專利名稱：連續(xù)單反應(yīng)釜發(fā)酵合成丁醇的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及通過發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇，特別是涉及通過產(chǎn)生微環(huán)境來維持產(chǎn)酸和產(chǎn)溶劑相細(xì)胞共生(coincident)的亞群的單反應(yīng)釜(vessel) 丁醇生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
丁醇(正丁醇(n-butanol)或正-丁醇(η-butyl alcohol))可以通過碳水化合物的發(fā)酵來生產(chǎn)，所述碳水化合物降解成產(chǎn)物如包含五和六個碳原子的糖(如葡萄糖)。查爾斯魏茲曼(Charles Weizmarm)在第一次世界大戰(zhàn)期間發(fā)展了 這種方法(見，例如美國專利1，315，585 ；1, 329，214 ；1, 437，697)。簡單地說，魏茲曼方法包括在丙酮丁醇梭桿菌 {Clostridium acetobutylicum)存在下合適的原料的發(fā)酵，丙酮丁醇梭桿菌將原料轉(zhuǎn)化成丙酮、丁醇和乙醇(ABE)的溶劑混合物。在溶劑混合物中，丁醇丙酮乙醇的比率通常是 6 ！ 3 ！ I0ABE發(fā)酵為兩階段(biphasic)過程在第一(產(chǎn)酸)階段期間，對數(shù)生長伴隨乙酸和丁酸的生產(chǎn)，這也引起伴隨的和必需的PH下降。在第二(產(chǎn)溶劑)相中，生長停止，并且產(chǎn)生溶劑的同時消耗前述的酸，包括進(jìn)一步消耗輸入的原料。氫氣和二氧化碳在發(fā)酵過程中不斷產(chǎn)生。由此產(chǎn)生的溶劑以稀的含水溶液形式產(chǎn)生，一般為約重量，使得其純態(tài)回收包括其與大量水的分離。正是分離的費用使得通過發(fā)酵生產(chǎn)這些化學(xué)制品競爭不過從以石油為基礎(chǔ)的來源生產(chǎn)溶劑。然而，對全球氣候變暖的關(guān)注、實現(xiàn)能源獨立的愿望和石化衍生原料價格的增加使人們的興趣回到可將可再生未精制原料轉(zhuǎn)換成簡單有機(jī)化學(xué)制品的工藝上。用梭狀芽孢桿菌微生物發(fā)酵ABE的一個問題是丁醇對培養(yǎng)物有毒(即，在不考慮糖濃度的情況下，最大耐受丁醇濃度為大約2%)。通過在生產(chǎn)過程中連續(xù)除去丁醇可避免其毒性，用于最大量生產(chǎn)溶劑。各種丁醇去除系統(tǒng)，包括吸附、滲透蒸發(fā)、滲透萃取、反滲透、 液-液萃取和氣提，都不完全成功。此外，上述所有方法都增加了生產(chǎn)成本。因此，本領(lǐng)域仍然需要一種改進(jìn)的從這些生物體生產(chǎn)溶劑的工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明介紹了一種通過梭狀芽孢桿菌屬(CZo1Siridium genus )細(xì)胞對碳水化合物進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其中產(chǎn)酸相(acidogenic-phase)細(xì)胞和產(chǎn)溶劑相 (solventogenic-phase)細(xì)胞的混合物保持在單反應(yīng)釜中。本發(fā)明系統(tǒng)不需要間歇性調(diào)整 PH或排出頂空氣體。公開的方法提供了一種移除丁醇產(chǎn)物的工藝，所述丁醇產(chǎn)物并非不可逆地?fù)p害細(xì)胞，當(dāng)溶劑的抑制濃度不再存在時，這類細(xì)胞可以重新開始合成丁醇。此外，本發(fā)明包括包含梭狀芽孢桿菌細(xì)胞的組合物(compos i t ion )和生物純培養(yǎng)物。 在一個實施方案中，公開了丁醇生產(chǎn)的連續(xù)工藝，該工藝包括在第一反應(yīng)釜中使梭狀芽胞桿菌細(xì)胞和緩沖劑與包含碳水化合物的基質(zhì)相接觸，在最佳溫度下培養(yǎng)細(xì)胞直至達(dá)到丁醇抑制濃度，降低第一反應(yīng)釜中的壓力直到出現(xiàn)強(qiáng)烈沸騰，將包含丁醇的共沸物從第一反應(yīng)釜轉(zhuǎn)移到第二收集反應(yīng)釜作為冷凝物(condensate)，用清洗流體沖洗反應(yīng)釜，并不斷重復(fù)上述步驟。