專利名稱：：解纖維熱酸菌木聚糖酶的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及木聚糖酶及其表達和使用方法。具體地，本發(fā)明涉及嗜熱木聚糖酶(Xyl-I)及來自解纖維熱酸菌(Acidothermuscellulolyticus)中的同系物，以及這些酶在水解木質纖維素中的用途。
背景技術：
：木質纖維素是一種由纖維素，半纖維素和木質素組成的植物生物量。木質纖維素作為可發(fā)酵生物量的豐富廉價原料存在。然而，木質纖維素在利用上的一個障礙是其內部纖維素和半纖維素與木質素的緊密交聯(lián)。分解木質纖維素(比如從木質素中分離纖維素和半纖維素)需要大量能量，因此常常是無效率的。對木質纖維素生物量的有效利用將會增強生物轉化過程的經(jīng)濟競爭力，使之可與石油化工過程相抗衡。已經(jīng)證明木聚糖酶可用于有效分解木質纖維素。木聚糖酶在生物技術和工業(yè)應用的眾多領域都有重要作用，其包括在紙漿和造紙工業(yè)中預漂牛皮紙漿，紡織工業(yè)中復原纖維素纖維，增強動物飼料和青貯飼料的消化性，凈化果汁和啤酒，分離谷物麩質和淀粉，烘焙工業(yè)中的各種應用，以及用于藥理應用和食品添加劑的低聚木糖產物(1、2、9、14和21)。此外，近期對從木質纖維素植物生物量中生產生物燃料的研究，使木聚糖酶成為新的關注焦點(5)。Collins等人(4)近來對來自六種不同家族的木聚糖酶的物理化學性和功能性特征，作用機制和工業(yè)應用進行了重新考察。木聚糖酶產物普遍從里氏木霉CTrichodermareesei)和哈茨木霉(Trichodermaharzianum)菌株E58中獲得，這兩種菌株都來自加拿大福林泰克公司的菌種保藏。盡管兩種真菌都是胞外木聚糖酶的豐富的產物，但是真菌生長和酶的產生只能在嗜溫溫度下(比如觀°0進行。因此，真菌生長中發(fā)酵需要大量冷卻水，并且其易于受到細菌污染。在產生木聚糖酶時也會有熱不穩(wěn)定情況，在50°C下培養(yǎng)半小時，酶活性將喪失90%以上。因此，使用這些酶對木質纖維素進行酶解必須在大概37至45°C的低溫度條件下進行。這樣做反過來又降低水解效率，使水解過程中無菌條件成為必要，并阻礙酶在無取代物情況下延長使用。但是，可以通過使用嗜熱木聚糖酶來獲得高效率水解。從近期研究可知，從真菌和細菌微生物中已經(jīng)鑒定出了幾種嗜熱木聚糖酶(圖1)。比如，專利號為5，935，836的美國專利公開了從柔曲馬杜拉放線菌中分離出的一種最適PH值為6.O至7.0，最適溫度范圍為70至80°C的嗜熱木聚糖酶。另外，專利號為5，395，765的美國專利公開了從紅嗜熱鹽菌屬(Iihodothermus)中分離的一種在pH值5至8下具有活性，在85°C至100°C溫度范圍內具有熱穩(wěn)定性的木聚糖酶。然而，有較高酸性pH值范圍的木聚糖酶是發(fā)酵過程中利用半纖維素生物量的理想選擇。在Mohagheghi等人的文章中描述(12)了嗜熱纖維素分解菌解纖維熱酸菌，并且在Siiang等人的文章中描述(19)了纖維素酶產物。但是，兩篇文獻都未描述在低pH和高溫條件下可發(fā)揮作用的純化的木聚糖酶。專利號為5，902，581的美國專利公開了一種來自解纖維熱酸菌的在pH值3.6至4.2的條件下具有活性，在70°C至80°C的溫度范圍內具有熱穩(wěn)定性的木聚糖酶。但是，這種解纖維熱酸菌在溫度高于80°C或pH值在4.5至6.O的條件下不具有最佳活性。
發(fā)明內容本發(fā)明在此公開一種重組內切-β-1，4-木聚糖酶，該木聚糖酶的氨基酸序列與SEQIDNO:1具有至少80%、至少85%、至少87%、至少89%、至少90%、至少91%或至少93%的序列同源性。更優(yōu)選的，該重組內切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列與SEQIDNO1具有至少95%、至少97%、或至少99%的序列同源性。在一特別優(yōu)選實施例中，該重組內切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列是SEQIDN0:1。在特定實施例中，上述任一種重組內切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列的一個區(qū)域都符合共有序列脯氨酸-Xaa1-脯氨酸-Xaa2-脯氨酸(SEQIDNO:40)。優(yōu)選的，Xaa1和)各自獨立地選自無氨基酸，任意一個氨基酸，任意兩個氨基酸或任意三個氨基酸。在優(yōu)選實施例中，上述任何一種重組內切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列的第一個谷氨酸對應于SEQIDNO1的谷氨酸-142的位置，第二個谷氨酸對應于SEQIDNO=I的谷氨酸-259的位置。優(yōu)選的，上述任一種重組內切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列區(qū)域位于第一個谷氨酸和第二個谷氨酸之間。在特定實施例中，第一個谷氨酸位于具有天冬氨酸-纈氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-谷氨酸的序列(SEQIDNO25)的氨基酸區(qū)域內，第二個谷氨酸位于具有蘇氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸序列(SEQIDNO26)的氨基酸區(qū)域內。在其他優(yōu)選實施例中，Xaa1是選自組氨酸、賴氨酸或精氨酸中的一種氨基酸，Xaa2是選自亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸，脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸中的一種氨基酸。在特別優(yōu)選實施例中，上述任一種重組內切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列區(qū)域是脯氨酸-組氨酸-脯氨酸-亮氨酸-脯氨酸(SEQIDNO27)。在另一些實施例中，上述任一種重組內切-β-1，4-木聚糖酶在pH值約為3至9下具有活性。在優(yōu)選實施例中，上述任一種重組內切-β-1，4-木聚糖酶具有最適pH值約4.5至6.0。在還一些實施例中，上述任何一種重組內切-β-1，4-木聚糖酶有40至48kD分子量。在另一些實施例中，上述任一種重組內切-β-1，4-木聚糖酶在至少80°C的溫度下具有活性。優(yōu)選的，上述任一種重組內切-β-1，4-木聚糖酶在至少80°C至120°C的溫度下具有活性。在特別優(yōu)選實施例中，上述任一種重組內切-β-1，4-木聚糖酶在約90°C的溫度下具有最佳活性。在其他實施例中，上述任一種重組內切-β-1，4-木聚糖酶在培養(yǎng)至少20分鐘、至少30分鐘、至少45分鐘、至少60分鐘、至少90分鐘、至少2小時、至少5小時、至少8小時、至少12小時、至少M小時、或至少48小時后，在90°C下保持至少50%的初始活性。在還一些實施例中，上述任一種重組的內切-β-1，4-木聚糖酶在木聚糖存在時，在90°C下具有約90分鐘的半衰期。在優(yōu)選實施例中，木聚糖為樺木木聚糖，山毛櫸木木聚糖或燕麥木聚糖。在特定實施例中，上述任一種重組的內切-β-1，4-木聚糖酶還包括具有SEQIDNO2的氨基酸序列的一個信號肽序列。在還一些實施例中，上述任一種重組內切-β-1，4-木聚糖酶具有選自木質纖維素生物量、含木聚糖材料或含木葡聚糖材料的底物。本發(fā)明還涉及一種包括編碼上述任一種重組內切-β-1，4-木聚糖酶的核酸分子的重組細胞。本發(fā)明進一步涉及一種表達核酸分子的重組細胞，所述核酸分子的核苷酸序列，與SEQIDNO:4或其互補序列的SEQIDNO:5具有至少80%、至少85%、至少87%、至少89%、至少90%、至少91%、或至少93%的序列同源性。