專利名稱：白假絲酵母(甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體)菌毛株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新穎的微生物菌株。具體而言，本發(fā)明涉及一種白假絲酵母甘露 糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株。本發(fā)明也涉及該白假絲酵母菌毛株的培養(yǎng)、處理、用途和使用方 法。本發(fā)明還涉及利用該白假絲酵母菌毛株制備的醫(yī)療用產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
白假絲酵母(Candida albicans)，又稱白念珠菌或者白色念珠菌，是單細(xì)胞真菌。 圓形或卵圓形，革蘭氏染色陽性。以出芽繁殖，稱芽生孢子。孢子伸長成芽管，不與母體脫 離，形成較長的假菌絲。白假絲酵母是屬于半知菌綱(Fungi Imperficti)的球殼目(Xylariaceae)假絲 酵母屬(Candida)的單細(xì)胞酵母。白假絲酵母在普通的瓊脂、血瓊脂與沙保培養(yǎng)基上均生長良好，菌落呈類酵母型。 在玉米粉培養(yǎng)基上可長出厚膜孢子。白假絲酵母的假菌絲和厚膜孢子有助于鑒定。白假絲酵母屬條件致病菌，通常存在于人體表與腔道中，當(dāng)正常菌群失調(diào)或抵抗 力降低時(shí)，白假絲酵母則可侵犯人體許多部位，如皮膚、粘膜、肺、腸、腎和腦，引起皮膚粘膜 感染(常見鵝口瘡、外陰炎及陰道炎)、內(nèi)臟感染和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等，粘膜感染以鵝口 瘡最多。白假絲酵母的微生物學(xué)檢查(1)直接鏡檢膿、痰、離心沉淀后的脊液可直接涂片，革蘭氏染色后鏡檢?；继幤?屑或甲屑用10% KOH消化后鏡檢?？梢姼锾m氏陽性、圓形或卵圓形的菌體及芽生孢子，同時(shí) 可觀察到假菌絲。(2)分離培養(yǎng)與鑒定將檢材接種于沙保弱瓊脂培養(yǎng)基，25°C孵育3 4天后，在 培養(yǎng)基表面形成乳白色類酵母菌落，鏡檢可見假菌絲及成群的卵圓形芽生孢子。在臨床標(biāo)本中如有大量菌絲，提示白假絲酵母為致病狀態(tài)，對診斷具有重要意義?，F(xiàn)有技術(shù)中記載的白假絲酵母是條件致病菌，不具有醫(yī)療應(yīng)用價(jià)值；目前尚沒有 將白假絲酵母用于制備疫苗的報(bào)道。關(guān)于細(xì)菌菌毛的基礎(chǔ)研究較多，但是關(guān)于白假絲酵母的菌毛研究較少。細(xì)菌菌毛是菌體表面極其纖細(xì)的蛋白微絲，須用電鏡觀察。特點(diǎn)是細(xì)、短、 直、硬、多，一般認(rèn)為菌毛與細(xì)菌運(yùn)動(dòng)無關(guān)，根據(jù)形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能可分為普通菌毛和 性菌毛兩類。前者與細(xì)菌粘附和侵染宿主有關(guān)，后者為中空管子，與傳遞遺傳物質(zhì)有 關(guān)。在 Sharon N, Eshdat Y, SilverblattF J, Ofek I, Bacterial adherence to cell surface sugars, ciba Found Symp. 1981 ；80 :119 141 中，說明 了大腸桿菌和沙門氏 菌的菌毛中存在與宿主細(xì)胞發(fā)生粘附的物質(zhì)，并且該粘附會受到糖，例如D-甘露糖的抑 制；而且糖蛋白介導(dǎo)的粘附是普遍的廣泛的。在Wim Gaastra and Frist K. de Graaf, Host-Specific Fimbrial Adhesions of Noninvasive EnterotoxigenicEscherichia coli Strains, Microbiological Reviews, June 1982, Vol. 46, No. 2, P. 129 161 巾if論了大腸桿菌的多種菌毛的性質(zhì)也討論了甘露糖敏感血細(xì)胞凝集(Marmose-sensitive hemagglutination，甘露糖敏感血凝)和甘露糖抗性血細(xì)胞凝集(MRHA)以及非血細(xì)胞凝集 (Non-HA) ο 在 Speert DP, Lon ΒΑ, Eftekbar F, Opsonin-independent phagocytosis of Pseudomonasaeruginosa, Antibiot Chemother. 