專利名稱：：一種耐熱β-1,3-1,4-葡聚糖酶及其編碼基因的制作方法
技術領域：
：本發明涉及P-l，3-l，4-葡聚糖酶及其編碼基因與高效表達。
背景技術：
：葡聚糖是由葡萄糖通過不同糖苷鍵連接起來的一類聚合物，是自然界中含量最豐富的聚糖。P-l，3-l，4-D-葡聚糖是自然合成的多聚糖，與阿拉伯木聚糖、戊聚糖、纖維素、果膠等均屬植物細胞壁中的可溶性結構性非淀粉多糖。大部分谷物都含P-l，3-l，4-D-葡聚糖，其中大麥中的含量最高為5_8%，主要存在于大麥乳細胞壁中。P-l，3-l，4-D-葡聚糖是由葡萄糖以P構型通過P-l，3-和|3_1，4-混合鍵形成的直鏈結構，大約含70%P-l，4-鍵和30%的P-l，3-鍵，它們的分子量和構型因大麥品種、自然環境、生長階段等因素的不同而有所差異。按照水解13-葡聚糖的特異性可將葡聚糖酶主要分為特異性的13-1，3-l，4-D-葡聚糖酶或地衣多糖水解酶(EC3.2.1.73)、內切P-l，4-D-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)、P-l，3(4)-葡聚糖酶(EC3.2.1.6)禾PP-l，3-D-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)等四類。迄今，報道的微生物P-l，3-l，4-葡聚糖酶大多屬于細菌產的糖苷水解酶16家族，包括細菌、真菌和瘤胃微生物。已有多種芽孢桿菌P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因被克隆禾口表達，如芽胞桿菌B.amyloliquefaciens，B.circulans(KimJYetal.BiotechnolLett，2003，25:1445-1449)，B.licheniformisEGW039(Tengetal.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2006，72(4):705-712);類芽胞桿菌Paenibacilluspolymyxa(GosalbesMJetal.JBacteriol，1991，173(23):7705-7710)。這些葡聚糖酶都具有相似的核苷酸和氨基酸序列，且都有一個保守的氨基酸序列EIDIEF，其中兩個谷氨酸參與酶的水解(HahnMetal.JBiolChem，1995，270:3081-3088)。也從一些非芽胞桿菌的細菌中克隆得到P-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，如牛鏈球菌Str印tococcusbovis(EkinciMSetal.ApplEnvironMicrobiol,1997，63:3752-3756)，產琥珀酸絲狀木干菌Fibrobactersuccinogenes(ChenJLetal.JBiolChem，2001，276:17895—17901)。近年來，也有一些報道研究真菌胞外P-l，3-l，4-葡聚糖酶的純化和性質，如Orpinomycessp.PC_2、Cochlioboluscarbo皿m(G6rlachetal.ApplEnvironMicrobiol，1998，64(2):385-391)、Talaromycesemersonii(MurrayPGetal.EnzymeandMicrobialTechnology,2001，29(1)90-98)禾口Rhizopusmicrosporesvar.microsporus(Celestinoetal.BMCbiochemistry,2006，7:23)。但只有幾種真菌P-1，3-1，4-葡聚糖酶基因克隆和表達的報道，這些真菌包括Orpinomycessp.PC-2(ChenHetal.JournalofBacteriology,1997，179:6028-6034)，Aspergillusjaponicas(GrishutinSGetal.CarbohydrRes，2006，341:218—229)禾口Bisporasp.MEY—1(Luoetal.JAgricFoodChem，2009，57(12):5535-5341)。近年來，一些專利介紹了不同來源的P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因在不同的載體和宿主得到表達，如大腸桿菌、畢赤酵母等，但表達水平低。類芽孢桿菌PaenibacillusspF-40的P-l，3-l，4-葡聚糖酶在畢赤酵母中表達(專利200610112092.8)，發酵液粗酶活4553.7U/mL。淀粉液化芽胞桿菌B.amyloliquefaciens的P_1，3-1，4_葡聚糖酶在大腸桿菌中表達(專利200910031553.2)，LB培養基總酶活322.0U/mL，胞外酶活127.5U/mL。從國內外公布的專利分析，關于真菌P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因的專利較少，在不同表達系統的葡聚糖酶活差別也較大。關于嗜熱真菌的P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因、克隆表達的報道和專利。因此克隆和表達具有高比活、熱穩定性好和底物特異性強的嗜熱真菌13-1，3-1，4-葡聚糖酶對于飼料、食品等行業具有重要的作用。種P-l，3-l，4-葡聚糖酶，來源于嗜熱擬青霉
