枝稷植物可以是低地型柳枝稷植物。
第一柳枝稷植物可以對于外源核酸展現出純合性，所述外源核酸包含與第二植物不育序列可操作連接的第一轉錄因子激活序列。第一柳枝稷植物可以對于外源核酸展現出純合性，所述外源核酸包含與第二植物不育序列可操作連接的第二轉錄因子激活序列，并且第二柳枝稷植物對于外源核酸展現出純合性，所述外源核酸包含與結合第二激活序列的第二轉錄因子的編碼序列可操作連接的調節區。第一柳枝稷植物和/或第二柳枝稷植物可以進一步包含轉基因(例如賦予除草劑抗性的轉基因)。第一柳枝稷植物和/或第二柳枝稷植物對于轉基因展現出純合性。植物不育序列可以編碼多肽。例如，多肽可以具有大于約175的HMM比特得分(HMM bit score)，其中HMM基于

圖1中所描繪的氨基酸序列，且其中與不包含所述核酸的對照植物相比，植物具有降低的能育性。多肽可以包含與SEQ ID NO :5的殘基134至185具有至少80%序列同一性的AP2結構域、CMX-I基序和CMX-2基序。在一些實施方案中，多肽包含與SEQ IDNO 5的殘基134至185具有至少90%序列同一性的AP2結構域、CMX-I基序和CMX-2基序。在一些實施方案中，多肽包含與SEQ ID NO 5的殘基134至185具有至少 95%序列同一性的AP2結構域、CMX-I基序和CMX-2基序。在一些實施方案中，多肽包含與選自下組的序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列=SEQ ID N0:5、6、8、10、ll、13、15、 17、19、21、22、24、25、26、27、28、29和31中所列的序列。在一些實施方案中，植物不育多肽包含DUF640結構域。在一些實施方案中，植物不育序列包含SEQ ID NO 1、2、3和32中所列的核苷酸序列之任一種的至少50個連續的核苷酸，而且被轉錄成轉錄產物。轉錄因子可以是嵌合轉錄因子，其包含選自下組的結合結構域Lex Α、乳糖操縱子(Lac Operon)、ArgR和合成的Si指蛋白。轉錄因子可以是嵌合轉錄因子，其包含選自下組的激活結構域C1、ATMYB2、HAFL-I、ANT、ALM2、AvrXalO, VPl、DOF 和 RISBZl。調節區是廣泛表達型啟動子，例如玉米泛素啟動子。調節區可以是光合組織啟動子。相對于缺乏第一外源核酸和第二外源核酸的對照柳枝稷植物，自F1種子種植的植物在第二生長季節或隨后的生長季節中可以具有統計上顯著升高的生物質。還有的特征在于多個F1雜種轉基因柳枝稷種子，其通過以下方法生成，包括在傳粉方面接近多個第二柳枝稷植物處種植多個第一柳枝稷植物，雜交第一柳枝稷植物與第二柳枝稷植物，并收集在第一柳枝稷植物和/或第二柳枝稷植物上形成的F1種子。第一柳枝稷植物對于第一外源核酸是純合的，所述第一外源核酸包含與植物不育序列可操作連接的轉錄因子激活序列。第二柳枝稷植物對于第二外源核酸是純合的，所述第二外源核酸包含與結合激活序列的轉錄因子的編碼序列可操作連接的調節區。第一柳枝稷植物、第二柳枝稷植物或第一和第二柳枝稷植物兩者是克隆繁殖性植物。自F1種子種植的F1柳枝稷植物表達植物不育序列，而且是不育的。第一柳枝稷植物和第二柳枝稷植物可以具有大于約65% 的雜交性百分比。還有的特征在于一種用于生成柳枝稷種子的方法。該方法包括雜交在傳粉方面接近多個第二柳枝稷植物處種植的多個第一柳枝稷植物，并收集在第一柳枝稷植物和/或第二柳枝稷植物上形成的F1種子。第一植物對于第一外源核酸是純合的，所述第一外源核酸包含與植物不育序列可操作連接的轉錄因子激活序列。植物不育序列含有SEQ ID NO=U 2、3和32中所列的核苷酸序列之任一種的至少50個連續的核苷酸。第二植物對于第二外源核酸是純合的，所述第二外源核酸包含與結合激活序列的轉錄因子的編碼序列可操作連接的調節區。自F1種子種植的F1柳枝稷植物表達植物不育序列，而且是不育的。還有的特征在于一種種植柳枝稷的方法。該方法包括在第一生長季節期間種植F1 雜種柳枝稷植物，并在第二生長季節或隨后的生長季節中自柳枝稷植物收獲生物質。F1植物對于第一外源核酸是半合子的，所述第一外源核酸包含與植物不育序列可操作連接的轉錄因子激活序列。植物不育序列可以編碼多肽。例如，多肽可以具有大于約175的HMM比特得分，其中HMM基于圖1中所描繪的氨基酸序列，且其中與不包含所述核酸的對照植物相比，所述植物具有降低的能育性。多肽可以包含與SEQ ID NO :5的殘基134至185具有至少80%序列同一性的AP2結構域、CMX-I基序和CMX-2基序。在一些實施方案中，多肽包含與SEQ ID NO 5的殘基134至185具有至少90%序列同一性的AP2結構域、CMX-I基序和 CMX-2基序。在一些實施方案中，所述多肽包含與SEQ ID NO 5的殘基134至185具有至少95%序列同一性的AP2結構域、CMX-I基序和CMX-2基序。在一些實施方案中，多肽包含與選自下組的序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列=SEQ IDNO :5、6、8、10、11、13、 15、17、19、21、22、24、25、26、27、28、29和31中所列的序列。在一些實施方案中，植物不育多肽含有DUF640結構域。在一些實施方案中，植物不育序列含有SEQ ID N0:l、2、3和32中所列的核苷酸序列之任一種的至少50個連續的核苷酸。F1植物對于第二外源核酸也是半合子的，所述第二外源核酸包含與結合激活序列的轉錄因子的編碼序列可操作連接的調節區。F1柳枝稷植物表達植物不育序列，而且是不育的。除非另有定義，本文中所使用的所有技術術語和科學術語都具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的意思一樣。雖然可以使用與本文中所描述的方法和材料相似或等效的方法和材料來實施本發明，但是下文描述了合適的方法和材料。所有本文提到的出版物、專利申請、專利和其它參考文獻據此以引用的方式并入本文。在發生沖突時，以本說明書(包括定義)為準。此外，材料、方法和例子僅是示例性的，而并不意圖為限制性的。在一些實例中，本發明的特征可以基本上由所述特征組成，而非包含所述特征。僅為了方便而提供章節標題。根據專利法的標準慣例，權利要求書中的詞“包含”可以用“基本上由...組成”或“由...組成”替換。通過以下詳細描述，本發明的其它特征和優點將顯而易見。附圖簡述圖1 (A-E)是與Ceres Clone :123905 (SEQ ID NO 5)對應的氨基酸序列與同源和/ 或直向同源氨基酸序列的比對。在此比對中，比對序列中的虛線代表缺口，即在該位置缺乏氨基酸。比對序列間相同的氨基酸或保守的氨基酸取代用框鑒定。圖1是使用程序MUSCLE 第3. 52版產生的。發明詳述本發明提供了用于有效使重組DNA從轉基因柳枝稷植物向其它柳枝稷群體的不必要的傳播最小化的新方法和材料。本發明部分基于如下的發現，即盡管事實是柳枝稷具有不同的倍性水平，而且展現出顯著的自交不親和性，但是某些核酸構建體在發育上適當的表達可以成功控制轉基因柳枝稷的能育性。新方法導致不育柳枝稷植物的生成，所述不育柳枝稷植物可以按商業規模種植，關于此類植物中存在的轉基因的不必要的擴散的擔憂較小。此外，柳枝稷不育使得可以容易地在田地中對其評分，這有助于評估轉基因效果，并且允許在必要時采取補救措施。如本文中所描述的，不育多肽(諸如SEQ ID NO 5中所列的多肽或其同系物)在發育上適當的表達可以引起柳枝稷的開花缺陷。