985 ；36 88 94 中，提示了菌毛部分的介 導(dǎo)了人嗜中性粒細(xì)胞對假單胞菌的吞噬作用。關(guān)于菌毛的綜合性論述，參見，牟希亞，細(xì)菌 菌毛及有關(guān)粘附素研究的新進(jìn)展，微生物學(xué)雜志，第4卷，第3期，1984年11月，第14頁到 第17頁。上述公開出版物提示具有甘露糖敏感血細(xì)胞凝集(甘露糖敏感血凝)性質(zhì)的菌 毛可能存在于多種屬細(xì)菌上，比如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的最常見的菌毛是I型 普通菌毛(即甘露糖敏感血凝菌毛)。為了預(yù)防和/或治療與白假絲酵母菌感染及其他真菌或細(xì)菌感染等有關(guān)的疾病， 需要尋找和提供具有廣譜的、高免疫原性的、低毒性的物質(zhì)。本發(fā)明通過篩選從臨床上獲得 的白假絲酵母菌株，獲得了一種甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株，并發(fā)現(xiàn)用這種白假絲酵母甘 露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株制備的裂解疫苗具有刺激機(jī)體免疫作用的用途。所以，本發(fā)明提 供了具有使用價(jià)值的白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株，可以用于生產(chǎn)疫苗，這種疫 苗也可以對一些細(xì)菌提供保護(hù)作用，具有跨真菌和細(xì)菌的保護(hù)作用。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明概述第一方面，本發(fā)明提供了一種白假絲酵母菌毛株，命名為白假絲酵母(甘露糖 蛋白質(zhì)復(fù)合體)菌毛株，拉丁名為”Candida albicans (Mannose-protein complex) pilus strain”。在分類學(xué)上，該菌株屬于白假絲酵母的一種新型菌株。該菌株已經(jīng)于2010年01月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心(CGMCC)，地址中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物 所。CGMCC是布達(dá)佩斯條約承認(rèn)的生物材料樣品國際保藏單位。該菌株的編號是CGMCC No. 3604，分類命名是白假絲酵母(Candida albicans)。本發(fā)明的白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株的特征在于下列的一個(gè)或多 個(gè)a.在菌體周圍有許多纖細(xì)而剛直的菌毛狀的甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體，b.甘露糖敏感血凝試驗(yàn)呈現(xiàn)強(qiáng)陽性，c.平板菌落粘附紅細(xì)胞試驗(yàn)強(qiáng)陽性。第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株的死菌體，菌 體裂解成分，菌體制備物，提取物，分離自菌體的物質(zhì)，其各自可以作為疫苗或免疫調(diào)節(jié)劑 或其他醫(yī)療制品的活性成分。白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株的細(xì)胞包括細(xì)胞壁、 細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器、細(xì)胞核等結(jié)構(gòu)，細(xì)胞外周身的甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體。在一個(gè)實(shí)施方案中，以本發(fā)明的白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株為基礎(chǔ)， 經(jīng)過培養(yǎng)和滅活，得到死菌體。死菌體可以作為動(dòng)物體包括人體的機(jī)體免疫系統(tǒng)刺激物，獲 得有益效果。優(yōu)選的，死菌體可以從培養(yǎng)基或者培養(yǎng)液中純化后使用。也可以在其中加入 其他試劑或者藥劑、佐劑、輔劑等，獲得更好的免疫刺激或調(diào)控效果。