在相關(guān)方面，沖洗是冷凝收集體積(condensation collection volume)的功能，當(dāng)冷凝收集體積占培養(yǎng)物體積的約4% 時，沖洗開始。在另一方面，壓力從約760mm Hg下降至約20mm Hg-30mm Hg。在另一方面，當(dāng)溶劑產(chǎn)量為基質(zhì)中可同化碳水化合物的約35% -40% (wt/wt)時，補(bǔ)充包含碳水化合物的基質(zhì)。在一個方面，這些細(xì)胞包括但不限于beijerinkii, C. acetobutylicum, C. aurantibutyricum^ C. tetranomorphum 禾口C. thermocellum0 在才目關(guān)方面，梭狀芽抱桿菌 beijerinkii 的編號是 NRRL B-50244。在另一個實施方案中，公開了生產(chǎn)丁醇的連續(xù)工藝，其包括在第一反應(yīng)釜中使梭狀芽胞桿菌細(xì)胞的單培養(yǎng)物和緩沖劑與包含碳水化合物的基質(zhì)相接觸，在最佳溫度下培養(yǎng)細(xì)胞直至達(dá)到丁醇的抑制濃度，升高培養(yǎng)物溫度到比最佳溫度高約6°c -ire并將第一反應(yīng)釜的壓力從約760mm Hg降低至產(chǎn)生強(qiáng)烈沸騰，將包含丁醇的共沸物從第一反應(yīng)釜轉(zhuǎn)移至第二反應(yīng)釜作為冷凝物，用清洗流體沖洗第一反應(yīng)釜并將培養(yǎng)物冷卻至丁醇合成的最佳溫度作為冷凝收集體積的功能，并不斷重復(fù)上述步驟。在一個方面，當(dāng)溶劑產(chǎn)量為可同化碳水化合物的約35% -40% (wt/wt)時，補(bǔ)充包含碳水化合物的基質(zhì)。在另一方面，培養(yǎng)物包含產(chǎn)酸和產(chǎn)溶劑相中的細(xì)胞混合物。在相關(guān)方面，梭狀芽胞桿菌細(xì)胞為C. beijerinkii。在另一方面，清洗流體為N2氣體。在一個方面，最佳溫度為約33°C -37°C。在另一方面，溫度上升至約43°C -44°C。 在又一方面，壓力下降至約110謹(jǐn)Hg-IOCkm Hg。在一個方面，丁醇的抑制濃度為約0.9%-2.0%。在相關(guān)方面，丁醇的抑制濃度為約 1. 3%。在另一方面，緩沖劑包括碳酸鈣的生物源，其包括海螵蛸和牡蠣殼。在一個方面， 該方法還包括使細(xì)胞與分子骨架相接觸。在相關(guān)方面，分子骨架包括海綿碎片，其中海綿包含碳酸鈣、二氧化硅骨針(silica spicules)或纖維素。在一個方面，這種工藝的丁醇產(chǎn)量是可發(fā)酵碳水化合物的約35%-40% (w/w), 包括每個循環(huán)約20g/L的丁醇產(chǎn)量。在另一方面，該工藝產(chǎn)生頂空氣體混合物，其包含約 40-50% H2、約40-50% CO2和0-20% N20在相關(guān)方面，頂空氣體包含43% H2,43% CO2和
14% N2。在另一個實施方案中，公開了一種組合物，其包括產(chǎn)酸相和產(chǎn)溶劑相梭狀芽孢桿菌屬細(xì)胞的混合種群和包含生物碳酸鈣源的緩沖劑。在一個方面，生物碳酸鈣源包括海螵蛸碎片和牡蠣殼碎片。在另一方面，緩沖劑為無機(jī)碳酸鈣源。在另一方面，該組合物還包括纖維素生物質(zhì)，包括莖、葉、糠、木屑、鋸末、枯樹、樹枝、家居垃圾、紙制品、造紙黑液、草或它們的組合。
在一個方面，細(xì)胞為梭狀芽孢桿菌腫beijerinkii).在相關(guān)方面，梭狀芽孢桿菌知的編號是NRRL B-50244。在另一方面，梭狀芽孢桿菌beijerinkii插入于固相中，所述固相包括天然海綿、纖維海綿、海藻酸鈣微珠和聚丙烯酰胺片(sheet)。在一個實施方案中，公開了梭狀芽孢桿菌知NRRL B-50244的生物純培養(yǎng)物。在一個方面，該培養(yǎng)物可在PH6.0下繼續(xù)生產(chǎn)丁醇。在另一方面，該培養(yǎng)物包埋于固相中。在相關(guān)方面，固相包括天然海綿、纖維海綿、絲瓜海綿、海藻酸鈣微珠、軟體動物殼的碎片、墨魚骨碎片和聚丙烯酰胺片。