優(yōu)選的，該核酸分子的核苷酸序列，與SEQIDNO4或其互補序列的SEQIDNO5具有至少95%、至少97%、或至少99%的序列同源性。在一個特別優(yōu)選實施例中，該核酸分子的核苷酸序列是SEQIDNO:4或其互補序列的SEQIDNO:5ο本發(fā)明還涉及一種通過使重組內切-β-1，4-木聚糖酶與木質纖維素發(fā)生反應來水解木質纖維素的方法。所述重組內切-β-1，4_木聚糖酶的氨基酸序列與SEQIDΝ0:1具有至少80%、至少85%、至少87%、至少89%、至少90%、至少91%、至少93%、至少95%、至少97%、或至少99%的序列同源性。優(yōu)選的，將木質纖維素與重組內切-β-1，4-木聚糖酶在至少80°C、至少85°C、至少90°C、至少95°C、或至少100°C的溫度下，pH值范圍約4.5至6.0的條件下發(fā)生反應。在一個特別優(yōu)選實施例中，重組內切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列是SEQIDNO:1ο本發(fā)明進一步涉及一種通過使重組內切-β-1，4-木聚糖酶與木質纖維素發(fā)生反應來水解木質纖維素的方法。優(yōu)選的，將木質纖維素與重組內切-β-1，4-木聚糖酶在至少80°〇、至少851、至少901、至少951、或至少100°C的溫度下，pH值范圍約4.5至6.O的條件下發(fā)生反應。在其他實施例中，上述任一種方法中的木質纖維素的來源選自白樺木、燕麥、柳枝稷、玉米秸稈、芒屬、能源甘蔗、高粱、桉樹、柳樹、甘蔗渣、雜交白楊、短期輪作木本作物、針葉軟木、作物殘留物、庭園廢物或其組合。在還一些實施例中，上述任一種方法中的重組內切-β-1，4-木聚糖酶還包括有SEQIDNO:2的氨基酸序列的一個信號肽序列。圖1是一個比較各種木聚糖酶的表格，所有木聚糖酶都在最適溫度100°C以下。MW=分子量；Topt=最佳溫度范圍；Hopt=最適Ph值范圍。圖2示出了解纖維熱酸菌xyl-Ι基因Acel_0372的示意圖。圖3是瓊脂糖凝膠成像，其示出了xyl-Ι基因Acel_0372的PCR擴增結果。泳道1是分子量標記；泳道2和3是以包含兩種不同濃度的解纖維熱酸菌的基因組DNA作為模板進行擴增得到的PCR產物。圖4是瓊脂糖凝膠成像，其示出了純化包含擴增的xyl-Ι基因Acel_0372的純化的質粒克隆的結果。最左側的泳道是分子量標記(以1Λ為單位)；泳道1和泳道3至8包含正確的pK19(2.5kb)的構建體，所述pK19構建體包含用McI和)(baI酶切后的1.4-kb的PCR產物。泳道2是不包含1.4-kb的PCR產物的pK19構建體。圖5(A)和5(B)示出了從解纖維熱酸菌中擴增的PCR產物的核苷酸編碼序列(SEQIDNO:4)，從解纖維熱酸菌中擴增的PCR產物的核苷酸互補序列(SEQIDNO5)，以及由解纖維熱酸菌中擴增的PCR產物編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:3)。6(A),6(B)和6(C)示出了在解纖維熱酸菌中的Xyl-I表達。(A)示出了xyl_l基因的RT-PCR分析。(B)示出了一個內部對照持家基因gyrB的RT-PCR分析。M分子量DNA梯，泳道1至4指數(shù)生長期樣品，泳道5至8平穩(wěn)增長期樣品，泳道9非RT陰性對照樣品以用來確定不存在基因組DNA污染。泳道1和泳道5燕麥木聚糖生長培養(yǎng)物樣品，泳道2和泳道6纖維二糖生長培養(yǎng)物，泳道3和泳道7纖維素生長培養(yǎng)物，泳道4和泳道8:葡萄糖生長培養(yǎng)物。(C)示出了通過串聯(lián)質譜分析法從解纖維熱酸菌上清液中分離出Xyl-I蛋白質(389aa)的肽覆蓋表征。陰影框表示N-端信號肽，黑框表示從光譜中鑒定出的五個不重疊肽的位置。這些肽的序列如下1:HGNPPYHPPADSLR(SEQIDNO6),2WQVVEPTQGTYDffSGGDR(SEQIDNO7),3:LVQFAQEHGQLVR(SEQIDNO8),4:HIVDEVTHFK(SEQIDNO9)和5:PAYTALQQTLALAAGAPHR(SEQIDNO:10)。圖7示出了介于Acel_0373與Acel_0372(Xyl-l)之間的開放讀碼框中的全部451-bp非編碼區(qū)。該序列包含xyl-Ι啟動區(qū)。推定的-10和-25序列用黑體示出，推定的aiine-Dalgarno序列核糖體結合位點(RBS)也用黑體示出。Xyl-I蛋白質編碼區(qū)在序列末端用黑體箭頭示出。三個反向重復序列(IR-1、IR_2和IR-3)用粗體字和黑框示出。IR-IGAAACTTTC(SEQIDNO11),IR-2:TTTCCGAAA(SEQIDNO:12)，IR3:TCCGAAAATTTCGGA(SEQIDNO13)。圖8(A)和8⑶示出了用FPLC在65°C下熱處理15分鐘后Xyl-I的純化。㈧示出了在FPLC期間，來自離子交換柱的蛋白質洗脫隨著KCl濃度被增加而進行。黑線是280nm的紫外線吸光率，細灰線表示傳導率，粗灰線表示KCl梯度。(B)示出了52°C下的活性數(shù)據(jù)圖表(在410nm處測定的活性)，使用pH值5.2來鑒定包含Xyl-I的餾分，然后將它們合并濃縮。圖9(A)和9(B)示出了大腸桿菌中Xyl-I的純化。(A)示出了考馬斯染色凝膠。(B)示出了凝膠試驗(在52°C，pH值5.2條件下進行)。最左側泳道是分子量標記(WkD為單位)。CCE是來自大腸桿菌克隆體的細胞粗提取物；ΔΗ是在熱處理后(65°C下處理15分鐘)來自大腸桿菌克隆體的細胞粗提取物；Main是來自離子交換柱的濃縮活性餾分；Side是濃縮側餾分。星號表示Xyl-1。圖10示出了通過羥基磷灰石色譜的Xyl-I的純化。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(10%凝膠)分析顯示分子量標記(泳道1)，來自DH5ci(pK19-xyl-l)的細胞粗提取物(泳道幻，來自DH5α(pK19-xyl-l)經(jīng)過熱處理(65°C下處理20分鐘后離心)的細胞粗提取物(泳道幻，來自羥基磷灰石柱的濃縮餾分(泳道4)。圖11示出了在不同pH值和溫度條件下部分純化的Xyl-I的相對活性。該活性相對于每一PH值下的最高活性。圖12示出了Xyl-I與其他木聚糖酶的多序列比對。使用ClustalX版本2.0將Xyl-I的A295氨基酸片段(殘基67-361)與11種其他同系物比對06)。星號(*)表示完全保守位點，冒號()和句號(。)分別表示高度和低度保守位點。A_ce序列上方的線表示包含三個脯氨酸的五種氨基酸的獨特Xyl-I區(qū)。蛋白質使用的縮寫和登錄號如下A_ce(解纖維熱酸菌IlBXyl-1,GI:117927581)(SEQIDNO28);C_ac(CatenulisporaacidiphilaDSM44928，GI:229247007)(SEQIDNO:29);C_sp(纖維微桿菌屬HY-12，GI:162414427)(SEQIDNO30);C_fi(糞月巴桿菌ATCC484，GI:73427793)(SEQIDNO:31);S_th(熱紫鏈霉菌，GI:38524461)(SEQIDNO:32);T_au(嗜熱子囊菌，GI:13432255)(SEQIDNO33);P_ch(白腐菌，GI:167599628)(SEQIDNO34);T_al(白色嗜高溫菌，GI:1621277)(SEQIDNO35);S_av(除蟲鏈霉菌，GI:29828638)(SEQIDNO:36);C_ad(Cryptococcusadeliensis,GI:2624008)(SEQIDNO:37);U_ba(未培養(yǎng)的細菌，GI:18476191)(SEQIDNO38)；T_ma(海棲熱袍菌，GI:71041762)(SEQIDNO:39)。圖13(A)和13(B)是瓊脂糖凝膠成像，其示出了大腸桿菌細胞粗提取物中的膠內木聚糖酶活性試驗。泳道ST是分子量標準(以kD為單位)；(A)中泳道1是來自載體對照菌株的細胞粗提取物；泳道2是來自Xyl-I克隆的細胞粗提取物；(B)中泳道3是來自載體對照菌株經(jīng)過熱處理(65°C下處理15分鐘)的細胞粗提取物；泳道4是來自Xyl-I克隆經(jīng)過熱處理的細胞粗提取物。