在一個(gè)實(shí)施方案中，以本發(fā)明的白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株為基礎(chǔ)，經(jīng)過培養(yǎng)、提取、純化等步驟可以得到上述結(jié)構(gòu)或者上述物質(zhì)中的某一種或者幾種或者任 意組合，用作動(dòng)物體包括人體的機(jī)體刺激物，獲得有益的效果。關(guān)于本發(fā)明的白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株的用途。本發(fā)明的白假絲酵 母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株毒性低，免疫作用強(qiáng)，而且具有廣譜作用的特性。用該菌株制 備的菌苗或者免疫調(diào)節(jié)劑可以全面激活調(diào)控人體的細(xì)胞免疫和體液免疫系統(tǒng)，對多種細(xì)菌 及真菌產(chǎn)生抵抗作用。免疫調(diào)節(jié)活性和抗腫瘤作用均具明顯效果。本發(fā)明的白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株的菌苗特別適合免疫機(jī)體，用于 預(yù)防細(xì)菌感染和/或者真菌感染。尤其是腫瘤晚期病人，都具有真菌感染，以白色念珠菌感染為常見，本發(fā)明的白假 絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株的菌苗或者制品特別適用。


本發(fā)明的白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株的有關(guān)保藏信息如下保藏日期2010年1月22日；保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位簡稱CGMCC ；保藏編號CGMCCNo. 3604。圖1是現(xiàn)有技術(shù)中的白假絲酵母的菌毛株照片，圖中箭頭所指為菌毛。圖2是本發(fā)明提供的白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株電子顯微鏡照片，顯 示所描述的白假絲酵母的形態(tài)特征(周身具有甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體)。圖3用白假絲酵母感染的動(dòng)物的病理特征圖3A.腎臟；圖3B.肝臟；圖3C.心臟。圖4用本發(fā)明的白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株所制造疫苗免疫動(dòng)物的 免疫保護(hù)狀況。其中，圖4A是感染局部部位的比較，圖4B是腎臟比較，圖4C是組織化學(xué)比 較。發(fā)明詳述1.定義和解釋在本申請中，對下述術(shù)語和解釋予以特別說明?！凹?xì)菌”是一類單細(xì)胞原核生物?；蜉d體是由一束雙鏈DNA纖維絲組成的，沒有 任何膜的界限把它和細(xì)胞質(zhì)分開。缺少細(xì)胞器。核蛋白體為70S。本申請中談?wù)摰氖恰罢?細(xì)菌(eubacteria) ”。真細(xì)菌可以劃分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性兩種類型?！罢婢笔且活愓婧松铮哂屑?xì)胞核。“酵母”是一類單細(xì)胞的真菌?！鞍准俳z酵母”是一類條件致病真菌。革蘭氏染色顯示陽性。“革蘭氏染色法”是通過使用結(jié)晶紫溶液和碘液，依據(jù)真細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同， 對細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分的染色方法。該方法也適用于某些真菌，如酵母。“菌毛”是細(xì)菌表面的纖絲附屬結(jié)構(gòu)。菌毛由蛋白質(zhì)構(gòu)成。菌毛區(qū)分為普通菌毛和 性菌毛。白假絲酵母也有菌毛。“普通菌毛”與細(xì)菌體粘附有關(guān)。普通菌毛種類繁多，依據(jù)其在細(xì)菌粘附中的作用 的相對不同，可以分為非專一性粘附菌毛和專一性粘附菌毛。