開花缺陷是容易顯而易見的，因為此類植物不育多肽的表達可以阻止橙色花藥自小花出現。橙色花藥的存在或缺失可以在田地中容易地觀察到，而不需要更尖端的或更費時的測定法。此外，在柳枝稷中少數開放的小花內， 可以降低結籽(seed set)。另外，由SEQ ID NO 5中所列的多肽或其同系物引起的不育不引起生物質產率拖曳，而且使得仍以不改變圓錐花序對生物質產率成分貢獻的方式發生圓錐花序形成。與此相反，一些其它不育多肽通過損害圓錐花序生長或降低植物生長的機制來起作用。I.定義“細胞類型優先性啟動子(Cell type-preferential promoter) ”或“組織優先性啟動子(tissue-preferential promoter) ”指分別優先在靶細胞類型或組織中驅動表達， 但是也可以在其它細胞類型或組織中弓丨起一些轉錄的啟動子。“對照植物”指不含感興趣的轉基因植物中存在的外源核酸，但是在其它方面與此類轉基因植物具有相同或相似遺傳背景的柳枝稷植物。合適的對照植物可以是非轉基因野生型植物、來自轉化實驗的非轉基因分離子或含有與感興趣的外源核酸不同的外源核酸的轉基因植物。“域/結構域(domain) ”指多肽中可以用于表征蛋白質家族和/或蛋白質部分的基本上連續的氨基酸組。此類結構域具有“指紋”或“標簽(signature)”，其可以包含保守的一級序列、二級結構和/或三維構象。一般而言，結構域與特定的體外和/或體內活性相關。結構域可以具有10個氨基酸至400個氨基酸的長度，例如10至50個氨基酸，或25至 100個氨基酸，或35至65個氨基酸，或35至55個氨基酸，或45至60個氨基酸，或200至 300個氨基酸，或300至400個氨基酸。就核酸而言的“外源的”指明核酸是重組核酸構建體的部分，或者不在其天然環境中。例如，外源核酸可以是從一種物種引入另一種物種中的序列，即異源核酸。通常，經由重組核酸構建體將此類外源核酸引入另一物種中。外源核酸對于生物體而言也可以是天然的、并且已經再引入所述生物體的細胞中的序列。包含天然序列的外源核酸常?？梢酝ㄟ^與外源核酸連接的非天然序列(例如重組核酸構建體中在天然序列側翼的非天然調節序列)的存在來與天然存在的序列區分。另外，經穩定轉化的外源核酸通常整合在與找到天然序列的位置不同的位置。應當領會，外源核酸可以已經被引入祖先中，而非引入所考慮的細胞中。例如，含有外源核酸的轉基因植物可以是經穩定轉化的植物與非轉基因植物間雜交的后代。認為此類后代含有外源核酸?！氨磉_”指經由由酶，即RNA聚合酶催化的轉錄將多核苷酸的遺傳信息轉化成RNA， 及經由核糖體上的mRNA翻譯而轉化成蛋白質的過程。如本文中所使用的，“異源多肽”指柳枝稷植物細胞(例如經來自玉米(Zeamays) 植物的氮轉運蛋白多肽編碼序列轉化且表達該編碼序列的轉基因柳枝稷(Panicum virgatum)植物)中不作為天然存在多肽的多肽?！昂怂帷焙汀岸嗪塑账帷痹诒疚闹锌苫Q使用，指RNA和DNA兩者，包括cDNA、基因組DNA、合成DNA和含有核酸類似物的DNA或RNA。多核苷酸可以具有任何三維結構。核酸可以是雙鏈或單鏈(即有義鏈或反義鏈)。多核苷酸的非限制性例子包括基因、基因片段、 外顯子、內含子、信使RNA (mRNA)、轉運RNA、核糖體RNA、siRNA、微小RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、核酸探針和核酸引物。多核苷酸可以含有非常規的或經修飾的核苷酸。“可操作連接的”指在核酸中布置調節區和要轉錄的序列，使得調節區對于調節所述序列的轉錄或翻譯是有效的。例如，為了可操作連接編碼序列和調節區，編碼序列的翻譯讀碼框的翻譯起始位點通常位于調節區下游1至約50個核苷酸。然而，調節區可以位于翻譯起始位點上游多至約5，000個核苷酸，或者在轉錄起始位點上游約2，000個核苷酸。如本文中所使用的，“多肽”指具有兩個或更多個亞基氨基酸、氨基酸類似物或其它模擬肽(p^tidomimetic)，而不管翻譯后修飾，例如磷酸化或糖基化的化合物。亞基可以通過肽鍵或其它鍵(諸如例如酯或醚鍵)來連接。此定義涵蓋全長多肽、截短的多肽、點突變體、插入突變體、剪接突變體、嵌合蛋白及其片段。“后代”包括特定植物或植物品系的后代。本植物的后代包括在FpF2IyFpFpF6 和后續世代植物上形成的種子或在BCpBCyBQ和后續世代植物上形成的種子，或在F1BCp F1BC2, F1BC3和后續世代植物上形成的種子。名稱F1指遺傳上獨特的兩個親本間雜交的后代。名稱F2、F3、F4、F5和F6指F1植物的自花傳粉或近緣授粉后代的后續世代?！罢{節區”指具有影響轉錄或翻譯啟動和速率以及轉錄或翻譯產物的穩定性和/或流動性(mobility)的核苷酸序列的核酸。調節區包括但不限于啟動子序列、增強子序列、 應答元件、蛋白質識別位點、可誘導元件、蛋白質結合序列、5’和3’非翻譯區(UTR)、轉錄起始位點、終止序列、聚腺苷酸化序列、內含子及其組合。調節區通常包含至少一個核心(基礎)啟動子。調節區還可以包含至少一個控制元件，諸如增強子序列、上游元件或上游激活序列(UAS)。例如，合適的增強子是來自章魚堿合酶(ocs)基因上游區的順式調節元件 (-212 至-154)。Fromm 等，The Plant Cell，1 :977-984 (1989)?！吧险{”或“激活”指相對于基礎或天然狀態，提高表達產物(mRNA、多肽或兩者) 生成的調節，而“下調”或“阻抑”指相對于基礎或天然狀態，降低表達產物(mRNA和/或多肽)生成的調節。II.用于生成不育柳枝稷的方法在一個方面，本發明的特征在于用于生成不育F1雜種柳枝稷種子和植物的方法。 該方法包括雜交多個第一柳枝稷植物與多個第二柳枝稷植物。兩類親本植物各含有一種或多種轉基因，其在F1后代中組合時組合操縱，使得F1后代種子可以發芽，而自此類種子種植的F1植物是不育的。如下文更為詳細地闡明，第一柳枝稷植物含有第一核酸構建體，其包含與植物不育序列可操作連接的轉錄因子UAS和啟動子。第二柳枝稷植物含有編碼轉錄因子的核酸， 所述轉錄因子對于結合UAS是有效的。在雜交兩類柳枝稷植物后，接著發生種子發育。轉錄因子在F1種子或F1植物中的表達激活植物不育序列的轉錄，其繼而產生不育的F1植物。 因為所有或基本上所有F1植物是不育的，所以使這些轉基因或此類植物中存在的任何其它轉基因向其它柳枝稷植物的轉移最小化或者消除。因此，轉基因向其它柳枝稷植物的不必要的擴散得到有效地阻止。親本植物