在52°C，pH值5.2條件下進行試驗。圖14是聚丙烯酰胺凝膠成像，其示出了在凝膠試驗中來自大腸桿菌克隆體和熱酸菌屬(在纖維二糖上生長后)濃縮的培養(yǎng)物上清液中的木聚糖酶活性。泳道ST是分子量標準(以kD為單位)；泳道1是熱酸菌屬的培養(yǎng)物上清液；泳道2是Xyl-I克隆體的培養(yǎng)物上清液；泳道3是大腸桿菌載體對照的培養(yǎng)物上清液。在52°C，pH值5.2條件下進行試驗。圖15是聚丙烯酰胺凝膠成像，其示出了在pH值5.2下的凝膠試驗中，在0至100°C的溫度范圍下大腸桿菌細胞粗提取物的重組Xyl-I活性。圖16是聚丙烯酰胺凝膠成像，其示出了在凝膠試驗中，在PH值范圍3-10條件下大腸桿菌細胞粗提取物的重組Xyl-I活性。在52°C下進行試驗。圖17是聚丙烯酰胺凝膠成像，其示出了在大腸桿菌細胞粗提取物中的重組Xyl-I經(jīng)過熱處理(在80°C下處理20分鐘)活性。在52°C，pH值5.2條件下進行試驗。圖18示出了大腸桿菌細胞粗提取物經(jīng)過熱處理20分鐘后的重組Xyl-I活性。在520C，pH值5.2條件下進行試驗。圖19示出了在0至120°C的溫度范圍內，pH值5.2條件下，大腸桿菌細胞粗提取物的重組Xyl-I的比活性。圖20(A)和20⑶示出了純化的Xyl-I的溫度和pH值數(shù)據(jù)圖表。㈧是pH值范圍3至6;(B)是pH值范圍7至10。結果是以燕麥作為底物并且使用還原糖測定的至少三個獨立實驗數(shù)據(jù)的平均值。注意A和B的活性范圍不同。誤差線表示標準偏差。圖21(A)和21(B)示出了重組Xyl-I的熱穩(wěn)定性。(A)是用木聚糖底物獲得的克隆的Xyl-I的穩(wěn)定特征。將純化的Xyl-I用燕麥木聚糖(淺灰)、樺木木聚糖(灰)或磷酸鹽緩沖液(白)以120比例稀釋，在90°C下按圖表示的時間培養(yǎng)。通過還原糖試驗測定速率，與未加熱的Xyl-I(黑)相對應。結果是三個獨立實驗數(shù)據(jù)的平均值，誤差線表示標準偏差。(B)是Xyl-I在3.8%濃度的燕麥木聚糖存在時保留的活性。在90°C下Xyl-I的半衰期似乎大約為1.5小時。圖22(A)和22(B)示出了與燕麥木聚糖(A)和樺木木聚糖(B)發(fā)生反應的Xyl-I活性TLC時間進程結果。TLC如在材料和方法中所述被處理。泳道1和泳道8是標準化合物X1木糖，X3木三糖，X4木四糖。泳道2是未反應的木聚糖；泳道3至7是在純化的Xyl-I存在時培養(yǎng)增加的時間。泳道3，10分鐘；泳道4，20分鐘；泳道5，40分鐘；泳道6，60分鐘；泳道7，240分鐘。序列表簡要說明SEQIDNO:1示出了沒有N-端信號序列的Xyl-Ι的氨基酸序列。SEQIDNO:2示出了N-端Xyl-I信號序列的氨基酸序列。SEQIDNO:3示出了由從解纖維熱酸菌中擴增的PCR產物編碼的氨基酸序列。SEQIDNO4示出了從解纖維熱酸菌擴增的PCR產物的核苷酸編碼序列。SEQIDNO5示出了從解纖維熱酸菌擴增的PCR產物的核苷酸互補序列。SEQIDNO:6示出了用串聯(lián)質譜分析法從解纖維熱酸菌培養(yǎng)物上清液中鑒定出的五個不重疊Xyl-I肽中的第一個Xyl-I肽氨基酸序列。SEQIDNO:7示出了用串聯(lián)質譜分析法從解纖維熱酸菌培養(yǎng)物上清液中鑒定出的五個不重疊Xyl-I肽中的第二個Xyl-I肽氨基酸序列。SEQIDNO:8示出了用串聯(lián)質譜分析法從解纖維熱酸菌培養(yǎng)物上清液中鑒定出的五個不重疊Xyl-I肽中的第三個Xyl-I肽氨基酸序列。SEQIDNO:9示出了用串聯(lián)質譜分析法從解纖維熱酸菌培養(yǎng)物上清液中鑒定出的五個不重疊Xyl-I肽中的第四個Xyl-I肽氨基酸序列。SEQIDNO10示出了用串聯(lián)質譜分析法從解纖維熱酸菌培養(yǎng)物上清液中鑒定出的五個不重疊Xyl-I肽中的第五個Xyl-I肽氨基酸序列。SEQIDNO11示出了位于xyl_l啟動區(qū)內的三個反向重復序列中的第一個(IR-I)的核苷酸序列。SEQIDNO12示出了位于xyl_l啟動區(qū)內的三個反向重復序列中的第二個(IR-2)的核苷酸序列。SEQIDNO13示出了位于xyl_l啟動區(qū)內的三個反向重復序列中的第三個(IR-3)的核苷酸序列。SEQIDNO14示出了用于PCT擴增Acel_0372的正向引物的核苷畫I序列。SEQIDNO15示出了用于PCT擴增Acel_0372的反向引物的核苷畫I序列。SEQIDNO:16示出了特異于xyl-Ι基因的正向引物的核苷酸序列。SEQIDNO:17示出了特異于xyl-Ι基因的反向引物的核苷酸序列。SEQIDNO:18示出了正向gyrB基因特異引物的核苷酸序列。SEQIDNO:19示出了反向gyrB基因特異引物的核苷酸序列。SEQIDNO:20示出了推定的xyl-Ι核糖體結合位點(RBS)的核苷畫I序列。SEQIDNO21示出了在解纖維熱酸菌16S核糖體rRNA3’端處發(fā)現(xiàn)的保守序列的核苷酸序列(互補于RBS)。SEQIDNO22示出了重組Xyl-Ι的N-端序列的氨基酸序列。SEQIDNO:23示出了GHlO家族木聚糖酶的第一個谷氨酸活性位點區(qū)域的保守氨基酸序列。SEQIDNO24示出了GHlO家族木聚糖酶的第二個谷氨酸活性位點區(qū)域的保守氨基酸序列。SEQIDNO25示出了Xyl-Ι的第一個谷氨酸活性位點區(qū)域的氨基酸序列。SEQIDNO26示出了Xyl-I的第二個谷氨酸活性位點區(qū)域的氨基酸序列。SEQIDNO:27示出了包含接近Xyl-I的第一個谷氨酸活性位點的三個脯氨酸的區(qū)域的氨基酸序列。SEQIDNO示出了Xyl-1的295個氨基酸的片段(比如殘基67-361)的氨基酸序列。SEQIDNO:29示出了CatenulisporaacidiphilaDSM44928(GI:229247007)木聚糖酶的氨基酸序列。SEQIDNO:30示出了纖維微桿菌屬HY-12(GI162414427)木聚糖酶的氨基酸序列。SEQIDNO:31示出了糞肥桿菌ATCC484(GI:73427793)木聚糖酶的氨基酸序列。SEQIDNO32示出了熱紫鏈霉菌(GI=38524461)木聚糖酶的氨基酸序列。SEQIDNO33示出了嗜熱子囊菌(GI=13432255)木聚糖酶的氨基酸序列。SEQIDNO34示出了白腐菌(GI:167599628)木聚糖酶的氨基酸序列。SEQIDNO35示出了白色嗜高溫菌(GI=1621277)木聚糖酶的氨基酸序列。SEQIDNO36示出了除蟲鏈霉菌(GI=29828638)木聚糖酶的氨基酸序列。SEQIDNO:37示出了Cryptococcusadeliensis(GIJ624008)木聚糖酶的氨基酸序列。SEQIDNO38示出了未得到培養(yǎng)物的細菌(GI:18476191)木聚糖酶的氨基酸序列。SEQIDNO39示出了海棲熱袍菌(GI=71041762)木聚糖酶的氨基酸序列。SEQIDNO40示出了Xyl-I脯氨酸豐富的共有序列的氨基酸序列。發(fā)明詳述定義如本文所使用的，術語“熱穩(wěn)定的”是指在65°C下培養(yǎng)15分鐘后的木聚糖酶活性閾值電平。如本文所使用的，術語“活性的”和“活性”是指在膠內木聚糖酶試驗或如下所述的還原糖測定中得到陽性結果的內切-β-1，4-木聚糖酶。如本文所使用的，術語“活性百分比”是指，在指定的實驗條件下測定的內切-β-1，4-木聚糖酶活性值與基線木聚糖酶活性值的比值。在實驗條件下測定的木聚糖酶活性值除以基線木聚糖酶活性值，再乘以100，以獲得活性百分比。如本文所使用的，術語“基線木聚糖酶活性”和“基線對照”是指內切-β-1，4-木聚糖酶在55°C，pH值5.2的條件下10分鐘產生的木聚糖酶活性值。如本文所使用的，術語“半衰期”是指，在指定的溫度條件下內切-β-1，4-木聚糖酶活性下降50%(與基線對照相比)的必要持續(xù)時間。如本文所使用的，術語“最佳活性”是指，在指定的溫度范圍或PH值范圍內的木聚糖酶最大活性。