“非專一性粘附菌毛”是指那些可以使細(xì)菌粘附到多種基質(zhì)上的菌毛，比如多種 真核細(xì)胞上，例如多種動(dòng)物的紅細(xì)胞，白細(xì)胞，上皮細(xì)胞，和其他測試中的動(dòng)物細(xì)胞、植物 細(xì)胞和真菌細(xì)胞。也就是這些菌毛對宿主沒有嚴(yán)格的選擇性，粘附具有廣泛性，例如大 腸桿菌的1型菌毛(typel fimbriae) 0在使用不同動(dòng)物來源的紅細(xì)胞時(shí)，非專一性粘附 表現(xiàn)出相似模式的紅細(xì)胞凝集活性；并且紅細(xì)胞凝集作用(hemagglutination)對甘露 糖敏感(mannose-sensitive)。因此，甘露糖敏感紅細(xì)胞凝集作用(mannose-sensitive hemagglutination，甘露糖敏感血凝)是非專一性粘附菌毛的一個(gè)特征?！皩Ｒ恍哉掣骄笔侵改切┐偈辜?xì)菌粘附到特定基質(zhì)上的菌毛。也就是這些菌毛 對宿主具有嚴(yán)格的選擇性，粘附只能在細(xì)菌和特殊宿主之間發(fā)生，比如大腸桿菌菌毛K88。 紅細(xì)胞凝集作用不表現(xiàn)甘露糖敏感性，即不被甘露糖抑制的血凝?！案事短敲舾醒比Q為“甘露糖敏感紅細(xì)胞凝集作用菌毛”，是指促進(jìn)細(xì)菌 粘附到多種基質(zhì)上的非專一性的粘附菌毛，能夠被甘露糖抑制。在本申請中，甘露糖敏感血 凝菌毛是一個(gè)廣義概念?，F(xiàn)有研究提示，在細(xì)菌，比如銅綠假單胞菌、大腸桿菌、沙門氏菌 等，粘附到宿主細(xì)胞的過程中，糖介導(dǎo)粘附普遍存在。有些是甘露糖敏感，有些是L-巖藻糖 敏感，D-半乳糖敏感的。在此，“甘露糖敏感血凝菌毛”包括甘露糖敏感細(xì)胞凝集作用菌毛， 各種其他糖類調(diào)節(jié)的、與細(xì)菌和宿主的非專一性粘附相關(guān)的菌毛?！案事短堑鞍踪|(zhì)復(fù)合體”是指存在于本發(fā)明的白假絲酵母菌株表面的由甘露糖和 蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合體。2.詳細(xì)描述本發(fā)明的白假絲酵母菌毛株，表現(xiàn)出低毒性，具有周身甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體，是甘 露糖敏感結(jié)構(gòu)。本發(fā)明將該菌株命名為白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株，并于2010 年1月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號是CGMCC No.3604。本發(fā)明提供的白假絲酵母全稱為白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株，它是一 種具有周身菌毛性甘露糖敏感血凝(Mannose SensitiveHemagglutination)菌毛的白假絲 酵母，該菌毛株具有跨菌屬的廣譜免疫原性。如背景技術(shù)部分所述，鑒于白假絲酵母是致病菌，沒有人利用白假絲酵母菌體或 其中的物質(zhì)進(jìn)行疾病預(yù)防和治療。本發(fā)明的發(fā)明人注意到了菌毛在細(xì)菌和宿主作用中的重要性，注意到甘露糖敏感 血凝菌毛在細(xì)菌和宿主作用中的普遍性；力爭發(fā)現(xiàn)一株具有低毒性、廣譜免疫原性的白假 絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株，并利用菌體中的物質(zhì)，特別是甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌 毛進(jìn)行免疫刺激和調(diào)理。本發(fā)明人通過對臨床獲得的多株白假絲酵母的篩選以及在小鼠中的實(shí)驗(yàn)，確定了 這株白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株。該菌株的產(chǎn)品在疾病的預(yù)防和治療上表現(xiàn)出 有益效果，可以刺激免疫系統(tǒng)。白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株獲得之后，一直保持性質(zhì)穩(wěn)定。由白假絲 酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株制備的菌苗也在抗感染、抗腫瘤治療和免疫失調(diào)方面均有 良好效果。本發(fā)明的白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株的主要特征如下