有兩種不同的通用柳枝稷生態型，即低地和高地。低地柳枝稷主要是四倍體(2η =4x = 36條染色體)，而高地柳枝稷栽培種主要是八倍體On = 8x = 72條染色體)。要作為親本使用的轉基因柳枝稷植物可以與其它具有相同生態型的親本轉基因柳枝稷植物及具有相同倍性(Ploidy)水平的另一生態型的植物雜交。通常，第一柳枝稷親本植物和/或第二柳枝稷親本植物是克隆繁殖性植物。用于生成克隆繁殖性第一柳枝稷親本和/或第二柳枝稷親本的特別有用的技術記載于2009年 7月22日提交的申請NO.PCT/US2009/051355中。第一柳枝稷親本植物、第二柳枝稷親本植物或這兩種親本植物在此類方法中可以起雌性親本作用?？寺》敝承粤︷⒅参镌谠S多基因座上展現雜合性，但是由于每株植物是通過從同一克隆繁殖而生成的，所有每株植物具有基本上相同的基因型。因此，可以認為作為親本使用的克隆繁殖性植物是遺傳上一致的。應當領會，克隆繁殖性親本植物可以具有較少比例的非克隆繁殖性植物，其或是故意添加的或是由于疏忽而存在的。在一些實施方案中，第一植物是克隆繁殖性植物，而第二植物是尚未克隆繁殖并且因此是遺傳上異質的柳枝稷品種或品系的植物。相反，第一植物可以是克隆繁殖性植物， 而第二植物可以是尚未克隆繁殖的柳枝稷品種或品系的植物。具有在遺傳上異質的一類親本植物可以維持不育F1后代中的遺傳多樣性，使得F1植物可以適應于多種多樣的環境條件，所述環境條件可以在F1植物群落出于商業目的使用的年份期間發生。第一柳枝稷親本植物或第二柳枝稷親本植物在這些實施方案中可以起雌性親本作用。可以通過植物育種方法來開發適合于在本文所描述的方法中作為親本之一使用的柳枝稷品種或品系，所述植物育種方法通常記載于例如Allard，Principles of Plant Breeding,John Wiley & Sons,Inc. (1960) ；Simmonds,Principles of Crop Improvement, Longman Group Limited(1979)；及 Jensen, Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc. (1988)。明確可適用于柳枝稷的詳細育種方法考慮在要存在于親本植物中的轉基因方面達到純合性的必要性。例如，柳枝稷品種可以通過混合選擇程序來開發。在混合選擇中，對期望的個體植物進行選擇、收獲、并在不進行后代測試的情況下復合種子以產生下一世代。因為選擇僅僅基于母系親本，而且在傳粉上沒有對照，所以混合選擇相當于伴有選擇的隨機交配形式?；旌线x擇通常增加期望的基因型在群體中的比例。或者，可以利用具有后代測試的選擇程序。具有后代測試的選擇程序一般比混合選擇優選。具有柳枝稷后代測試育種程序的選擇的例子包括用于品種改良的約束性輪回表型選擇(Restricted Recurrent Phenotypic Selection, RRPS)和半同胞家族間及半同胞家族內選擇(Between and Within Half-Sib Family Selection^ & WFS)?？梢酝ㄟ^這些程序之任一種來開發適合作為親本的柳枝稷品種。另一種備選是在基因型輪回選擇程序中開發柳枝稷親本品種。 Taliaferro, Breeding and Selection of New Switchgrass Varieties for Increased Biomass Production, Oak Ridge National Laboratory USA Q002)?；蛐洼喕剡x擇依賴于建立年的次年對半同胞后代性能的分析。作為另一種備選，可以開發合成品種以作為親本使用。合成品種通過雜交數種初始來源植物來生成。用于開發合成物的初始植物品種、 群體、野生添加物(wild accession)、生態型等的數目可以從僅僅10變化至多達500。通常，使用約100至300種品種、群體等來啟動合成品種的開發。隨后，來自初始種子生產樣地的種子可以經歷一個或多個世代的繁殖，這取決于在轉基因方面達到純合性所需要的世代數目和執行親本雜交所期望的種子量。轉基因柳枝稷植物可以進入育種程序中，以將不同外源核酸引入柳枝稷品系中或者用于進一步選擇其它期望的性狀，之后使用該植物作為親本來生成F1雜種。轉基因遺傳不管親本植物是否通過克隆繁殖獲得，要在本文中所描述的方法中作為親本使用的柳枝稷植物育種為對于賦予植物不育中牽涉的轉基因展現出純合性。柳枝稷是異源四倍體或異源八倍體，因此，一般在給定的遺傳基因座(包括轉基因基因座)方面展現出二體遺傳。然而，并不是所有的基因座會遵循單一的遺傳模式，因為同源染色體與雙減數之間的優先配對偶爾可以在柳枝稷中發生，這導致在一些情況下的分離異常(segregation distortion)0因此，一般期望確認的是，特定的轉基因事件表現為純合子，之后進展為在所述方法中使用來自該事件的植物作為親本。因此，例如，含有第一外源核酸(包含植物不育序列)的轉基因柳枝稷植物選擇為純合的，而且在外源核酸方面展現出單一的孟德爾遺傳 (Mendelian inheritance) 0作為另一個例子，含有第二外源核酸(包含轉錄因子編碼序列)的轉基因柳枝稷植物選擇為純合的，而且在外源核酸方面展現出單一的孟德爾遺傳。 作為另一個例子，含有第三外源核酸(包含感興趣的序列)的轉基因柳枝稷植物選擇為純合的，而且在外源核酸方面展現出單一的孟德爾遺傳。在這點上，經由分子分析的后代測試在回交過程中可以是特別有用的，以獲得含有外源核酸的群體。所述群體進行多系雜交同胞交配，接著進行后代測試以鑒定純合個體，然后便可以產生期望的轉基因親本系。雜交親本植物通過種植在傳粉方面接近的多個兩類植物來雜交第一柳枝稷親本植物和第二柳枝稷親本植物。兩類親本植物可以在不同行中種植或者可以隨機間作，并且在適合于柳枝稷且本領域中已知的農藝學實踐下在田地中種植。在任意方案中，第一親本植物與第二親本植物的比率可以從1 10變化至10 1，例如第一親本第二親本比率可以是9 1、 4 1、1 1、1 4或1 9。技術人員可以基于諸如雄性親本的花粉脫落和雌性親本的花粉接收性等因素來做出合適比率的選擇。雜交通常經由風媒傳粉發生，盡管也可以經由手工傳粉發生，例如可以用手將來自第二類植物的花粉傳給第一類植物，和/或可以用手將來自第一類植物的花粉傳給第二類植物。在一些實施方案中，傳粉牽涉除去一組親本植物的植物上的花粉形成結構以便阻止自花傳粉，由此允許來自另一組植物的花粉的手工或天然傳粉。柳枝稷展現出部分或完全自交不親和性。因此，第一柳枝稷植物和第二柳枝稷植物在方法中都可以起雌性親本的作用，每類植物通過來自另一親本的花粉受精。有時期望具有僅在親本之一上優先形成的種子。在此類情況下，優先形成種子的親本稱作假雌性，而起花粉供體作用的親本稱作假雄性。在存在完全自交不親和性時，在本文中所描述的方法中作為親本使用的柳枝稷植物不需要諸如雄性不育系統或除去花粉形成結構等措施來使異花傳粉發生。對于四倍體柳枝稷植物而言，完全自交不親和性指小于0.3%的平均自交親和性百分比，如通過 Martinez-Reyna等Crop Sci. 42 =1800-1805(2002)的方法所測定的。對于八倍體柳枝稷植物，完全自交不親和性指小于1. 3%的平均自交親和性百分比，如通過Martinez-Reyna等Crop Sci. 42 =1800-1805(2002)的方法所測定的。使用完全自交不親和性的親本確保生產田地中所生產的種子主要是或者甚至專門是F1雜種種子。期望使用如下的親本，其已經表明為生成(通過雜交性百分比測定的)高百分比后代種子。雜交性百分比指兩種不同的柳枝稷品種或群體的植物間進行受控的雜交后去雄并受精的每個小花獲得的種子的百分比，如記載于Martinez-Reyna等Crop Sci. (38 876-878(1998)及 Martinez-Reyna 等 Crop Sci. 42 1800-1805 (2002)中的。因此，期望使用雜交性百分比大于65%，例如66%至85%、66%至80%、69%至85%、70%至75%、73% 至 80%、75% 至 95%、80% 至 95%、85% 至 95%、85% 至 90%、80% 至 90%、90% 至 95% 或 66%和95%之間的任何范圍之間的親本。雜交性百分比受諸如親本是否在相似時間開花等因素的影響。此外，并不是所有配對必然會導致不育后代，這是由于例如插入有轉基因的基因組位置對自交不親和性可具有的影響所致。