圖1顯示了可用于連續(xù)單反應(yīng)釜生產(chǎn)丁醇的設(shè)備的示意圖2顯示了由C. beijerinkii NRRL B-50244培養(yǎng)物生產(chǎn)的丁醇的色譜； 圖3圖解說明了觀察到的自由和包埋細(xì)胞的丁醇合成時間過程。實心正方形代表來自于培養(yǎng)物中自由的C知ij^ri/^ii細(xì)胞的數(shù)據(jù)。實心菱形代表來自包埋于海藻酸鹽微珠中的C. beijerinkii細(xì)胞的數(shù)據(jù)；
圖4圖解說明了 OD6tltlnm處自由和包埋細(xì)胞的細(xì)胞生長速率。數(shù)據(jù)點與圖3中的丁醇數(shù)據(jù)點平行采集。實心正方形代表來自培養(yǎng)物中自由的C知ij^ri/^ii細(xì)胞的數(shù)據(jù)。實心菱形代表來自包埋于海藻酸鹽微珠中的C. beijerinkii細(xì)胞的數(shù)據(jù)；
圖5 (A)- (C)顯示了一系列表明真空蒸餾后丁醇重新開始合成的色譜。(A)顯示了蒸餾前的丁醇濃度。(B)顯示了蒸餾后的丁醇濃度。(C)顯示了再培育(re-incubation)后的丁醇濃度。各峰可鍵入(keyed to)圖2中。所有％值為vol/vol ； 圖6顯示了圖1所示設(shè)備的自動化實施方案的示意圖。
具體實施例方式在描述本發(fā)明的組合物、方法和方法論之前，應(yīng)該理解，本發(fā)明不限于所描述的特定組合物、方法和實驗條件，因為這類組合物、方法和條件可以有所不同。也應(yīng)該理解，本文所使用的術(shù)語僅出于描述特定實施方案的目的，并不意圖限制，因為本發(fā)明的范圍將僅在所附權(quán)利要求中被限制。如本說明書和所附權(quán)利要求所用，單數(shù)形式的“一”、“一個”以及“該”包括引用復(fù)數(shù)形式，除非上下文另有清晰的指示。因此，例如引用“一細(xì)胞”包括一個或多個細(xì)胞，和/ 或本文所描述類型的組合物，該種類型的組合物在本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀本公開內(nèi)容之后將變得顯而易見，依此類推。除非另有定義，否則，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常的理解相同的含義。任何與本文描述相似或等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實施和測試，因?qū)⒗斫猓鞣N改進(jìn)和變型包括在本公開內(nèi)容的精神和范圍內(nèi)。如本文所用，“產(chǎn)酸相和產(chǎn)溶劑相細(xì)胞的混合種群”是指組合數(shù)量的梭狀芽孢桿菌細(xì)胞，其包括主要為丁酸和乙酸產(chǎn)生細(xì)胞的亞群和主要為丙酮/ 丁醇/乙醇(ABE)產(chǎn)生細(xì) Ifi白勺L。 Iiftt^llf舌 C beijerinkii ^C. acetobutylicum>C. auran tibutyricum>C. tetranomorphum, C. thermocellum和類似的細(xì)菌，所述細(xì)菌將碳水化合物、丁酸和其它酸轉(zhuǎn)化成溶劑如丁醇、丙酮、乙醇或異丙醇。在某些方面，亞群來自單菌株或多菌株。在另一方面，在本發(fā)明公開的工藝中可使用的細(xì)胞可以是天然存在的或人造的(即，從重組操作獲得的)。