發明內容本發明的目的在于提供(Paecilomycesthermophila)。本發明提供的P-l，3-l，4-葡聚糖酶，是如下1)或2)或3)的蛋白質1)由序列表中序列2的第19-314位所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；3)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有P-l，3-l，4-葡聚糖酶活性的由1)衍生的蛋白質。其中，序列表中的序列2由314個氨基酸組成，分子量約為34.54X103kDa。為了使l)或2)中的蛋白便于純化，可在由序列表中1)或2)的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1.標簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述3)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述3)中的蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。上述蛋白的編碼基因也屬于本發明的保護范圍之內。上述蛋白的編碼基因為如下1)_4)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第55-945位；2)其編碼序列是序列表中序列1;3)在嚴格條件下與1)或2)的基因雜交且編碼所述蛋白的基因；4)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。上述嚴格條件可為用O.IXSSPE(或O.IXSSC)，O.1%SDS的溶液，在DNA或者RNA雜交實驗中65t:下雜交并洗膜。序列表中序列1有945個堿基，可編碼序列表中序列2所示的蛋白。其中序列表中序列1的自5'端第1-54位編碼序列表中序列2所示的第1-18位的信號肽；序列1的自5'端第55-945位所示的DNA片段可編碼序列表中序列2的第19-314位所示的氨基酸序列組成的蛋白質。擴增上述基因全長或其任一片段的引物對也屬于本發明的保護范圍。含有上所述基因的重組載體也屬于本發明的保護范圍之內。上述重組載體可以是將上述的基因插入pPIC9K的多克隆位點得到的重組表達載體。具體地將，上述的基因是插入pPIC9K的SnaBI和AvrII限制性酶切位點之間的，使得核苷酸序列位于A0X1啟動子的下游并受其調控。含有上述基因的表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬于本發明的保護范圍之內。上述重組菌具體是將上述的基因通過所述的重組表達載體導入畢赤酵母(Pichi即astoris)中，得到的轉基因重組菌。上述畢赤酵母是GS115。本發明的另一目的在于提供上述蛋白的制備方法。本發明提供的方法是是將所述的重組菌進行發酵得到，所述發酵條件是取含有重組質粒的GS115菌株，接種于200mLBMGY培養基中，30°C，250rpm振蕩過夜培養至0D6。。10.0左右，然后接種于發酵基本培養基于5L發酵罐中發酵。經過基礎培養、甘油分批補料培養和甲醇誘導三個階段，使重組P-l，3-l，4-葡聚糖酶得到高效表達。整個發酵過程溫度控制在30°C，通過調整轉速、通氣量和補料速率控制溶氧>20%，發酵的三個階段pH分別控制在4.0、5.0和6.0。實驗證明本發明提供的方法可高效制備重組P-l，3-l，4-葡聚糖酶，重組畢赤酵母發酵液上清酶活最高達55，300U/mL，粗蛋白9.lg/L。本發明的P_1，3_1，4-葡聚糖酶最適反應溫度為7(TC，最適pH值為7.0。本發明的P-l，3-l，4-葡聚糖酶具有表達水平高和耐熱特性，可廣泛應用于飼料、食品及啤酒工業等，在生產中具有很大的推廣應用潛力。圖1為本發明的耐熱P-1，3-1，4-葡聚糖酶基因保守區PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖(列M:marker，列1:PCR擴增產物)。圖2為本發明的耐熱13-1，3-1，4_葡聚糖酶基因編碼區PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖(列M:marker，列1:PCR擴增產物)。圖3為本發明耐熱P-l，3-l，4-葡聚糖酶發酵罐高密度發酵過程圖蛋白含量參酶活)。圖4為本發明耐熱e-l，3-1,4-葡聚糖酶發酵罐高密度發酵過程SDS-PAGE圖(列M:低分子量標準；列1，2，3，4，5分別為發酵24h，48h，60h，72h，84h樣品，上樣量1yL發酵液)。圖5為本發明的耐熱P-l，3-l，4-葡聚糖酶純化過程圖(列M:低分子量標準；列1:發酵液上清；列2:過QSFF柱樣品；列3:過S-100純化蛋白)。圖6為耐熱P-l，3-l，4-葡聚糖酶最適pH(其中B:Citric-Na2HP04緩沖液；參MES緩沖液；▲:磷酸緩沖液；▼:Glycine-NaOH緩沖液)。圖7為本發明的耐熱P-l，3-l，4-葡聚糖酶的最適溫度。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。嗜熱擬青霉(Paecilomycesthermophila)J18:中國農業大學，非專利文獻是江正強等.嗜熱擬青霉木糖苷酶的性質及其與木聚糖酶的協同作用，食品與發酵工業，2008(07):12-16。