如本文所使用的，術語百分比“同源”，“同源百分比”和“序列同源性百分比”被定義為在一組參考核酸或氨基酸序列和至少另外一組核酸或氨基酸序列之間的同源值。序列同源性百分比可以通過比較兩組最佳比對序列測定。其中，與不含有增加或缺失片段的參考序列(比如一公開的核酸或氨基酸序列)比較時，被比較的序列一部分可能含有增加或缺失(即空白)片段，從而形成兩組序列的最佳比對。通過測定兩組序列中產生的同源核酸或氨基酸殘基位點數(shù)得到匹配位點數(shù)，用匹配位點數(shù)除以總位點數(shù)，再乘以100，得到序列同源性百分比。當使用以下序列比較算法中的一種或使用人工排列和目測檢查來測定被比較和比對的序列達到最大相關或指定區(qū)域時，如果兩組序列有相同核酸或氨基酸殘基(即，在指定區(qū)域內，或非指定區(qū)域整組序列內具有75%序列同源性)的指定百分比，那么這兩組序列具有同源百分比。適用于測定序列同源性百分比的算法的一個例子是BLAST算法，該算法在Altschul等人于1977年發(fā)表的Nuc.AcidsRes.25:3389-3402中進行描述。運行BLAST分析的軟件在國家生物技術信息中心公開獲得。BLASTN程序(被用于核酸序列)以字長(W)為11，期望(E)或10，M=5，N=-4及兩個鏈的比值的默認值使用。對于氨基酸序列，BLASTN程序以字長(W)為3，期望(E)為10，和BL0SUM62計分矩陣(參見Henikoff和Henikoff于1989年發(fā)表的Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)對比(B)為50，期望(E)為10，M=5，N=-4及兩個鏈的的比值的默認值使用。解纖維熱酸菌XYL-I木聚糖酶以下將描述大量典型的構圖，參數(shù)，和類似信息。然而應該被認同的是，這種描述并不旨在限制本發(fā)明的范圍，而是旨在為典型實施例作出描述。解纖維熱酸菌11B(ATCC43068)是一種起初從黃石國家公園的酸性溫泉中分離出來的嗜熱細菌。許多熱穩(wěn)定的內切纖維素酶都是由這種有機物產生的，這些酶用于在生產乙醇或其他碳氫化合物以制作生物燃料的過程中降解纖維素。解纖維熱酸菌(Acidothermuscellulolyticus)IlB(以下f旨A.cellulolyticus)已經(jīng)完成測序(RefseqNC_008578)，并且該序列已經(jīng)被注釋。該序列和序列注釋為有潛在用處的酶(公開的登錄號為NC_008578)的調控和生產提供信息。在這些有潛在用處的酶中，解纖維熱酸菌序列注釋預測出一個單獨的推定的內切-β-1，4-木聚糖酶，其由Acel_0372(來自解纖維熱酸菌基因組注釋)編碼。有理由相信，之前沒有關于內切-β-1，4-木聚糖酶被克隆的報告，而且預測的分子量與之前公開的解纖維熱酸菌木聚糖酶(美國專利號5，902，581)不一致。因此，這種預測的內切-β-1，4-木聚糖酶是從解纖維熱酸菌中克隆而得，作為重組蛋白進行表達。由Acel_0372編碼的表達的蛋白質被定義為糖基水解酶家族10(GHlO)內切-β-1，4-木聚糖酶。這種解纖維熱酸菌GHlO家族木聚糖酶被命名為Xyl-I。Xyl-I的特征顯現(xiàn)出它是一種嗜熱木聚糖酶，其最適溫度是90°C，最適pH值范圍是4.5至6.0。Xyl-I的另一個特征是在25至120°C的溫度范圍內，pH值3至9的條件下保留木聚糖酶活性。Xyl-I還具有約40至48kD的分子量。此外，Xyl-I與美國專利號5，902，581中公開的解纖維熱酸菌木聚糖酶不同，其溫度范圍高于美國專利號5，902，581中公開的解纖維熱酸菌木聚糖酶70至80°C的溫度范圍，其pH值酸性低于比美國專利號5，902，581中公開的木聚糖酶3.6至4.2的pH值范圍，其體積小于美國專利號5，902，581中公開的木聚糖酶50_55kD的體積。令人驚奇和意外的是，解纖維熱酸菌產生第二種木聚糖酶(即Xyl-I)，與之前定CN102245763A說明書9/17義的木聚糖酶(美國專利號5，902，581)的在最適溫度和pH值范圍上不同。如前所述，Xyl-I用于在生產乙醇或其他碳氫化合物以制作生物燃料的過程中降解(比如水解)包含木聚糖的材料、包含木葡聚糖的材料、和包含木質纖維生物量的材料。比如，Xyl-I可用于水解樺木、燕麥、柳枝稷、玉米秸稈、芒屬、能源甘蔗、高粱、桉樹、柳樹、甘蔗渣、雜交白楊、其他短期輪作木本作物、不同種類的針葉軟木、作物殘留物或庭園廢物里的木質纖維生物量，以改進這些底物中發(fā)酵糖的有效性。在工業(yè)應用中，水解步驟優(yōu)選在50至100°C的溫度范圍內和酸性pH值范圍的條件下進行。Xyl-I在寬溫度范圍和pH值范圍內的穩(wěn)定性使其在工業(yè)加工中被廣泛應用。此外，Xyl-I在波動條件下提供長期持續(xù)的木聚糖酶活性，能應用于大型生物轉化系統(tǒng)中。這些條件進一步允許其能夠利于聯(lián)合木質纖維素水解與木質纖維素發(fā)酵。Xyl-I也可用于造紙工序步驟中的木質纖維紙漿漂白，通過讓飼料更易消化來改進動物飼料，或者Xyl-I可作為洗滌劑組成成分使用。本發(fā)明中公開的木聚糖酶，可以通過下面的非限制性實施例來更好的理解它們的制作方法和使用方法。具體實施例實施例1:Xyl-l的克隆根據(jù)解纖維熱酸菌IlB基因組注釋，Acel_0372編碼一個預測的分泌的木聚糖酶(Xyl-I)ο為了克隆Acel_0372，將解纖維熱酸菌11B(ATCC43068)基因組DNA如前所述(15)進行純化，設計低核苷酸引物以使用PCR擴增完整的Acel_0372，來自解纖維熱酸菌中的預測的1.4kb的Xyl-I基因(圖2)。使用的引物對是正向Xyl(5，-GTGGTGGAGCTCGCAATTCGTTCACGTTGAGG-3，)(SEQIDNO14)，和反向Xyl(5‘-GTGGTGTCTAGAACCATCGAGTGGGAGTGACG-3，)(SEQIDN0:15)。下劃線序列表示增加的用于克隆的酶切位點，其分別為McI和)(bal。使用Pfu按如下程序進行PCR擴增在95°C下最初變性持續(xù)3分鐘，然后95°C，1分鐘、55°C，1分鐘、70°C，1分鐘進行25個循環(huán)、最終在70°C下延伸5分鐘。PCR得到一個1.4-kb產物，即xyl-Ι基因(圖3)。用QIA快速凝膠提取試劑盒Oliagen，Valencia,Calif.)將獲得的1.4-kbPCR產物從瓊脂糖凝膠中純化，用McI和XbaI消化，連接到McI-XbaI-消化的pK19上(16)。通過標準程序(18)將質粒DNA轉化進入大腸桿菌DH5α細胞。克隆體用Mel和)(bal酶切進行確定。在包含xyl-Ι基因的陽性的pK19克隆體上進行DNA序列分析(圖5)。在加利福尼亞大學戴維斯測序研究所用帶有應用生物系統(tǒng)3730號自動測序器進行自動熒光的DNA測序。使用載體NTI軟件系列(Invitrogen，Carlsbad,Calif.)進行核苷酸和氨基酸序列分析。xyl-Ι基因的完整序列與報道中的Acel_0372序列一致。實施例2=Xyl-I在解纖維熱酸菌中的表達材料和方法解纖維熱酸菌培養(yǎng)物在如前所述的補充礦物質的培養(yǎng)基(1中生長。單獨提供燕麥木聚糖酶、纖維素、纖維二糖或葡萄糖作為濃度0.5%的碳源。讓細胞生長到中間指數(shù)期或平穩(wěn)期，在4°C下，10，OOOxg離心15分鐘獲得細胞。將細胞沉淀冷凍在液氮中，在無菌砂存在下，用液氮中預冷的研缽和杵將細胞磨碎破壞。用RNeasyPlantMiniKit(Qiagen)提取RNA，用不含核糖核酸酶的脫氧核糖核酸酶^jiagen)酶切幾輪，再用RNeasyPlantMiniKit清洗。對燕麥木聚糖或者纖維素上的培養(yǎng)物，將高分子量聚乙二醇(最終濃度w/v)加到細胞裂解液中以減少污染的基因組DNA數(shù)量。結果發(fā)現(xiàn)，幾輪脫氧核糖核酸酶切完全消除DNA污染。使用AgilentBioanalyzer2100(AgilentTechnologies)分析RNA的質量，并使用分光光度計(ThermoScientific)對RNA量化。