如本文所用，“生物碳酸鈣源”是指碳酸鈣的供應(yīng)來自動物的殼或骨架材料(或其碎片)。例如，屬于軟體動物門(phylum Mollusca)的動物的殼是生物碳酸鈣源。如本文所用，“纖維素生物質(zhì)”是指具有少量蛋白質(zhì)、脂質(zhì)(脂肪、蠟和油)和灰分， 由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成的材料。這類生物質(zhì)包含可同化的碳水化合物(即，碳水化合物基質(zhì))。可同化的碳水化合物的實例包括但不限于糖如葡萄糖、乳糖、乳清滲透物、戊糖、淀粉、液化淀粉、經(jīng)酶處理的液化淀粉、麥芽糊精和玉米漿。在一個方面，可分析這類可同化碳水化合物的右旋糖當(dāng)量(dextrose equivalents)(例如，用糖化酶和α -淀粉酶處理生物質(zhì)后使用YSI分析儀，見，例如美國專利5，192，673，或用二硝基水楊酸處理生物質(zhì)后使用YSI分析儀，見，例如Tasun等人在((Biotech Bio-eng》1970年第12卷第991-992 頁發(fā)表的文章)。如本文所用，“固相”是指以抵抗變形和體積變化為特點的物質(zhì)狀態(tài)。在一個方面， 固相可為多孔或無孔。在相關(guān)方面，選定的細(xì)菌可在多孔固相上形成菌落，其中菌落化的固相用作新培養(yǎng)物的移植。例如，固相可以是3維分子骨架，其中這樣的骨架為細(xì)胞生長提供較大的表面積(如海綿)。在相關(guān)方面，“包埋”是指細(xì)胞插入固相空隙內(nèi)。如本文所用，“清洗流體”是指用于洗出其它液體或氣體的液體或氣體。例如，CO2 和N2氣體為清洗流體。生物產(chǎn)生的1-丁醇可以用本領(lǐng)域公知的方法從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離。例如，可通過離心、過濾、傾析或類似的方法從發(fā)酵培養(yǎng)基中除去固形物。然后，使用方法如蒸餾、液-液萃取或以膜為基礎(chǔ)的分離來從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離1- 丁醇。由于1- 丁醇與水形成低沸點共沸混合物，因此蒸餾只能用來將混合物分離至其共沸組成(azeotropic composition)。 蒸餾通常與另一分離方法結(jié)合以圍繞共沸物獲得分離。可與蒸餾結(jié)合使用以分離和純化 1- 丁醇的方法包括但不限于傾析、液_液萃取、吸附和以膜為基礎(chǔ)的技術(shù)。1- 丁醇-水混合物形成了非均相共沸物，使得蒸餾可與傾析結(jié)合用來分離并純化 1-丁醇。在一種方法中，將含1-丁醇的發(fā)酵液蒸餾至接近共沸組成。然后，使共沸混合物凝結(jié)，并通過傾析從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離1-丁醇。傾出的含水相可回到第一精餾塔作為回流。傾出的富含1-丁醇的有機(jī)相可在第二精餾塔中通過蒸餾進(jìn)一步純化。也可用液-液萃取與蒸餾結(jié)合來從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離1-丁醇。在這種方法中，使用合適的溶劑來液-液萃取發(fā)酵液中的1-丁醇。然后蒸餾含1-丁醇的有機(jī)相以從溶劑中分離1-丁醇。也可用蒸餾與吸附結(jié)合來從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離1-丁醇。在這種方法中，蒸餾含有 1-丁醇的發(fā)酵液至接近共沸組成，然后通過使用吸附劑如分子篩除去剩余的水(國家可再生能源實驗室2002年6月出版的Aden等人的報告NREL/TP-510-32438，稀酸預(yù)水解和酶水解聯(lián)用對玉米秸稈從木質(zhì)纖維素生物質(zhì)至乙醇的工藝設(shè)計和經(jīng)濟(jì))。此外，蒸餾與滲透蒸發(fā)的結(jié)合已被用于從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離和純化1-丁醇。在該方法中，蒸餾含有ι-丁醇的發(fā)酵液至接近共沸組成，然后用親水膜通過滲透蒸發(fā)除去剩余的水(Guo等人在《J. Membr. Sci.》2004年第245卷第199-210頁發(fā)表的文章)。