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1.形態(tài)培養(yǎng)特性和生化檢驗(yàn)符合白假絲酵母檢驗(yàn)指標(biāo)。2.菌毛形態(tài)和性質(zhì)(1)圖2是本發(fā)明的菌株的電子顯微鏡照片，可以看到本菌株的菌體具有的周生 菌毛。(2)部分菌毛為甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛。甘露糖敏感血凝和血凝抑制試驗(yàn)，均為 強(qiáng)陽性，參見圖2。其中有關(guān)進(jìn)行甘露糖敏感血凝試驗(yàn)的方法，參見大連醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1985， 7(1) :1-3。(3)圖1是現(xiàn)有技術(shù)的白假絲酵母菌照片，其上有菌毛，但是很短，不具有本發(fā)明 中的甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)特征。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株的來源和鑒定本發(fā)明人通過對從臨床標(biāo)本中分離出的多株白假絲酵母菌株，參考(牟希亞，綠 膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的建立，微生物學(xué)報(bào)，26 (2) 176-179，1986)中的方法，進(jìn)行 篩選和選育，獲得一株白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株。主要鑒定特征如下(1)直接鏡檢革蘭氏陽性、卵圓形的菌體、芽生孢子、可觀察到假菌絲。(2)分離培養(yǎng)與鑒定將檢材接種于沙保弱瓊脂培養(yǎng)基，25°C孵育3 4天后，在 培養(yǎng)基表面形成乳白色類酵母菌落，鏡檢可見假菌絲及成群的卵圓形芽生孢子。對本菌毛株進(jìn)行了電子顯微照相，如圖2所示，顯示有周生甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體。 甘露糖敏感血凝和血凝抑制試驗(yàn)，均為強(qiáng)陽性。其中甘露糖敏感血凝和血凝抑制試驗(yàn)的 方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知并熟練掌握以及容易判斷，參見例如大連醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 1985,7(1) :1-3。實(shí)施例2.菌苗制備將本發(fā)明的白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株在沙氏固體培養(yǎng)基上于37°C 培養(yǎng)24小時(shí)，收集培養(yǎng)物，并以甲醛溶液殺菌，反復(fù)洗滌制成死菌苗，稀釋用無菌生理鹽 水，加入苯甲醇作為防腐劑，制備菌苗。實(shí)施例3.菌苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)第一部分模型動(dòng)物的病理研究家兔10只，體重2 3公斤，雄性。經(jīng)兔耳皮下注射5X 107ml的白色念珠菌，攻 擊家兔，觀察感染后家兔的內(nèi)臟器官變化。獲得了腎臟、肝臟和心臟的照片，提供在圖3中， 分別是圖3A.腎臟；圖3B.肝臟；圖3C.心臟。結(jié)果顯示腎臟有大量膿腫灶，同時(shí)肝臟和心臟發(fā)現(xiàn)肉眼可見的病灶(白點(diǎn)為膿 腫)。說明白假絲酵母感染劑量增加時(shí)，會造成感染動(dòng)物的多個(gè)臟器的病變。第二部分免疫研究本實(shí)驗(yàn)研究了本發(fā)明的白假絲酵母菌苗阻斷釀酒酵母菌感染、白假絲酵母感染的 效果。1.材料與方法1. 1 材料