使用特異于xyl-Ι基因的引物(引物5，-CAAAGGAAAGATCTGGCAATG-3，(SEQIDNO16)和5，-TGAGCATCCCGTCGTAGTAGT-3，(SEQIDNOI7))通過逆轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)，從IOOng總RNA樣品中擴增一個485bp的產物。使用QiagenOneStepRT-PCRkit進行操作。在瓊脂糖凝膠上對擴增的產物進行分析，用紅色凝膠成像系統(tǒng)(AlphaInnotech)對其拍照。使用gyrB基因特異性引物5，-GACCCGACCGAGGTTTATTAC-3，(SEQIDN0:18)和5，-GCCGAACTTGTTCACCAAATA-3，(SEQIDNO19)擴增一個270bp產物。該產物用于RNA裝載的標準化同時用于xyl-Ι表達的半定量。為了生物學上重復實驗，使用在培養(yǎng)菌完全生長條件下獨立提取的第二批RNA重復RT-PCR反應。兩次實驗獲得相同的結果，示出了重復實驗之一的數(shù)據(jù)。對于蛋白質組學分析，解纖維熱酸菌在燕麥木聚糖酶上生長到平穩(wěn)期，通過離心獲得培養(yǎng)物上清液。用超過濾器攪拌超細過濾帶有5kDa分子量微孔的聚醚砜膜細胞來濃縮培養(yǎng)物上清液至50倍。為了鑒定在濃縮的培養(yǎng)物上清液中的蛋白質，在加利福尼亞大學戴維斯蛋白質組學核心研究所對樣品進行液相色譜分析，再進行串聯(lián)質譜分析(LC/MS/MS)。MM在燕麥木聚糖、纖維素、纖維二糖和葡萄糖上生長的培養(yǎng)菌指數(shù)期及平穩(wěn)期中，研究解纖維熱酸菌xyl-l基因的轉錄表達。RT-PCR分析顯現(xiàn)xyl-Ι在木聚糖和纖維素上生長的培養(yǎng)菌中表達(圖6A)。在平穩(wěn)期的纖維二糖上生長的培養(yǎng)菌中xyl-l基因也以低水平表達。在任何時候的葡萄糖上生長的培養(yǎng)菌中或在指數(shù)期的纖維二糖上生長的培養(yǎng)菌中均未監(jiān)測出基因表達。在木聚糖和纖維素上生長的培養(yǎng)菌中，在指數(shù)期和平穩(wěn)期生長時段內，xyl-l表達似乎基本上是相同的。使用gyrB基因作為內部對照標準化xyl-l基因表達水平(圖6B)。串聯(lián)質譜光譜證實Xyl-I在培養(yǎng)物上清液中存在(圖6C)，并表明靶定分泌蛋白的N-端25個氨基酸信號肽從成熟蛋白質中分開。實施例3:xyl-l基因啟動子的序列分析xyl-l基因被確定在負鏈上，被負鏈上的分開的位于上游基因的147bp和下游基因的451bp所隔開。兩種側翼基因功能都與木聚糖酶不相關。因此，xyl-l并未顯現(xiàn)出是基因簇或操縱子的一部分。對451bp上游啟動區(qū)的分析顯現(xiàn)編碼起始的推定的Shine-Dalgarno核糖體結合位點(RBS)6個核苷酸上游。RBS序列(5'TGGAGG3，)(SEQIDNO20)是在解纖維熱酸菌16S核糖體rRNA3’端發(fā)現(xiàn)的保守CCTCCT(序列特征編號21)序列的互補序列，兩者只有一個堿基不匹配(圖7)。推定的-35和-10序列也被鑒定(圖7)，其能夠與緊密相關的放射菌類，鏈霉菌屬00)中提出的共有序列啟動子基序良好匹配，并且可能是解纖維熱酸菌xyl-l基因的ο70啟動子序列。在EMBOSS中使用回文序列軟件在xyl-l的啟動區(qū)發(fā)現(xiàn)幾個小的反向重復(17)。這些反向重復中，與鏈霉菌屬GHlO家族木聚糖酶啟動區(qū)比較之后(6)，發(fā)現(xiàn)三個反向重復(圖7)是保守的。三個反向重復序列，IR-1、IR_2和IR-3，在xyl-Ι啟動子分別與框1、框2和框3的共有序列相匹配，這三種共有序列被描述用于鏈霉菌屬中的一些GHlO家族木聚糖酶基因(6)。但是，在兩種生物體中的這些推定的調控元件的長度和位置差別很大。在xyl-Ι啟動子中，末段IR-I序列形成一個短回文序列(5，GAAA-C-TTTC3，)(SEQIDNO11)，下游IR-3回文序列延伸成三個核苷酸長度(5，TCCGAAA-A-TTTCGGA3，)(SEQIDNO13)，而在鏈霉菌屬中框3回文序列比框1長一個核苷酸長度。解纖維熱酸菌IR-2序列(5，TTTC-C-GAAA3，)(SEQIDNO12)幾乎與鏈霉菌屬框2序列相同。但是，不像在鏈霉菌屬中框1和框2被各自分離約10bp，xyl-1的IR-2元件與IR-I重疊(圖7)。此外，在解纖維熱酸菌中，IR-I和IR-2區(qū)域位于推定的-35和-10元件下游，更接近于編碼起始位點，而兩個相關框都是啟動子的上游，遠離鏈霉菌屬中的第一個密碼子。實施例4=Xyl-I蛋白質的純化材料和方法含有克隆的xyl-Ι基因的大腸桿菌DH5α在30°C下，在含有IOmM葡萄糖，ImM硫胺素和100μg/ml卡那霉素的最少鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。離心(在4°C下以14，OOOxg離心15分鐘)獲得細胞，用IOmM磷酸鹽緩沖液洗滌一次，在相同的緩沖液中重懸，并在-20°C下冷凍保存。將冷凍細胞懸浮液從冷凍箱中移出，然后在冰上解凍。然后將解凍的細胞下懸浮液一次通過弗氏壓碎器，其保持內部細胞壓力恒定18，000psi。在6°C下，以48，OOOxg離心90分鐘清除細胞碎片和薄膜。將得到的細胞粗提取物通過在65°C下培養(yǎng)20分鐘進行熱處理。在4°C下，以14，OOOxg離心15分鐘除去不溶物。在4°C下使用自動FPLC系統(tǒng)(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)進行純化過程。將細胞提取物應用于包#UnosphereQ(Bio-RadLaboratories)^^100ml()的tt。UnosphereQB用IOmM磷酸鹽緩沖液(!1值5.2)預平衡。將未結合的蛋白質用100ml同樣的緩沖液以1.Oml/分鐘的速率洗脫。將結合的蛋白質用從0到10M線性梯度的KCl在磷酸鹽緩沖液中以同樣的速率洗脫，并收集5ml餾分。結果將大腸桿菌克隆的提取物在65°C下熱處理15分鐘，然后將提取物裝載到離子交換柱上。洗脫的Xyl-I蛋白質呈現(xiàn)一個活性主尖峰(圖8)。這種熱處理清除了許多大腸桿菌蛋白質，得到高純度的Xyl-I(圖9)。使用SDS-PAGE分析測定，濃縮的蛋白質純度>90%。(圖9和圖10)。從4L大腸桿菌培養(yǎng)菌中得到約2mg純化的Xyl-I。在SDS凝膠上重組Xyl-I具有大約40-48kD的分子量(圖9和圖10)，這與根據(jù)加工的蛋白質氨基酸序列的推定所預測的分子量GO.3kD)一致。部分純化的Xyl-I的溫度vs.PH值分布圖證明，酶活性具有寬溫度范圍，最佳活性約在90°C下，也具有寬pH值范圍，最佳pH值在4.5至6.0范圍內(圖11)。實施例5=Xyl-I的N-端氨基酸序列分析從大腸桿菌中純化的重組Xyl-I樣品，如實施例4所描述，用于測定Xyl_l(一種細胞外酶)是否能在大腸桿菌中被恰當加工。在聚偏氟乙烯膜(ProBlott;AppliedBiosystems)上對純化的蛋白質進行SDS-PAGE和電印跡處理后，在加利福尼亞大學戴維斯分子結構研究所的自動測序器(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)上用Edman降解純化的Xyl-I測定其N-端氨基酸序列。發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中表達的重組Xyl-I的N-端序列是HGNPPYHPPAD(SEQIDNO22)。該序列的第一個氨基酸映射到氨基酸序列全長的位點沈上，表示預測的Xyl-I信號序列恰當從異種宿主大腸桿菌中裂解(圖幻。這表示大腸桿菌細胞用裂解信號序列來加工Xyl-i，該信號序列為分泌的信號序列。由于本實施例使用的是天然解纖維熱酸菌IlB木聚糖酶，在大腸桿菌中表達的Xyl-I缺少分泌的信號序列。