因此，候選親本對通常以成對組合雜交，以鑒定那些具有合適的雜交性百分比的親本對。如果一個親本或兩個親本具有部分自交不親和性(對于四倍體為0.3%或更多和對于八倍體為1.3%或更多的平均自交親和性百分比)，那么可以用手將來自第二類植物的花粉傳給第一類植物，和/或可以用手將來自第一類植物的花粉傳給第二類植物。在一些實施方案中，除去第一類植物上的花粉形成結構以阻止自花傳粉，由此允許來自第二植物的花粉的手工或風媒傳粉。在一些實施方案中，一類親本植物展現出緊密的花序。其它類型的親本植物可以展現出散開的花序。在此類實施方案中具有緊密花序的親本會具有較小的落粒性 (shattering)，而且在此親本是雌性時用來提高自雜交獲得的F1雜種種子的收率。在一些實施方案中，一類親本植物展現出一致的開花時間。其它類型的親本植物可以展現出不一致的開花時間。在此類實施方案中具有一致開花時間的親本會具有較一致的收獲期，而且在此親本是雌性時用來便于收集Fl雜種種子時的收獲操作。收集種子柳枝稷的種子成熟通常在受精后約一個月期間里發生。一旦已經達到種子發育的合適階段，便通過從親本植物之一(意圖起雌性親本作用的類型)收獲種子或者通過自這兩類親本植物收獲種子來收集Fl種子。本文中所描述的方法涵蓋任一種收獲技術。如果僅從一種親本類型收集Fl種子，那么雌性植物優選是具有緊密花序和/或一致開花時間的植物。雌性中一種性狀或兩種性狀的存在可以使降低Fl種子收率的種子落粒效果最小化。 一致開花性狀的存在還會用來使收獲種子所需要的時間量最小化。通過本文中所描述的方法生成的Fl雜種種子是不育的，即此類種子具有高發芽率(germination percentage)，但是所得的Fl雜種植物生成很少的F2種子或者無 F2種子。此類Fl種子的發芽率大于80%，如通過Aiken等，J. Range Management 48: 455-458 (1995)的方法根據未分大小的種子測定的，例如大于85%、86 %、87%、88 %、89 % 或90 %。認為在由此類Fl植物所生成的F2種子的平均數目小于每株植物0. 5個能育種子(例如小于每株Fl植物0. 4,0. 3,0. 2,0. 1,0. 05,0. 01或0. 005個能育種子)時，Fl植物是不育的。認為在F2種子的平均數目如此之低以至于檢測不到時，Fl植物也是不育的。 每株植物的F2種子的平均數目如下計算，S卩如記載于Crop Sci. 47 =636-642(2007)中的那樣從至少100株Fl植物分離種子，通過Aiken等1995(見上文)的方法來測定發芽種子的數目，并用發芽種子的數目除以Fl植物的數目。在一些實施方案中，自一類親本柳枝稷植物收集的Fl種子相對于自另一類親本植物收集的每100個Fl種子的平均重量具有統計上顯著增加的每100粒種子的平均重量。 每100粒種子的平均重量通過標準方法來測定，而且對于低地生態型而言通常范圍為約 50mg 至約 160mg/100 粒種子，例如每 100 粒種子 60、70、80、90、100、110、120、130、140、150 或160mg。因此，例如，一類低地親本植物可以生成如下的種子，其具有每100粒種子約80 至約lOOmg，或約100至約120mg，或約120至約160mg的每100粒種子平均重量，而且顯著高于另一類親本植物的平均值。每100粒種子的平均重量對于高地生態型而言通常范圍為約 IOOmg 至約 230mg/100 粒種子，例如每 100 粒種子 100、110、120、130、140、150、160、170、 180、190、200、210、220、230、對0、250或洸011^。例如，一類高地親本植物可以生成如下的種子，其具有每100粒種子約100至約120mg，或約120至約160mg，或約160至約180mg，或約 180至約200mg，或約200至約220mg，或約220至約MOmg，或約240至約160mg的每100 粒種子平均重量，而且顯著高于另一類親本植物的平均值。通常，認為相對于對照的參數量的差異用合適的參數或非參數統計量(例如卡方檢驗、學生t檢驗、Mann-Whitney檢驗或F檢驗)在ρ < 0. 05時是統計上顯著的。因此， 例如，認為來自一類親本植物的Fl種子的每100粒種子平均重量相對于另一類親本植物的每100粒種子平均重量更高在ρ < 0. 01、ρ < 0. 005或ρ < 0. 001時是統計上顯著的。III.核酸棺物不育序列。本文中所描沭的F1轉基因柳枝稷植物含有包含與轉錄因子UAS可操作連接的植物不育序列的外源核酸。植物不育序列(其受UAS控制)的過表達或適時表達導致具有高發芽率的F1種子和不育F1植物(例如不產生或產生異常花結構，或產生不能形成雄配子和/或雌配子的花結構的F1植物)的生成。植物不育序列可以編碼多肽，例如種子發育中牽涉的多肽。在一些實施方案中，植物不育序列編碼含有ΑΡ2結構域的植物不育多肽。ΑΡ2結構域在轉錄因子蛋白中找到，而且能結合DNA。轉錄因子的ΑΡ2家族還可以包括CMX-I基序(EXEX4VX2LX2VXSGX5P)和CMX-2 基序(CX2CX4CX2-4C)。CMX-2基序是推定的鋅指基序，其可以參與DNA結合或蛋白質-蛋白質相互作用。參見Nakano等，Plant Physiol. ,140 =411-432 (2006) 在一些實施方案中，多肽可以包含CMX-I基序的變體。此類變體與CMX-I基序1處、2處或3處氨基酸取代不同。SEQ ID NO :5 列出了本文中鑒定為 Ceres Clone Id No. 123905 (SEQ ID NO 5)的擬南芥(Arabidopsis thaliana)克隆的氨基酸序列，其預測為編碼含有AP2結構域、CMX-I 基序和CMX-2基序的多肽。植物不育序列可以編碼包含AP2結構域的多肽，所述AP2結構域與SEQ ID NO :5的殘基134至185具有70%或更大(例如75%、80%、85%、90%、95%、 97%,98^^99%或100% )序列同一性。在一些實施方案中，植物不育序列編碼包含AP2 結構域的多肽，所述 AP2 結構域與 SEQ ID NO :6、8、10、11、13、15、17、19、21、22、24、25、26、 27、28、四和31中所列的一種或多種多肽的AP2結構域具有70%或更大(例如75%、80%、 85%、90%、95%、97%、98%、99%或100% )序列同一性。例如，植物不育序列可以編碼與 SEQ ID NO 6 的殘基 95 至 146、SEQ ID NO 8 的殘基 116 至 167、SEQ ID NO :10 的殘基 125 至 176、SEQ ID NO 11 的殘基 130 至 181、SEQ ID NO 13 的殘基 137 至 188、SEQ IDNO 15的殘基 143 至 194、SEQ ID NO :17 的殘基 127 至 178、SEQ ID NO :19 的殘基 131 至 182、SEQ ID NO :21 的殘基 1；35 至 186、SEQ ID NO 22 的殘基 120 至 171、SEQ ID NO 24 的殘基 1 至 179、SEQ ID NO 25 的殘基 133 至 184、SEQ ID NO 26 的殘基 1；35 至 186、SEQ ID NO 27 的殘基 121 至 172、SEQ ID NO 28 的殘基 153 至 204、SEQ ID NO 29 的殘基 118 至 169 或 SEQ IDNO :31的殘基130至181具有70%或更大序列同一性的多肽。