1. 1. 1實(shí)驗(yàn)菌種釀酒酵母菌、白假絲酵母菌。1. 1. 2培養(yǎng)基沙氏培養(yǎng)基1.1. 3 動(dòng)物家兔10只，體重2 3公斤，雄性；小鼠20只，體重20 25克，雄性。1. 1.4主要試劑40%福爾馬林溶液，無菌生理鹽水，Hank’ s液，混合了臺盼藍(lán)的可溶性淀粉肉湯， Giemsa染液等。1. 1. 5主要儀器及器材(1) BH-2型攝影生物顯微鏡0LYMPUS ；(2)D4-2A離心機(jī)北京醫(yī)用離心機(jī)廠；(3)尼康數(shù)碼相機(jī)尼康中國有限公司；(4)吸液器(100 μ 1)上海醫(yī)械專機(jī)廠。1. 2 方法1. 2. 1白假絲酵母菌懸液的制備白假絲酵母菌接種至新鮮的沙氏固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h，收集菌細(xì)胞，用生理 鹽水反復(fù)洗滌3次，用血細(xì)胞記數(shù)板調(diào)整其濃度至5. OX 106/L。1. 2. 2釀酒酵母菌菌懸液的制備釀酒酵母菌接種至新鮮的沙氏固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h，收集菌細(xì)胞，用生理鹽 水反復(fù)洗滌3次，用血細(xì)胞記數(shù)板調(diào)整其濃度至5. OX 106/L。1. 2. 3家兔分組攻擊實(shí)驗(yàn)(1)免疫組(5只家兔)用Iml本發(fā)明的白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌株死 菌苗經(jīng)家兔腹腔注射，免疫家兔。每兩天免疫一次，共免疫3次。距最后一次免疫2天后， 兔耳緣靜脈抽血測抗體效價(jià)；后用Iml白色念珠菌經(jīng)家兔耳皮下注射，攻擊家兔，觀察感染 后家兔狀況。(2)對照組(5只家兔)直接用Iml白假絲酵母菌經(jīng)兔耳皮下注射，攻擊家兔，觀 察感染后家兔狀況。(3)取兔腎臟，觀察二組腎臟的狀態(tài)，并固定于福爾馬林溶液中以做HE染色光鏡 下病理觀察。1. 2. 4家兔抗體效價(jià)的測定采用試管凝集法測定抗白假絲酵母抗體效價(jià)。1. 2. 5小白鼠巨噬細(xì)胞功能測定一體內(nèi)吞噬法測定小白鼠對白假絲酵母的吞噬百 分率和吞噬指數(shù)。1.2. 6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理對實(shí)驗(yàn)結(jié)果用X士 S表示，吞噬百分率使用四格表資料的X2檢驗(yàn)，吞噬指數(shù)使用近 似t檢驗(yàn)與對照組比較，P <0.01者為有顯著性差異。2.結(jié)果2. 1白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌苗免疫對白假絲酵母感染的影響2. 1.1動(dòng)物一般狀況對照組受到白假絲酵母攻擊后表現(xiàn)為顫栗、局部及全身體溫增高，全身體溫達(dá)到 40-42 V，兔耳有膿腫，經(jīng)過三次攻擊后，兔耳有明顯膿腫，精神萎靡，食欲下降，直至死亡。
免疫組受到白假絲酵母攻擊后表現(xiàn)為局部及全身體溫正常或略高，兔耳有輕微 膿腫，經(jīng)過三次攻擊后，兔耳膿腫輕微，精神良好，食欲基本正常。2. 1. 2注射區(qū)局部感染狀況圖4A是注射區(qū)局部感染狀況。家兔注射區(qū)局部比較白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù) 合體菌苗免疫組紅腫范圍明顯小于對照組。2. 1. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)兩組腎臟比較實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)兩組腎臟比較左側(cè)白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌苗免疫組比右 側(cè)對照組腎臟充血程度、腫脹程度明顯輕，同時(shí)，對照組腎臟出現(xiàn)肉眼可見的膿腫灶。圖4B是實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)兩組腎臟比較，表明左側(cè)免疫組比右側(cè)對照組腎臟充血程 度、腫脹程度明顯輕，同時(shí)，對照組腎臟出現(xiàn)肉眼可見的膿腫灶。2. 1. 4兩組動(dòng)物腎臟的HE染色光鏡下病理觀察病理切片顯示白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌苗免疫組感染僅累及腎小球， 腎小球體積增大，細(xì)胞數(shù)增多，炎性細(xì)胞浸潤；對照組病變除累及腎小球外，還波及腎間質(zhì)、 腎小管。腎小球、腎間質(zhì)、腎小管均可見炎性細(xì)胞浸潤。圖4C是兩組動(dòng)物腎臟的HE染色光鏡下病理觀察，病理切片顯示免疫組感染僅累 及腎小球，腎小球體積增大，細(xì)胞數(shù)增多，炎性細(xì)胞浸潤；對照組病變除累及腎小球外，還波 及腎間質(zhì)、腎小管。腎小球、腎間質(zhì)、腎小管均可見炎性細(xì)胞浸潤(200倍放大)。用釀酒酵母作為攻擊菌，獲得了類似結(jié)果。2. 2白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌苗免疫對家兔抗體效價(jià)的影響表1免疫組及空白對照組抗體效價(jià)