實施例6=Xyl-I氨基酸序列分析對解纖維熱酸菌GHlO家族木聚糖酶Xyl-I氨基酸序列進行BLAST檢索。最熱門的是來自另一種放射菌類的木聚糖酶，CatenulisporaacidiphilaDSM44928，該序列與Xyl-I具有75%的序列同源性。第二個熱門的是近期來自放射菌類纖維微桿菌屬HY-12的生物化學特征的木聚糖酶，該序列與Xyl-I具有的序列同源性(13)。將Xyl-I與以上兩種同系物，以及其他在Xyl-I的167和284位置以保守谷氨酸活性位點存在的功能性特征GHlO家族木聚糖酶一起進行多序列分析。預測的谷氨酸活性位點周圍的區(qū)域在GHlO序列中十分保守，第一個谷氨酸周圍的保守基序是DVVNE(SEQIDNO:23)，第二個谷氨酸周圍的保守基序是TELD(SEQIDNO:24)。Xyl-I在兩個區(qū)域內具有纈氨酸-丙氨酸和亮氨酸-丙氨酸這兩種取代，分別得到DVANE(SEQIDNO25)和TEAD(SEQIDNO26)(圖12)。未特征化的C.acidiphila同系物也具有這些取代。應該理解的是，本發(fā)明公開的同源內切-β-1，4-木聚糖酶可能有第一個谷氨酸，對應于SEQIDNO:1的谷氨酸-142的位置。優(yōu)選的，第一個谷氨酸位于具有天冬氨酸-纈氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-谷氨酸序列(SEQIDNO25)的氨基酸區(qū)域內。本發(fā)明公開的同源內切-β-1，4-木聚糖酶可能有第二個谷氨酸，對應于SEQIDΝ0:1的谷氨酸-259的位置。優(yōu)選的，第二個谷氨酸位于具有蘇氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸序列(序列特征編號26)的氨基酸區(qū)域內。將Xyl-I與未特征化的(C_ac，S_av)，嗜冷菌的(C_ad)，嗜溫菌的(C_fi)，中度嗜熱的((_8，？_吐，5_讓，1~_31，11_311)，熱穩(wěn)定的(A_ce，T_ma，U_ba)木聚糖酶比較進行多氨基酸序列比對。不同木聚糖酶氨基酸組成分析顯示，在Xyl-I(A_ce)中，不耐熱的殘基絲氨酸和蘇氨酸比例，與在Xyl-I(A_ce)最近的序列同系物C_ac中相比大幅度下降(圖12)。這兩種氨基酸相似的不足詮釋在之前T_ma(7)蛋白質中曾記錄過，被認為有助于形成高熱穩(wěn)定性。但是，大多數(shù)記錄的為T_ma提供熱穩(wěn)定性的其他特點在Xyl-I中無法確定。經(jīng)過測定，Xyl-I包含一個具有5個氨基酸的區(qū)域，PHPLP(SEQIDN0:27)，不同于該序列的兩個最近同系物(C_a(^nC_sp)，也不同于其他GHlO家族的木聚糖酶，而是立刻成為第一個谷氨酸活性位點下游(圖12)。氨基酸區(qū)域包含交替位置的三個脯氨酸。對其他木聚糖酶序列的更近一次觀察顯示，除來自真菌Catenulisporaacidiphil,Cryptococcusadeliensis、白腐菌和一種有一個與第一個谷氨酸活性位點相近的單個脯氨酸的未得到培養(yǎng)物的細菌(U_ba)之外，沒有一種其他比對生物體在15個活性位點的殘基內具有脯氨酸(圖12)。包含與第一個谷氨酸活性位點相近的三個脯氨酸的獨特區(qū)域對Xyl-I的熱穩(wěn)定性有重要作用。脯氨酸殘基由于剛性構象影響蛋白質折疊，已經(jīng)證明其可以提高蛋白質的熱穩(wěn)定性02)。可能的情況是，圍繞Xyl-I的活性位點的多脯氨酸限制蛋白質結構主鏈的靈活性，從而提高該蛋白質的熱穩(wěn)定性。本發(fā)明公開的同源內切-β-1，4-木聚糖酶可能有一個氨基酸區(qū)域，包含三個脯氨酸，其具有與SEQIDNO:27至少80%同源性的氨基酸序列。優(yōu)選的，氨基酸區(qū)域具有SEQIDNO:27的氨基酸序列。此外，同源內切-β-1，4-木聚糖酶可能有一個氨基酸區(qū)域，包含三個脯氨酸，其具有與SEQIDNO:27同源的氨基酸序列，其中氨基酸序列在任何一個脯氨酸中有一個保守的氨基酸取代物。同源內切-β-1，4-木聚糖酶可能有一個氨基酸區(qū)域，包含三個脯氨酸，其具有與SEQIDNO:27同源的氨基酸序列，其中兩個非脯氨酸氨基酸區(qū)域可能是任一個氨基酸。實施例7=Xyl-I活性試驗材料和方法使用之前所述酶譜法的修正版本監(jiān)控Xyl-I活性(8)。簡言之，使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(10%)分離蛋白質。凝膠運行后，將其置于IOmM磷酸鹽緩沖液(ρΗ5.2)中，在52°C下輕微震動培養(yǎng)15分鐘。除去緩沖液用木聚糖(來自IOmM磷酸鹽緩沖液[ρΗ5.2]中的燕麥(Sigma)的1%木聚糖)替代，在52°C下輕微震動培養(yǎng)15分鐘。除去木聚糖溶液，用蒸餾水簡單沖洗凝膠。然后將凝膠置入一種剛果紅溶液中(水中含0.2%)，在室溫下輕微震動培養(yǎng)20分鐘。用IMNaCl讓凝膠脫色直到可以看見“清晰的”條帶。為測試酶具有活性的溫度范圍，在4°C至100°C的溫度范圍內，在ρΗ值5.2的熱水浴或冷水浴中進行凝膠試驗。在0°C下的冰浴中監(jiān)控酶活性。將所有溶液預培養(yǎng)至試驗溫度。使用ρΗ值2.0至10的磷酸鹽緩沖液修正試驗來測試酶的ρΗ值范圍。MM使用燕麥木聚糖酶作為底物，對表達重組Xyl-I(參見實施例1)的轉化的大腸桿菌進行木聚糖酶活性的測試。帶有克隆基因的大腸桿菌提取物具有木聚糖酶活性(在52°C，pH值5.2下測試)，隨后在651下熱處理15分鐘保留酶活性(圖13)。只帶有？1(19(載體對照)的菌株提取物沒有顯示酶活性。用樺木木聚糖酶(數(shù)據(jù)未顯示)觀察酶活性。在大腸桿菌培養(yǎng)物上清液中顯示出一些蛋白質，其展現(xiàn)的電泳遷移率與濃縮解纖維熱酸菌培養(yǎng)物上清液中顯示出的輸出的木聚糖酶的電泳遷移率相同(圖14)，該培養(yǎng)物上清液來自以纖維二糖作為碳源生長的細胞。實施例8=Xyl-I的最佳活性材料和方法使用實施例7中所述的酶譜法測定膠內木聚糖酶活性。用還原糖測定的修正版本來量化活性(11)。在無緩沖的IOmM磷酸鹽溶液中加入木聚糖制成木聚糖底物(燕麥木聚糖或樺木木聚糖，Sigma)。在55°C下輕微震動20分鐘培養(yǎng)成漿液。將不溶物放置在室溫下。除去上清液，用HCl或NaOH調節(jié)ρΗ值。將^iil懸浮液倒入一個有螺絲帽的管中，在所需溫度下水浴培養(yǎng)10分鐘。加入木聚糖酶，在不同時間點取200μ1樣品，然后加入800μ1PABAH(在0.5ΜNaOH中含0.5%對羥基苯甲酸酰胼)。將樣品煮沸到剛好5分鐘，在室溫下冷卻10分鐘，測定410nm處的吸光度。將結果與木糖的標準曲線進行比較。在不同溫度和PH值下實施試驗來測定木聚糖酶具有活性的溫度和PH值。在121°C下在高壓滅菌器中測試活性。為了實施該試驗，在冰上混合各組分，并置入高壓滅菌器內，設置121°C處理10分鐘。用之前所述的PABAH的存在來測定還原糖釋放量。使用牛血清白蛋白做標準，用Bradford方法(測定蛋白質濃度。結果用酶譜法試驗測定表達重組Xyl-I的轉化的大腸桿菌細胞粗提取物在0至100°C溫度范圍下具有木聚糖酶活性(圖15)。利用酶譜法，觀察到在pH值4.5至6.0的范圍內Xyl-I具有最佳活性，但是在pH值3至9的范圍內顯示出很強的活性(圖16)。在不存在底物的情況下，將提取物在80°C下熱處理20分鐘，Xyl-I保留活性(圖17)。在這些條件下，Xyl-I保留了整個活性約59%的活性(圖18)。但是，在不存在木聚糖的情況下，將提取物在100°C下熱處理20分鐘，沒有活性保留(圖18)。進一步調查研究表明，木聚糖的存在使Xyl-I在高溫下保持穩(wěn)定。具體地，還原糖測定顯示，在木聚糖存在使其保持穩(wěn)定的情況下，Xyl-I在約90°C下具有最佳活性，比55°C下測定的活性高出約225%(圖19)。用還原糖測定測定，在55至100°C范圍內用底物培養(yǎng)時，來自細胞粗提取物的Xyl-I比活性很高，在約90°C下具有最佳活性(圖19)。