SEQ ID N0:8、ll、13、 15、17、19、21、22、24、25和26中所列的多肽還含有如序列表中所列的CMX-I基序和CMX-2 基序。SEQ ID NO :6、10、27、28、四和31中所列的多肽還含有CMX-I基序的變體，而且含有如序列表中所列的CMX-2基序?！鞍俜直刃蛄型恍浴敝溉魏谓o定參照序列(例如SEQ ID NO 5)或其部分諸如 AP2結構域與候選植物不育序列之間的序列同一性程度。候選序列通常具有參照序列長度的 80%至 200%，例如參照序列長度的 82、85、87、89、90、93、95、97、99、100、105、110、115、 120、130、140、150、160、170、180、190或200%的長度。任何候選核酸或多肽相對于參照核酸或多肽的百分比同一性可以如下測定。使用計算機程序ClustalW(第1.83版，缺省參數) 比對參照序列(例如核酸序列或氨基酸序列)與一種或多種候選序列，所述計算機程序 ClustalW允許核酸或多肽序列在其全長范圍內實施比對(全局比對)。Cherma等，Nucleic Acids Res. ，31(13) :3497-500(2003) ClustalW計算參照與一種或多種候選序列間的最佳匹配，并比對它們，使得可以測定同一性、相似性和差異。一個或多個殘基的缺口可以插入參照序列、候選序列或兩者中，以使序列比對最大化。為了快速成對比對核酸序列，使用下列缺省參數字大小 2 ；窗口大小4 ；評分方法百分比；頂對角線的數目4 ；及缺口罰分5.為了核酸序列的多重比對，使用下列參數缺口開放罰分10.0 ；缺口延伸罰分5.0 ；及加權轉變(weight transition)是。為了快速成對比對蛋白質序列，使用下列參數字大小1 ；窗口大小 5 ；評分方法百分比；頂對角線的數目5 ；缺口罰分3。為了蛋白質序列的多重比對，使用下列參數權矩陣=Blosum ；缺口開放罰分10. 0 ；缺口延伸罰分0. 05 ；親水性缺口 開啟；親水性殘基KlyJro、kr、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg和Lys ；殘基特定缺口罰分開啟。 ClustalW輸出是反映序列間關系的序列比對。ClustalW可以在例如貝勒醫學院(Baylor College of Medicine)搜索發射器站點 Gearch Launcher site)于環球網(World Wide Web) (searchlauncher. bcm. tmc. edu/multi-align/multi-align. html)及在歐生物信；窗、 學研究所(European Bioinformatics Institute)站點于環球網(ebi.ac.uk/clustalw) 運行。為了測定候選核酸或氨基酸序列與參照序列的百分比同一性，使用ClustalW來比對序列，用比對中相同匹配的數目除以參照序列的長度，并將結果乘以100。注意到，百分比同一性數值可以四舍五入至最接近的十分之一。例如，78. 11,78. 12,78. 13和78. 14向下四舍五入至 78. 1，而 78. 15,78. 16,78. 17,78. 18 和 78. 19 向上四舍五入至 78.2。在一些實施方案中，本文中所描述的方法中可以使用參照植物不育多肽的含有 AP2結構域、CMX-I基序和CMX-2基序的一種或多種功能同系物。功能同系物是與參照多肽具有序列相似性，而且實施參照多肽的一項或多項生物化學或生理學功能的多肽。功能同系物和參照多肽可以是天然存在的多肽，并且序列相似性可以是由于趨同或趨異進化事件。因此，功能同系物有時在文獻中稱為同系物或直向同系物(ortholog)或側向同系物 (paralog)。天然存在的功能同系物的變體(諸如由野生型編碼序列的突變體編碼的多肽)自身可以是功能同系物。功能同系物也可以經由植物不育多肽的編碼序列的定點誘變，或者通過組合來自不同天然存在植物不育多肽的編碼序列的結構域(“結構域交換”)來創建。術語“功能同系物”有時適用于編碼功能同源性多肽的核酸?？梢酝ㄟ^分析核苷酸和多肽序列比對來鑒定功能同系物。例如，對核苷酸或多肽序列的數據庫實施詢問可以鑒定植物不育多肽的同系物。序列分析可以包括使用植物不育多肽氨基酸序列作為參照序列對非冗余數據庫的BLAST分析、Reciprocal BLAST分析或 PSI-BLAST分析。在一些情況中，從核苷酸序列推斷氨基酸序列。數據庫中那些具有大于 40%序列同一性的多肽是用于進一步評估作為植物不育多肽的適合性的候選物。氨基酸序列相似性允許保守氨基酸取代，諸如用一個疏水性殘基取代另一個或者用一個極性殘基取代另一個。若需要，可以實施此類候選物的手工檢查以使要進一步評估的候選物的數目縮小。手工檢查可以通過選擇那些表現為具有植物不育多肽中存在的結構域(例如保守功能結構域)的候選物來進行。可以通過定位植物不育多肽的一級氨基酸序列內作為重復序列、形成一些二級結構(例如螺旋和β片層)、建立帶正電荷或負電荷的結構域或者代表蛋白質基序或結構域的區域來鑒定保守區。參見例如Pfam萬維網站，其在環球網上于Sanger, ac. uk/Software/ Pfam/和pfam. jane 1 ia. org/上描述了多種蛋白質基序和結構域的共有序列。Pfam數據庫上包括的信息描述記載于 Sonnhammer 等，Nucl. Acids Res. ,26 =320-322(1998)； Sonnhammer 等，Proteins, 28 :405-420(1997) ； R Bateman 等，Nucl. Acids Res. ,27 260-262(1999)中。也可以通過比對來自緊密相關物種的相同或相關多肽的序列來確定保守區。優選地，緊密相關物種來自同一科。在一些實施方案中，來自兩種不同物種的序列比對是足夠的。通常，展現出至少約40%氨基酸序列同一性的多肽可用于鑒定保守區。相關多肽的保守區展現出至少45%氨基酸序列同一性(例如至少50%、至少60%、至少70%、至少 80%或至少90%氨基酸序列同一性)。在一些實施方案中，保守區展現出至少92^^94%, 96 %、98 %或99 %氨基酸序列同一性。圖1和序列表中提供了 SEQ ID NO :5中所列的多肽的功能同系物的氨基酸序列的例子。此類功能同系物包括例如GI ID No. 47852612 (SEQ ID NO :6)、Ceres Clone ID No. 1494990 (SEQ ID NO :8)、Ceres Clone ID No. 634402 (SEQ ID NO :10)、GI ID No. 125603736 (SEQ ID NO :11)、Ceres Annot ID No. 6318302 (SEQ ID NO :13)、Ceres Annot ID No. 6014857 (SEQ ID NO :15)、Ceres Clone ID No. 1824070 (SEQ ID NO :17)、 Ceres Clone ID No. 1805402(SEQ ID NO :19)、Ceres Annot ID No. 6041905(SEQ ID NO: 21)、GI ID No. 115479555 (SEQ ID NO :22)、Ceres Annot ID No. 6325681 (SEQ ID NO: 24)、GI ID No. 154093739 ((SEQ ID NO :25)、GI ID No. 156950515 (SEQ ID NO :26)、 GI ID No. 129560507 (SEQ ID NO :27)、GI ID No. 129560505 (SEQ ID NO :28)、GI ID No. 157341002 (SEQ ID NO :29)和 Ceres Annot ID No. 1460991 (SEQ ID NO :31)。在一些情況中，SEQ ID NO :5的功能同系物具有如下的氨基酸序列，其與SEQ ID NO :5中所列的氨基酸序列具有至少30%序列同一性，例如35%,37%,40%,45%,50%,52%,56%,59%, 61%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或 99%序列同一性。在一些實施方案中，植物不育多肽可以編碼具有DUF640結構域的多肽。參見例