在所有這 些蒸餾方法中，由于通常用來蒸餾丁醇-水共沸物的溫度(例如，約 93°C)會不可逆地?fù)p害營養(yǎng)態(tài)(vegetative state)的細(xì)胞，因此必須將發(fā)酵生物體從待蒸餾發(fā)酵液中分離出來。因此，與本發(fā)明方法相比，上面所述蒸餾工藝不能應(yīng)用在與活性培養(yǎng)物相同的反應(yīng)釜中而不破壞細(xì)胞。已應(yīng)用各種工藝從生產(chǎn)性培養(yǎng)物中原位除去丁醇。研究的技術(shù)包括吸收、滲透蒸發(fā)、反滲透、液_液萃取和氣提。上述方所有法都顯著地增加生產(chǎn)費用，并且沒有一個是最佳的。對丁醇顯示出高度選擇性的以膜為基礎(chǔ)的系統(tǒng)被C acetobutylicum琳C. beijerinkii沾污和堵塞。氣提法對希望從中除去揮發(fā)性組分的模型溶液運作良好 (見，例如美國專利申請20050089979)，但是，當(dāng)例如使培養(yǎng)物保持平靜地用于生產(chǎn)丁醇時，是禁止惰性氣體通過待清洗溶液產(chǎn)生強(qiáng)烈泡沫的。在本發(fā)明中，公開了一種丁醇生產(chǎn)工藝，包括在第一單獨反應(yīng)釜中使梭狀芽胞桿菌細(xì)胞的單培養(yǎng)物和緩沖劑與含碳水化合物的基質(zhì)相接觸，在最佳溫度下培養(yǎng)細(xì)胞直至達(dá)到丁醇抑制濃度，并降低同一單獨反應(yīng)釜中的壓力直到出現(xiàn)強(qiáng)烈沸騰，將包含丁醇的共沸物從第一反應(yīng)釜轉(zhuǎn)移到第二收集反應(yīng)釜中作為冷凝物，用清洗流體沖洗第一反應(yīng)釜作為冷凝收集體積的功能，其中當(dāng)收集的冷凝物體積為發(fā)酵體積的約4-5%時開始沖洗，并不斷重復(fù)上述步驟。因而，所得丁醇-水共沸物的蒸餾在與活性培養(yǎng)物相同的反應(yīng)釜內(nèi)進(jìn)行。此夕卜，蒸餾后，同樣的培養(yǎng)物可以用來重新開始生產(chǎn)丁醇。在一個方面，該工藝中消耗的每克葡萄糖或其它糖類(包括但不限于乳糖)產(chǎn)生至少0.4克丁醇。在另一方面，該工藝由可發(fā)酵碳水化合物可達(dá)到約80% -90%的最大丁醇產(chǎn)量。在另一相關(guān)方面，該工藝的丁醇產(chǎn)量為約20-40g/L。在另一方面，梭狀芽胞桿菌細(xì)胞為C beijerinkii、C. acetobutylicum, C auran tibu tyricum > C. thermocellum 或 C. tetranomorphum 0 在才目關(guān)方面，細(xì)胞為 C beijerinkii NRRL B-50244。一般來說，發(fā)酵進(jìn)行至少約36h，然而，發(fā)酵可進(jìn)行140h或以上。對于本發(fā)明，在對數(shù)后期至穩(wěn)定期維持細(xì)胞濃度用于連續(xù)生產(chǎn)溶劑，需要時，更換用盡的培養(yǎng)基和細(xì)胞。根據(jù)所使用的梭狀芽孢桿菌菌株，細(xì)胞可被攪動或保持靜止。例如，當(dāng)使用C beijerinkii騎, 培養(yǎng)物將保持靜止以用于生產(chǎn)丁醇。對于本發(fā)明，原料可以是簡單的糖如葡萄糖、乳糖(例如，在乳清滲透物中所含有的)、戊糖；復(fù)合糖類如淀粉、液化淀粉、經(jīng)酶處理的液化淀粉、麥芽糊精和玉米漿；或可包括纖維素生物質(zhì)。這類原料作為水溶液和/或懸浮液加入。在一個方面，當(dāng)從包含纖維素生物質(zhì)的原料獲得基質(zhì)溶液時，發(fā)酵前可將這類生物質(zhì)碾磨或微粒化。碾磨減少了含碳水化合物原料組分的大小，從而使生物質(zhì)較易被選定的細(xì)菌分解。可采用滅菌來殺死底菌 (background bacteria)，使所選細(xì)菌蓬勃生長。通常情況下，將碳水化合物/糖類與水混合，然后像許多發(fā)酵系統(tǒng)常見的那樣進(jìn)行滅菌(見，例如美國專利5，753，474)。再次，可分析組成原料/糖類的碳水化合物的右旋糖當(dāng)量(例如，在用糖化酶和α-淀粉酶處理生物質(zhì)后用YSI分析儀分析(見，例如美國專利5，192，673)或通過二硝基水楊酸處理生物質(zhì)后用 YSI分析儀分析(見，例如Tasun等人在((Biotech Bio-eng》1970年第12卷第991-992頁發(fā)表的文章))。除了包含碳水化合物的基質(zhì)，細(xì)胞還與營養(yǎng)培養(yǎng)基接觸。有用的營養(yǎng)培養(yǎng)基包括本領(lǐng)域公知的那些營養(yǎng)培養(yǎng)基，如P2和蛋白胨葡萄糖酵母提取物(TGY)。也可以使用其它營養(yǎng)培養(yǎng)基。營養(yǎng)培養(yǎng)基可任選包含添加劑例如鹽和/或微量元素。在一方面，培養(yǎng)基為乳糖產(chǎn)孢培養(yǎng)基(LSM)，如表1定義。