結(jié)果顯示免疫組家兔的抗體效價(jià)明顯高于對照組。2. 3白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌苗免疫后對小白鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能 的影響根據(jù)公式 計(jì)算小白鼠的吞噬百分率和吞噬指數(shù)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后如表2所示表2實(shí)驗(yàn)組與對照組吞噬百分率與吞噬指數(shù)比較動(dòng)物分組小鼠數(shù)目吞噬百分率(％) 吞噬指數(shù)對照組 0Κ 61.8 + 3.261.220 + 0.551 免疫組 10 只 78.4±5.38女 3.932±1.079女★為(P <0.01)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算后，可見免疫組和對照組的結(jié)果有明顯差異，免疫組的吞噬百分率 和吞噬指數(shù)明顯高于對照組。正如對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的，可以做出本發(fā)明的許多修改和變化而不 背離其精神和范圍。本文中所描述的具體實(shí)施方案僅以例子的方式給出，并且僅以所附權(quán) 利要求連同這些權(quán)利要求被授予的等效物的整個(gè)范圍限制本發(fā)明。
權(quán)利要求
一種白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株，保藏號為CGMCC No.3604。
2.如權(quán)利要求1所述的白假絲酵母菌毛株，其特征在于具有周身的甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體。
3.如權(quán)利要求1或2所述的白假絲酵母菌毛株的死菌體、菌體制備物或菌體提取物。
4.用如權(quán)利要求1或2所述的白假絲酵母菌毛株或其死菌體、菌體制備物或菌體提取 物所制備的制品。
5.一種組合物，包括有如權(quán)利要求1或2所述的白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛 株的成分或者死菌體。
6.一種疫苗或免疫調(diào)節(jié)劑，包括有如權(quán)利要求1或2所述的白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì) 復(fù)合體菌毛株的成分或者死菌體，所述成分或者死菌體是所述疫苗或免疫調(diào)節(jié)劑的活性成 分。
7.一種疫苗制備方法，所述方法包括培養(yǎng)如權(quán)利要求1或2所述的白假絲酵母菌毛 株，將菌體制成疫苗。
8.如權(quán)利要求1或2所述的白假絲酵母菌毛株或其死菌體、菌體制備物或菌體提取物 在制備用于激活調(diào)控人體的細(xì)胞免疫和體液免疫系統(tǒng)的藥物中的用途。
9.如權(quán)利要求1或2所述的白假絲酵母菌毛株或其死菌體、菌體制備物或菌體提取物 在制備用于預(yù)防和/或治療真菌感染和/或細(xì)菌感染的藥物中的用途。
10.如權(quán)利要求1或2所述的白假絲酵母菌毛株或其死菌體、菌體制備物或菌體提取物 在制備用于抗腫瘤的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株。本發(fā)明也涉及該白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株的培養(yǎng)、處理、用途和使用方法。本發(fā)明還涉及利用該白假絲酵母甘露糖蛋白質(zhì)復(fù)合體菌毛株制備的醫(yī)療產(chǎn)品。
文檔編號C12N1/16GK101914458SQ201010108660
公開日2010年12月15日 申請日期2010年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月9日
發(fā)明者朱潔, 牟希亞, 牟心赤, 郭雁群 申請人:北京萬特爾生物制藥有限公司