17如，2009年10月19日提交的美國專利申請No. 61/252,827的SEQ ID NO :925、926、928、 930、932、934、936、938、940、942、944、946、948、950、952、954、955、957、958、959、960、961、 962、963、964、965、966和967中所列的多肽。例如，有用的植物不育多肽可以具有美國專利申請No. 61/252，827的SEQ ID NO :925中所列的氨基酸序列。植物不育多肽中保守區的鑒定促進植物不育多肽變體的生成。植物不育多肽的變體在一級氨基酸序列內通常具有10個或更少的保守氨基酸取代，例如7個或更少的保守氨基酸取代、5個或更少的保守氨基酸取代或1-5個保守取代。有用的變體多肽可以基于圖1 中所列的比對和/或序列表中所鑒定的同系物來構建。此類多肽包含保守區，其從氨基端末端至羧基端末端以圖中所描繪的次序安排。此類多肽在以虛線標記的位置中還可以包含 0、1或超過1個氨基酸。在以虛線標記的位置處不存在氨基酸時，此類多肽的長度是所有保守區中氨基酸殘基的總數。在以虛線標記的位置處存在氨基酸時，此類多肽具有的長度是所有保守區和所有虛線中的氨基酸殘基的總數。在一些實施方案中，有用的植物不育多肽包括擬合基于圖1中所列多肽的隱蔽馬爾科夫模型的多肽。隱蔽馬爾科夫模型(HMM)是一組功能同系物的共有序列的統計模型。參見 Durbin 等，Biological Sequence Analysis Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids， Cambridge University Press， Cambridge， UK(1998)。 使用一組功能同系物的序列作為輸入，通過具有缺省程序參數的程序HMMER 2. 3. 2來產生 HMM。通過 ProbCons (Do 等，Genome Res.，15(2) :330-40(2005))第 1. 11 版來產生多重序列比對，其使用如下一套缺省參數進行-c，一一致性REPS為2 ；-ir，一迭代細分 (iterative-refinement) REPS 為 100 ；-pre,—予頁訓練(pre-training) REPS 為 0。ProbCons 是一種由斯坦福大學提供的公用域軟件程序(public domain software program)。用于建造HMM的缺省參數(hmmbuild)如下MAP結構構建所使用的缺省“結構優先(architecture prior) ” (archpri)是0. 85，而用于測定有效序列數目的缺省截留閾值 (idlevel)是0. 62。HMMER 2. 3. 2于2003年10月3日以GNU通用公共許可發布，而且在環球網上可獲自多禾中來源諸如 hmmer. janeIia. org ；hmmer. wustl. edu ；禾口 fr. com/hmmer232/0 Hmmbuild以文本文件輸出模型?？梢允褂靡唤M功能同系物的HMM來測定如下的概率，即候選植物不育多肽序列對所述特定的HMM的擬合比對使用一組在結構或功能上無關的序列產生的空值HMM的擬合更好。候選多肽序列對HMM的擬合比對空值HMM的擬合的更高概率以HMM比特得分指明，所述HMM比特得分是在候選序列擬合使用HMMER hmmsearch程序得到的HMM譜(profile)時產生的。在運行hmmsearch時使用下列缺省參數缺省E值截留(E)是10.0，缺省比特得分截留(T)是負無窮大，數據庫中的序列缺省數目(Z)是數據庫中序列的實數，按域分級命中表(per-domain ranked hit list)的缺省E值截留(domE)是無窮大，而按域分級命中表的缺省比特得分截留(domT)是負無窮大。高HMM比特得分指明候選序列實施用于產生 HMM的多肽的一項或多項生物化學或生理學功能的概率較大。高HMM比特得分是至少20， 并且常常更高。特定序列的HMM比特得分的略微變化可由于各種因素而發生，諸如序列為了通過多重序列比對算法(諸如ftObCons程序)進行比對而進行處理的次序。不過，此類 HMM比特得分變化是次要的。本文中所討論的多肽以大于175(例如大于200、300、400或500)的HMM比特得分擬合指明的HMM。在一些實施方案中，多肽的HMM比特得分是本申請序列表中所提供的功能同系物的HMM比特得分的約50%、60%、70%、80%、90%或95%。在一些實施方案中，本文中所討論的多肽以大于175的HMM比特得分擬合指明的HMM，而且具有AP2結構域、CMX-I 基序和CMX-2基序。在一些實施方案中，多肽以大于175的HMM比特得分擬合指明的HMM， 而且與 SEQ ID NO :5、6、8、10、11、13、15、17、19、21、22、24、25、26、27、28、29 或 31 的 AP2 結構域具有70%或更大的序列同一性(例如75%、80%、85%、90%、95%或100%序列同一性)。序列表中顯示了多肽的例子，所述多肽在擬合自圖1中所列的氨基酸序列產生的 HMM時具有大于175的HMM比特得分。此類多肽包括例如SEQ ID NO :5、6、8、10、11、13、15、 17、19、21、22、24、25、26、27、28、29 和 31 中所列的多肽。序列表中列出了編碼植物不育多肽的核酸。此類核酸的例子包括SEQ ID NO :4、7、 9、12、14、16、18、20、23 和 30。核酸也可以是 SEQ ID NO :4、7、9、12、14、16、18、20、23 和 30 中所列的全長核酸的長度的至少40% (例如至少45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或 99% )的片段。編碼不育多肽的核酸可以包含SEQ ID NO :4、7、9、12、14、16、18、20、23和 30中所列的核苷酸序列?；蛘?，植物不育核酸可以是具有SEQ ID N0:4、7、9、12、14、16、18、 20,23和30中所列的核苷酸序列的核酸變體。例如，植物不育核酸可以具有如下的核苷酸序列，其與SEQ ID NO :4、7、9、12、14、16、18、20、23和30中所列的核苷酸序列具有至少80% 序列同一性，例如81%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性。