細胞粗提取物內的Xyl-I比活性用每分鐘每mg未純化蛋白質mg木糖測定。在高壓滅菌器中測試活性，以測試在溫度高于100°C的活性(高壓滅菌器溫度設在121°C)，即使在高壓滅菌器中Xyl-I也保留一些活性(900μg木糖/每分鐘/mg蛋白質)。用還原糖測定來使純化的Xyl-I活性具有的溫度和PH值范圍的特征化。純化的Xyl-I在30至100°C的溫度范圍內具有活性，其最佳活性的溫度約在90°C(圖20)。用每分鐘每mg未純化蛋白質mg木糖測定純化的Xyl-I比活性。觀察到最佳活性在pH值4.5至6.0的范圍內(圖20A)，但在pH值3至9的范圍內顯示出很強的活性(圖20B)。酶的最適PH值隨試驗溫度發(fā)生變化。在100°C下，Xyl-I在pH值4至6的范圍內具有活性，并在pH值5.0時活性最佳。同時也注意到，隨試驗溫度下降，Xyl-I在較高pH值(pH7至10)時具有活性(圖20B)。在試驗最后測定試驗混合物的pH值，沒有在試驗中發(fā)現(xiàn)pH值在pH值3至8的范圍內有很大變化。在最后pH值9試驗中pH值恒定為8.6.實施例9=Xyl-I熱穩(wěn)定性研究材料和方法用IOmM磷酸鹽緩沖液(pH值6)或者濃度4%的燕麥或樺木木聚糖的IOmM磷酸鹽緩沖液(PH值6)以120比例稀釋純化的Xyl-I(lmg/ml)，混合，在冰上培養(yǎng)最少15分鐘以確保Xyl-I與木聚糖在熱處理前有充分時間相互作用。將等份的對照物和木聚糖預處理的Xyl-I在90°C下培養(yǎng)10分鐘、20分鐘、40分鐘或60分鐘后，立刻返回冰上。然后在90°C和pH值6下用還原糖測定(之前實施例5中所述)測定活性。結果研究木聚糖底物對Xyl-I熱穩(wěn)定性的作用(圖21A)。在木聚糖不存在時，Xyl-I在90V下培養(yǎng)10分鐘、20分鐘、40分鐘和60分鐘后，分別保留74士18%、63士12%、M士3%和5士的活性(圖21A)。相反，在燕麥或樺木木聚糖存在時，即使在90°C下培養(yǎng)1小時也沒有檢測到很大的活性喪失情況。其他未作為Xyl-I的底物使用的多聚糖(微晶纖維素纖維二糖，膠質[KELCOZN85192A]，和羥甲基化纖維素[Fluka])沒有使Xyl-I穩(wěn)定(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結果表明，木聚糖底物在高溫下很大程度穩(wěn)定純化的Xyl-I。在燕麥木聚糖存在時，在90°C下延長培養(yǎng)時間后，Xyl-I活性分析表明，在燕麥木聚糖存在時Xyl-I的半衰期約為1.5小時(圖21B)。實施例10用Xyl-I的木聚糖裂解模式分析材料和方法使用如前所述的薄層色譜法(TLC)(10)分析木聚糖的水解產物。使用燕麥木聚糖和樺木木聚糖(在pH值6下，IOmM磷酸鹽緩沖液中濃度2%)各自作為底物。將純化的Xyl-I加入木聚糖底物中在90°C下培養(yǎng)。在不同時間點上取樣，放入干燥的冰異丙醇浴器內快速冷凍并在-20°C下保存。將樣品在冰上解凍，灑在硅膠盤上。顯影溶劑是氯仿、醋酸和水(671)的混合物。將溶劑前端遷移到TLC盤頂部，然后讓TLC盤風干。為促進溶解，將每張色譜圖以這種方式處理共三次。在乙醇和硫酸比例分別是955的溶液中浸漬色譜圖來檢測水解產物，在105°C下培養(yǎng)5分鐘。從Megazyme國際愛爾蘭有限公司(Wicklow,Ireland)中得到木糖低聚物標準(木三糖和木四糖)。MM根據(jù)木糖、木三糖和木四糖標準(圖2的TLC遷移率比較分析，鑒定出樺木木聚糖水解的主要產物是木二糖和木四糖。少量木糖、木三糖和可能是木五糖的產物也是從樺木木聚糖中成形。增加點可能顯示在完整的多聚糖內有酰化或經(jīng)過糖側基的木聚糖主鏈木糖殘基(比如葡萄糖醛酸)。燕麥木聚糖的主要產物在木糖和木三糖之間有&值。這些也表明，在完整的多聚糖內有Xyl-I反應或經(jīng)過糖側基的主鏈木糖殘基(比如阿糖殘基)的酰化低聚糖產物。結果證明Xyl-I是一個內切反應木聚糖酶。實施例11木質纖維素材料的木聚糖酶水解作用與發(fā)酵作用相耦合木質纖維材料，比如柳枝稷和玉米秸稈，可以用設計為表達重組的Xyl-I的發(fā)酵有機物處理，該重組Xyl-I的提取物中包含酶或純化酶。可通過將柳枝稷或玉米秸稈與設計為表達酶的有機物組合來進行處理。可選地，在木質纖維發(fā)酵過程中，可加入重組Xyl-I。參考文獻1.Beg,Q.K.,Μ.Kapoor,L.Mahajan,andG.S.Hoondal.2001.Microbialxylanasesandtheirindustrialapplications:areview.Appl.Microbiol.Biotechnol.56326-338.2.Butt,M.S.,M.Tahir-Nadeem,Z.Ahmad,andΜ.T.Sultan.2008.Xylanasesandtheirapplicationsinbakingindustry.FoodTechnol.Biotechnol.46:22-31.3.Bradford,Μ.M.1976.Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding.Anal.Biochem.72:248-254.4.Collins,Τ.,C.Gerday,andG.Fellar.2005.Xylanases,xylanasefamiliesandextremophilicxylanases.FEMSMicrobiol.Rev.29:3-23.5.Dodd,D.,andI.0.Cann.2009.Enzymaticdeconstructionofxylanforbiofuelproduction.GCBBioenergy1:2-17.6.Giannotta,F.,J.Georis,S.Rigali,M.J.Virolle,andJ.Dusart.2003.Site-directedmutagenesisofconservedinvertedrepeatsequencesinthexylanaseCpromoterregionfromStreptomycessp.EC3.MoI.Genet.Genomics270337-346.7.Ihsanawati,T.Kumasaka,T.Kaneko,C.Morokuma,R.Yatsunami,T.Sato,S·Nakamura，andN.Tanaka.2005.StructuralbasisofthesubstratesubsiteandthehighlythermalstabilityofxylanaseIOBfromThermotogamaritimaMSB8.Proteins61:999-1009.8.Jung,K.H.,andM.Y.Pack.1993.ExpressionofaClostridiumthermocellumxylanasegeneinBacillussubtilis.Biotechnol.Lett.15:115-120.9.Kulkarni,N.，A.Shendye，andM.Rao·1999.Molecularandbiotechnologicalaspectsofxylanases.FEMSMicrobiol.Rev.23:411-456.10.Lee,J.-W.，J.—Y.Park,M.Kwon,andL-G.Choi.2009.Purificationandcharacterizationofthermostablexylanasefromthebrown-rotfungusLaetiporussulphureus.J.Biosci.Bioeng.107:33-37.11.Lever,M.1973.Colorimetricandfluorometriccarbohydratedeterminationwithp-hydroxybenzoicacidhydrazide.BiochemicalMedicine7274-281.12.Mohagheghi，A.，K.Grohmann，Μ·Himmel，L.Leighton，andD.