權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)丁醇的連續(xù)工藝，其包括(a)在第一反應(yīng)釜中使梭狀芽胞桿菌細(xì)胞的液體培養(yǎng)物和緩沖劑與包含碳水化合物的基質(zhì)相接觸；(b)在溶劑生產(chǎn)的最佳溫度下培養(yǎng)細(xì)胞直到達(dá)到丁醇抑制濃度；(c)降低第一反應(yīng)釜中的壓力直到出現(xiàn)強(qiáng)烈沸騰；(d)將包含丁醇的共沸物從第一反應(yīng)釜轉(zhuǎn)移到第二收集反應(yīng)釜中作為冷凝物；(e)用清洗流體沖洗第一反應(yīng)釜；以及(f)不斷重復(fù)步驟(b)_(e)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其中沖洗為冷凝收集體積的功能，以及其中所述沖洗在冷凝收集體積為培養(yǎng)物體積的4% -5%時開始。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，還包括當(dāng)溶劑產(chǎn)量為基質(zhì)中可同化碳水化合物的約 35%-40% (wt/wt)時，補(bǔ)充含有碳水化合物的基質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其中培養(yǎng)物包括產(chǎn)酸和產(chǎn)溶劑相細(xì)胞的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其中梭狀芽胞桿菌細(xì)胞選自beijerinkii,C. acetobutylicum、C. aurantibutyricum> C. tetranomorphum 私 C. thermoceIlum0
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其中壓力從約760mmHg下降至約20mm Hg-30mm Hg。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其中丁醇的抑制濃度為約0.9% -2. 0%。
8.一種用于生產(chǎn)丁醇的工藝，其包括(a)在第一反應(yīng)釜中使梭狀芽胞桿菌細(xì)胞的液體培養(yǎng)物和緩沖劑與包含碳水化合物的基質(zhì)相接觸；(b)在最佳溫度下培養(yǎng)細(xì)胞直至達(dá)到丁醇抑制濃度；(c)將培養(yǎng)物的溫度升高到溶劑生產(chǎn)最佳溫度上約6°C_11°C并降低第一反應(yīng)釜中的壓力直到開始強(qiáng)烈沸騰；(d)將包含丁醇的共沸物從第一反應(yīng)釜轉(zhuǎn)移到第二收集反應(yīng)釜中作為冷凝物；(e)用清洗流體沖洗第一反應(yīng)釜并將培養(yǎng)物的溫度冷卻至最佳溫度；以及(f)不斷重復(fù)步驟(b)_(e)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的工藝，其中最佳溫度為約33°C_37°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的工藝，其中步驟(c)中溫度升高到約43°C_44°C。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的工藝，其中沖洗和冷卻為冷凝收集體積的功能，其中當(dāng)冷凝收集體積為培養(yǎng)物體積的約4% -5%時，沖洗和冷卻開始。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的工藝，其中壓力從約760mmHg下降至約IlOmm Hg-IOOmmHg。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的工藝，其中抑制濃度為約0.9% -2. 0%。