另外，可以使用多種基于核酸的方法來抑制表達并賦予不育，所述基于核酸的方法包括反義RNA、核酶定向性RNA裂解、轉錄后基因沉默(PTGS)，例如RNA干擾(RNAi)和轉錄基因沉默(TGS)。因此，在一些實施方案中，將植物不育序列轉錄成抑制多肽表達的轉錄產物，并且由此賦予不育。通常，抑制表達并賦予不育的植物不育序列是至少10個核苷酸， 例如至少 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、30、35、40、50、80、100、 200,500個核苷酸或更多核苷酸。植物不育序列可以是種子發育中所牽涉的多肽的激動劑。此類激動劑可以是多肽 (例如顯性失功能突變體)，而且還可以是核酸(例如反義核酸、核酶或干擾RNA)。破壞種子發育中所牽涉的多肽的功能可以導致不能生成花結構和/或生成雄配子或雌配子。植物不育序列的其它例子包括包含SEQ ID NO :1、2、3和32中所列的核苷酸序列的核酸。SEQ ID NO :1-2分別是AP2結構域轉錄因子和泛素連接酶家族的柳枝稷同系物的核苷酸序列。SEQ ID NO :3和32是含有來自MADS框結構域轉錄因子的三種柳枝稷同系物的片段的嵌合體?？梢允褂弥参锊挥蛄衼硪种票磉_并在柳枝稷中賦予不育，所述植物不育序列包含SEQ ID NO :1、2、3或32中所列的整個核苷酸序列或部分核苷酸序列，而且被轉錄成轉錄產物。參見實施例3。應當領會，可以使用MADS框結構域轉錄因子(例如克隆 S4、S5和S6)的其它部分來抑制表達并在柳枝稷中賦予不育。應當注意到，認為編碼芽孢桿菌RNA酶(barnase)多肽、果膠酸裂合酶、白喉毒素A 鏈、玉米T-urfl3多肽、Mu噬菌體Gin重組酶、β 1，3葡聚糖酶、吲哚乙酸-賴氨酸合成酶、 芽胞桿菌CytA毒素、腺嘌呤轉磷酸核糖基酶、水楊酸羥化酶、DNA酶、RNA酶或一般化的蛋白酶的核酸不是植物不育序列。在一些實施方案中，轉基因柳枝稷植物含有兩種不同植物不育序列。在一些實施方案中，單一轉錄因子激活這兩種植物不育序列，其中每種與同一上游激活序列可操作連接?；蛘?，可以表達兩種不同轉錄因子，使得每種轉錄因子激活植物不育序列之一，而且每種不育序列具有不同表達模式，例如第一轉錄因子可以與組成型啟動子可操作連接，而第二轉錄因子可以與營養性啟動子(vegetative promoter)可操作連接。在其它實施方案中， 這兩種轉錄因子與不同營養性啟動子可操作連接。轉錄因子。本t中所描沭的F1轉基因柳枝稷植物含有編碼轉錄因子的外源核酸， 所述轉錄因子激活此類植物中存在的植物不育序列的轉錄。轉錄因子通常具有離散的DNA 結合結構域和轉錄激活結構域。轉錄因子的DNA結合結構域和轉錄激活結構域可以是合成的或者可以源自不同來源(即為嵌合轉錄因子)。已知來自不同天然存在的轉錄因子的結構域可以在單一多肽中組合，而且此類嵌合轉錄因子在植物中的表達可以激活轉錄。在一些實施方案中，嵌合轉錄因子具有源自酵母基因的DNA結合結構域和源自單純皰疹病毒VP16基因的轉錄激活結構域。在其它實施方案中，嵌合轉錄因子具有源自酵母HAPl基因的DNA結合結構域和源自VP16的轉錄激活結構域。參見例如WO 97/31064。表1中顯示了來自多種轉錄因子的DNA結合結構域及其各自的上游激活序列的列表。這些結構域適合于在柳枝稷的嵌合轉錄因子中使用。此列表中的DNA結合結構域已經在轉基因植物中作為嵌合轉錄因子的組分表達。預期來自釀酒酵母(S.cerevisiae)LEU3 轉錄因子的DNA結合結構域及其相關UAS(CCG-M-CGG)和來自釀酒酵母PDR3轉錄因子的 DNA結合結構域及其相關UAS (CCGCGG)也會是合適的。參見Hellauer等Mol. Cell Biol. (1996)。表1 結合結構域
權利要求
1.一種用于生成柳枝稷種子的方法，所述方法包括a)雜交在傳粉方面接近多個第二柳枝稷植物處種植的多個第一柳枝稷植物，所述第一植物包含第一外源核酸，所述第一核酸包含與植物不育序列可操作連接的轉錄因子激活序列，其中所述第一柳枝稷植物對于所述第一外源核酸是純合的，所述第二植物包含第二外源核酸，其包含與結合所述激活序列的轉錄因子的編碼序列可操作連接的調節區，其中所述第二柳枝稷植物對于所述第二外源核酸是純合的，其中所述多個第一柳枝稷植物和/或所述多個第二柳枝稷植物是克隆繁殖性植物；以及b)收集在所述第一柳枝稷植物和/或所述第二柳枝稷植物上形成的F1種子，其中自所述F1種子種植的F1柳枝稷植物表達所述植物不育序列，而且是不育的。
2.權利要求1的方法，其中所述第一柳枝稷植物是克隆繁殖性植物，而所述第二柳枝稷植物是遺傳異質性植物群體。
3.權利要求1的方法，其中所述第一柳枝稷植物是克隆繁殖性植物，并且所述第二柳枝稷植物是克隆繁殖性植物。
4.權利要求1的方法，其中所述第一柳枝稷植物是異質性植物群體，而所述第二柳枝稷植物是克隆繁殖性植物。
5.權利要求2或3的方法，其中所述第一克隆繁殖性柳枝稷植物是四倍體植物，而且展現出小于0. 3%的平均自交親和性百分比。
6.權利要求2或3的方法，其中所述第一克隆繁殖性柳枝稷植物是八倍體植物，而且展現出小于1.3%的平均自交親和性百分比。
7.權利要求3或4的方法，其中所述第二克隆繁殖性柳枝稷植物是四倍體植物，而且展現出小于0. 3%的平均自交親和性百分比。
8.權利要求3或4的方法，其中所述第二克隆繁殖性柳枝稷植物是八倍體植物，而且展現出小于1.3%的自交親和性百分比。
9.權利要求1的方法，其中所述種子收集自所述第一柳枝稷植物和所述第二柳枝稷植物兩者。
10.權利要求1的方法，其中所述F1植物生成平均每株植物小于0.5個能育種子。
11.權利要求10的方法，其中所述F1植物不能生成雄配子和雌配子。
12.權利要求10的方法，其中所述F1植物不能生成雄配子。
13.權利要求10的方法，其中所述F1植物不能生成雌配子。
14.權利要求1的方法，其中所述第一柳枝稷植物和所述第二柳枝稷植物間的平均雜交性百分比是約69%至約95%。
15.權利要求14的方法，其中所述第一柳枝稷植物和所述第二柳枝稷植物是四倍體， 是低地生態型的，而且具有約80%至約95%的平均雜交性百分比。
16.權利要求15的方法，其中所述第一柳枝稷植物和所述第二柳枝稷植物具有約86% 至約91%的平均雜交性百分比。
17.權利要求2、3或4的方法，其中所述第一柳枝稷植物展現出緊密的花序，而所述第二柳枝稷植物展現出散開的花序。
18.權利要求2、3或4的方法，其中所述第一柳枝稷植物展現出一致的開花時間，而所述第二柳枝稷植物展現出不一致的開花時間。
19.權利要求2、3或4的方法，其中所述第二柳枝稷植物展現出緊密的花序，而所述第一柳枝稷植物展現出散開的花序。
20.權利要求2、3或4的方法，其中所述第二柳枝稷植物展現出一致的開花時間，而所述第一柳枝稷植物展現出不一致的開花時間。
21.權利要求1-4中任一項的方法，其中相對于收集自所述第二柳枝稷植物的種子，收集自所述第一柳枝稷植物的種子具有統計上顯著升高的平均種子重量。
22.權利要求1-4中任一項的方法，其中相對于自所述第一柳枝稷植物收集的種子，自所述第二柳枝稷植物收集的種子具有統計上顯著升高的平均種子重量。
23.權利要求1的方法，其中所述種植步驟包括以所述第一柳枝稷植物第二柳枝稷植物大于41的比率種植所述柳枝稷植物。