Μ.Updegraff.1986.IsolationandcharacterizationofAcidothermuscellulolyticusgen.nov.,sp.nov.,anewgenusofthermophilic，acidophilic，cellulolyticbacteria.Int.J.SystematicBact.，vol.36，no.3，pp.435-443.13.Oh,H.-W.，S.—Y.Heo,D.Y.Kim,D.—S.Park,K.S.Bae,andH.—Y.Park.2008.Biochemicalcharacterizationandsequenceanalysisofaxylanaseproducedbyanexo-symbioticbacteriumofGryllotalpaorientalis,Cellulosimicrobiumsp.HY-12.AntonievanLeeuwenhoek93:437-442.14.Polizeli，M.L.Τ.M.，A.C.S.Rizzatti,R.Monti,H.F.Terenzi,J.A.Jorge，andD.S.Amorim.2005.Xylanasesfromfungi-propertiesandindustrialapplications.App1.Microbiol.Biotechnol.67:577-591.15.Pospiech,A.，andB.Neumann.1995.Aversatilequick-prepofgenomicDNAfromgram-positivebacteria.TrendsGenet.11:217-218.16.Pridmore，R.D.1987.Newandversatilecloningvectorswithkanamycin-resistancemarker.Gene56:309—312.17.Rice,P.,I.Longden,andA.Bleasby.2000.EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite.TrendsGenet.16:276-277.18.Sambrook，J.，Ε.F.Fritch，andT.Maniatis.1989.MolecularCloning:alaboratorymanual,2nded·ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.19.Shiang，M.，J.C.Linden，A.Mohagheghi，K.Grohmann,andM.E.Himmel.1991.EnhancedproductionofcellulaseusingAcidothermuscellulyticusinfed-batchculture.App1.Microb.Biotech.34:591-597.20.Strohl,W.R.1992.CompilationandanalysisofDNAsequencesassociatedwithapparentStreptomycespromoters.NucleicAcidsRes.20:961-974.21.Subramaniyan,S.，andP.Prema.2002.Biotechnologyofmicrobialxylanases:enzymology，molecularbiology,andapplication.Crit.Rev.Biotechnol.22:33-64.22.Watanabe,K.，Y.Hata,H.Kizaki,Y.Katsube,andY.Suzuki.1997.TherefinedcrystalstructureofBacilluscereusoligo-1,6-glucosidaseat2.OAresolutionstructuralcharacterizationofproline-substitutionsitesforproteinthermostabilization.J.MoI.Biol.269:42-53.權利要求1.一種重組的內切-β-1，4-木聚糖酶，其包含與SEQIDNO:1具有80%序列同源性的氨基酸序列。2.根據(jù)權利要求1所述的木聚糖酶，其中，所述木聚糖酶最適PH值約為4.5至6.0。3.根據(jù)權利要求1或2所述的木聚糖酶，其中，所述木聚糖酶具有約為40至48kD的分子量。4.根據(jù)權利要求1至3中任一項所述的木聚糖酶，其中，所述木聚糖酶在至少80°C下具有活性。5.根據(jù)權利要求1至4中任一項所述的木聚糖酶，其中，所述木聚糖酶在木聚糖存在時，在90°C下的半衰期約為90分鐘。6.根據(jù)權利要求1到5中任一項所述的木聚糖酶，其中，所述重組的內切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列范圍遵循共有序列脯氨酸-Xaa1-脯氨酸-Xaa2-脯氨酸(SEQIDNO40)，其中，Xaa1和)各自獨立地選自無氨基酸、任意一個氨基酸、任意兩個氨基酸和任意三個氨基酸組成的組中。7.根據(jù)權利要求6所述的木聚糖酶，其中，所述重組的內切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列含有在SEQIDNO:1的谷氨酸-142相應位置的第一個谷氨酸，和在SEQIDΝ0:1的谷氨酸-259相應位置的第二個谷氨酸，其中，所述重組的內切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列的區(qū)域位于第一個谷氨酸和第二個谷氨酸之間。8.根據(jù)權利要求6所述的木聚糖酶，其中，Xaa1是選自由組氨酸、賴氨酸和精氨酸組成的組中的一種氨基酸，Xaa2是選自由亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸組成的組中的一種氨基酸。9.根據(jù)權利要求6所述的木聚糖酶，其中，所述重組的內切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列的區(qū)域是脯氨酸-組氨酸-脯氨酸-亮氨酸-脯氨酸(SEQIDNO27)。10.根據(jù)權利要求1到9任一項所述的木聚糖酶，其中，所述重組的內切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列與SEQIDNO:1具有至少95%序列同源性。11.根據(jù)權利要求1至10中任一項所述的木聚糖酶，其中，所述重組的內切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列是SEQIDΝ0:1。12.—種重組細胞，其包括編碼權利要求1至10中任一項所述的重組的內切-β-1，4-木聚糖酶的核酸分子。13.一種水解木質纖維素的方法，該方法包括-將木質纖維素與包括一個與SEQIDNO:1具有至少80%序列同源性的氨基酸序列的重組的內切-β-1，4-木聚糖酶發(fā)生反應，其中，所述的木質纖維素與重組木聚糖酶在至少80°C下，pH值范圍約4.5至6.0的條件下發(fā)生反應。14.據(jù)權利要求13所述的方法，其中，所述木質纖維素的來源選自白樺木、燕麥、柳枝稷、玉米秸稈、芒屬、能源甘蔗、高粱、桉樹、柳樹、甘蔗渣、雜交白楊、短期輪作木本作物、針葉軟木、作物殘留物、庭園廢物及其組合組成的組中。15.要求13或14所述的方法，其中，所述重組的內切-β-1，4-木聚糖酶的氨基酸序列是SEQIDNO:1ο全文摘要公開了一種源于解纖維熱酸菌的嗜熱內切-β-1，4-木聚糖酶。該木聚糖酶在最佳溫度90℃和最適pH值范圍約4.5至6.0條件下表現(xiàn)出木聚糖酶活性。分離的木聚糖酶用于木質纖維素材料的水解。文檔編號C12N9/24GK102245763SQ200980151311公開日2011年11月16日申請日期2009年11月5日優(yōu)先權日2008年12月22日發(fā)明者A·M·柏瑞,J·V·小佩拉萊斯,R·D·巴拉博特,R·E·佩拉萊斯申請人:加州大學評議會