14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的過程，還包括當(dāng)溶劑產(chǎn)量為基質(zhì)中可同化碳水化合物的約 35% -40% (wt/wt)時，補(bǔ)充含有碳水化合物的基質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求8所述的工藝，其中緩沖劑包括生物碳酸鈣源。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的工藝，其中生物源為海螵蛸或牡蠣殼。
17.根據(jù)權(quán)利要求8所述的工藝，還包括使細(xì)胞與海綿碎片相接觸。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的工藝，其中海綿包含碳酸鈣、二氧化硅骨針或纖維素。
19.根據(jù)權(quán)利要求8所述的工藝，其中該工藝由可發(fā)酵碳水化合物達(dá)到約80%-90%之間的丁醇產(chǎn)量。
20.根據(jù)權(quán)利要求8所述的工藝，其中該工藝的丁醇產(chǎn)量為約20-40g/L。
21.根據(jù)權(quán)利要求8所述的工藝，其中該工藝產(chǎn)生頂空氣體混合物，其包含約40-50% H2,40-50% CO2 和 0-20% N2。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的工藝，其中該工藝產(chǎn)生頂空氣體混合物，其包含約43%H2、 43% CO2 和 14% N2。
23.一種組合物，其包含產(chǎn)酸相和產(chǎn)溶劑相梭狀芽孢桿菌細(xì)胞的混合種群以及含有生物碳酸鈣源的緩沖劑。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其中生物碳酸鈣源為海螵蛸碎片或牡蠣殼碎片。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的組合物，其中細(xì)胞為梭狀芽孢桿菌beijerinkii。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中Cbeijerinkii為WRL B-50244。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物，其中梭狀芽孢桿菌知ij'ari/^ii包埋于固相中，所述固相選自天然海綿、纖維海綿、絲瓜海綿、海藻酸鈣微珠和聚丙烯酰胺片。
28.一種梭狀芽孢桿菌力eiJeri/^ii NRRL B-50244的生物純培養(yǎng)物。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的生物純培養(yǎng)物，其中該培養(yǎng)物包埋于固相中，所述固相選自天然海綿、纖維海綿、海藻酸鈣微珠和聚丙烯酰胺片。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用梭狀芽孢桿菌產(chǎn)酸相細(xì)胞和產(chǎn)溶劑相細(xì)胞的混合種群在單個反應(yīng)釜中通過碳水化合物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法。所描述的本發(fā)明系統(tǒng)不需要間歇性調(diào)整pH或排出頂空氣體。該方法提供了一種用于除去不可逆損害細(xì)胞的丁醇產(chǎn)物的工藝，并且描述了這類細(xì)胞可在相同的單個反應(yīng)釜中重新開始合成丁醇的條件。如所公開的，本發(fā)明還描述了包含梭狀芽孢桿菌細(xì)胞的組合物和生物純培養(yǎng)物。
文檔編號C12R1/145GK102439161SQ200980158890
公開日2012年5月2日 申請日期2009年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月23日
發(fā)明者尤金·T·巴特勒三世 申請人:尤金·T·巴特勒三世