24.權利要求1的方法，其中所述種植步驟包括以所述第二柳枝稷植物第一柳枝稷植物大于41的比率種植所述柳枝稷植物。
25.權利要求1的方法，其中所述第一柳枝稷植物和第二柳枝稷植物是四倍體植物。
26.權利要求1的方法，其中所述第一柳枝稷植物和所述第二柳枝稷植物是低地型柳枝稷植物。
27.權利要求1的方法，其中所述第一柳枝稷植物進一步含有包含與第二植物不育序列可操作連接的所述第一轉錄因子激活序列的外源核酸，而所述第一柳枝稷植物對于包含所述第二植物不育序列的所述外源核酸展現出純合性。
28.權利要求1的方法，其中所述第一柳枝稷植物進一步含有包含與第二植物不育序列可操作連接的第二轉錄因子激活序列的外源核酸，而所述第一柳枝稷植物對于包含所述第二植物不育序列的所述外源核酸展現出純合性；且其中所述第二柳枝稷植物進一步包含與結合所述第二激活序列的第二轉錄因子的編碼序列可操作連接的調節區的外源核酸，而且對于包含所述第二轉錄因子的所述編碼序列的所述外源核酸展現出純合性。
29.權利要求1的方法，其中所述第一柳枝稷植物和/或所述第二柳枝稷植物進一步包含轉基因。
30.權利要求四的方法，其中所述第一柳枝稷植物和/或所述第二柳枝稷植物對于所述轉基因展現出純合性。
31.權利要求1的方法，其中所述植物不育序列編碼多肽。
32.權利要求31的方法，其中所述多肽的氨基酸序列的HMM比特得分大于約175，所述 HMM基于圖1中所描繪的氨基酸序列，且其中與不包含所述核酸的對照植物相比，所述植物具有降低的能育性。
33.權利要求31的方法，其中所述多肽包含與SEQID NO 5的殘基134至185具有至少80%序列同一性的AP2結構域、CMX-I基序和CMX-2基序。
34.權利要求33的方法，其中所述多肽包含與SEQID NO 5的殘基134至185具有至少90%序列同一性的AP2結構域、CMX-I基序和CMX-2基序。
35.權利要求33的方法，其中所述多肽包含與SEQID NO 5的殘基134至185具有至少95%序列同一性的AP2結構域、CMX-I基序和CMX-2基序。
36.權利要求33的方法，其中所述多肽包含與選自下組的序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO :5、6、8、10、11、13、15、17、19、21、22、24、25、26、27、28、29 和 31 中所列的序列。
37.權利要求1的方法，其中所述植物不育序列包含SEQID NO :1、2、3和32中所列的核苷酸序列之任一種的至少50個連續的核苷酸，而且被轉錄成轉錄產物。
38.權利要求31的方法，其中所述多肽包含DUF640結構域。
39.權利要求1的方法，其中所述轉錄因子是嵌合轉錄因子，其包含選自下組的結合結構域LexA、乳糖操縱子、ArgR和合成的Si指蛋白。
40.權利要求1的方法，其中所述轉錄因子是嵌合轉錄因子，其包含選自下組的激活結構域C1、ATMYB2、HAFL-1、ANT、ALM2、AvrXa 10、VP1、DOF 和 RISBZ1。
41.權利要求1的方法，其中所述調節區是廣泛表達型啟動子。
42.權利要求41的方法，其中所述啟動子是玉米泛素啟動子。
43.權利要求1的方法，其中所述調節區是光合組織啟動子。
44.權利要求1的方法，其中相對于缺乏所述第一外源核酸和所述第二外源核酸的對照柳枝稷植物，自所述F1種子種植的所述植物在至少一個生長季節中具有統計上顯著升高的生物質。
45.通過權利要求1-44中任一項中所列的方法生成的F1柳枝稷種子。
46.多個F1雜種轉基因柳枝稷種子，所述種子通過下列方法生成，包括a)在傳粉方面接近多個第二柳枝稷植物處種植多個第一柳枝稷植物，所述第一植物包含第一外源核酸，所述第一核酸包含與植物不育序列可操作連接的轉錄因子激活序列，所述第二植物包含第二外源核酸，其包含與結合所述激活序列的轉錄因子的編碼序列可操作連接的調節區，其中所述多個第一柳枝稷植物和/或所述多個第二柳枝稷植物是克隆繁殖性植物；b)雜交所述第一柳枝稷植物與所述第二柳枝稷植物；以及c)收集在所述第一柳枝稷植物和/或所述第二柳枝稷植物上形成的Fl種子，其中自所述Fl種子種植的Fl柳枝稷植物表達所述植物不育序列，而且是不育的。
47.權利要求46的柳枝稷種子，其中所述第一柳枝稷植物和所述第二柳枝稷植物具有大于約65%的雜交性百分比。
48.一種用于生成柳枝稷種子的方法，所述方法包括a)雜交在傳粉方面接近多個第二柳枝稷植物處種植的多個第一柳枝稷植物，所述第一植物包含第一外源核酸，所述第一核酸包含與植物不育序列可操作連接的轉錄因子激活序列，所述植物不育序列包含SEQ ID N0:l、2、3或32中所列的核苷酸序列之任一種的至少50個連續的核苷酸，其中所述第一柳枝稷植物對于所述第一外源核酸是純合的，所述第二植物包含第二外源核酸，其包含與結合所述激活序列的轉錄因子的編碼序列可操作連接的調節區，其中所述第二柳枝稷植物對于所述第二外源核酸是純合的；以及b)收集在所述第一柳枝稷植物和/或所述第二柳枝稷植物上形成的Fl種子，其中自所述Fl種子種植的Fl柳枝稷植物表達所述植物不育序列，而且是不育的。
49.一種種植柳枝稷的方法，所述方法包括a)將Fl雜種柳枝稷植物種植至少一個生長季節，所述植物包含i)第一外源核酸，所述第一核酸包含與植物不育序列可操作連接的轉錄因子激活序列，和 )第二外源核酸，其包含與結合所述激活序列的轉錄因子的編碼序列可操作連接的調節區，其中所述柳枝稷植物對于所述第一外源核酸和所述第二外源核酸是半合子的；以及b)在第二生長季節或隨后的生長季節中自所述柳枝稷植物收獲生物質。
50.權利要求49的方法，其中所述植物不育序列包含SEQID NO :1、2、3或32中所列的核苷酸序列之一的至少50個連續的核苷酸。
51.權利要求49的方法，其中所述植物不育序列編碼多肽。
52.權利要求51的方法，其中所述多肽的氨基酸序列的HMM比特得分大于約175，所述 HMM基于圖1中所描繪的氨基酸序列，且其中與不包含所述核酸的對照植物相比，所述植物具有降低的能育性。
53.權利要求51的方法，其中所述多肽包含與SEQID NO 5的殘基134至185具有至少80%序列同一性的AP2結構域、CMX-I基序和CMX-2基序。
54.權利要求53的方法，其中所述多肽包含與SEQID NO 5的殘基134至185具有至少90%序列同一性的AP2結構域、CMX-I基序和CMX-2基序。
55.權利要求53的方法，其中所述多肽包含與SEQID NO 5的殘基134至185具有至少95%序列同一性的AP2結構域、CMX-I基序和CMX-2基序。
56.權利要求51的方法，其中所述多肽包含與選自下組的序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO :5、6、8、10、11、13、15、17、19、21、22、24、25、26、27、28、29 和 31 中所列的序列。
全文摘要
本發明涉及可用于控制能源作物植物的不必要的擴散的材料和方法。該方法涉及含有引起種子不育的轉基因的F1雜種轉基因柳枝稷植物。該方法還涉及一種或多種激活轉基因表達的轉錄因子。此類F1雜種植物不能形成能育種子。
文檔編號C12N15/29GK102224243SQ200980147101
公開日2011年10月19日 申請日期2009年11月24日 優先權日2008年11月25日
發明者彼得.N.瑪西亞, 戴維.V.唐, 邁克爾.F.波特雷科 申請人:希爾雷斯股份有限公司