實施例1、P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因的發現—、葡聚糖酶基因基因組保守區片斷PCR擴增以嗜熱擬青霉(Paecilomycesthermophila)J18(中科院微生物研究所菌種保藏中心，保藏號為CGMCC6885)的基因組DNA為模板，根據GeneBank報道的絲狀真菌P_葡聚糖酶的氨基酸序列，利用在線軟件BlockMaker(htto:〃blocks.fhcrc.org/blocks/blockmkr/makeblocks,html)搜索保守區，再利用在線引物設計軟件CODEHOP(http:〃blocks,fhcrc.org/codehop.html)設計兼并引物PtLicl6CPl(正向)5'-CGGCGAGATCGACATCATHGARGGNGT-3'，PtLicl6CP2(反向)5'-GCCCAGTCGCCGCARAANGTNRTRTC-3'。PCR反應混合物(50iiL):水37.25iiL;10XExTaqbuffer,2.5iiL;2.5mmol/LdNTPs，4iiL;引物(10iimol/L)，各2.5iiL;DNA模板(50-100ng)，1iiL;ExTaq(5U/iiL)，0.25iiL。PCR反應條件94°C5min;6TC-55t:每個循環降落0.5°C，30s;72°Clmin，10個循環；94°C5min;55。C30s;72。Clmin，20個循環，72°C10min。PCR反應完畢后取5iiL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示500bp左右有一特異條帶(圖1)，經瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后連入pMD-18T載體，經熱激法轉化大腸桿菌JM109,菌落PCR鑒定重組子后測序。測序結果經NCBIBlast搜索比對，與其他真菌來源的P-l，3(4)-葡聚糖酶基因有較高的同源性。二、P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因全長cDNA擴增根據克隆得到的DNA片段及閱讀框分析，分別設計3'RACE和5'RACE引物，利用SMARTRACE方法(SMARTRACEcDNAAmplificationKit,Takara)擴增cDNA的3'禾P5'末端。3'RACE特異引物PtLicl6AGSP2:5'-CGATAACGACGGCTTCACGGGCAAT-3';5'RACE特異弓l物PtLicl6AGSPl:5'-CTTGGCAGCGGGCGTGTCCCAGTTC-3'，PtLicl6ANGSPl:5'-CGTAGATGCCGCCGCCAATGCTGTT-3'。瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目標片段連入pMD-18T載體，熱激法轉化大腸桿菌JM109,菌落PCR鑒定重組子后，分別測序。為了獲得5'末端最大長度，其中對于5'RACE產物測序10個克隆，最后，根據測序結果拼接5'末端和3'末端，得到全長cDNA序列。基因序列經NCBIBlast搜索比對分析，其全長cDNA包含一945bp完整開放閱讀框(0RF)(序列l)，編碼314個氨基酸。和煙曲霉(Aspergillusfumigatus)內切P_1，3(4)-葡聚糖酶基因(EAL88240.1)同源性最高，相似度達69%。氨基酸序列與費希爾新薩托菌(Neosartoryafischeri)內切P-l，3(4)-葡聚糖酶(EAW23242)同源性最高，相似度達61%。經蛋白數據庫比對分析，屬于糖苷水解酶16家族。實施例2、重組P-l，3-l，4-葡聚糖酶基因的表達—、構建重組菌完整開放閱讀框(0RF)編碼蛋白序列經SignalP3.0分析，有一信號肽，可能切割位點在18和19位氨基酸之間(AAA-YH)。據此設計引物，去除原基因終止密碼子，兩對引物分別為PtLicl6ASnaBIF:5'-TACGTATATCATCTTGTTGACGACTACG-3'(含SnaBI酶切位點)；PtLicl6AAvrIIR:5'-CCTAGGTTAGGGTGCGTACACGCGGAG-3'(含AvrII酶切位點)，用上述引物，以嗜熱擬青霉(Paecilomycesthermophila)J18的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳如圖2，經凝膠試劑盒回收后經TA克隆連接入pMD-18T載體，熱激法轉化大腸桿菌JM109,經菌落PCR鑒定重組子，陽性重組質粒命名為pMD-18T-Glu。經pMD-18T-Glu質粒提取、SnaBI和AvrII雙酶切后，回收目標帶，連接由SnaBI和AvrII雙酶切的表達載體pPIC9K(Invitrogen公司)，經PCR及測序驗證后，陽性重組質粒命名為pPIC9K-Licl6A。測序結果表明，pPIC9K-Licl6A是序列表中序列1的自5'端第55-945位所示的DNA片段插入pPIC9K的SnaBI和AvrII酶切位點之間構成的重組表達載體。序列1的自5'端第55-945位所示的DNA片段可編碼序列表中序列2的第19-314位所示的氨基酸序列組成的蛋白質。重組質粒pPIC9K-Licl6A采用Sacl線性化后電轉化嗜甲醇畢赤酵母GS115,構成重組菌。將得到的重組菌涂布MD平板(1.34X酵母無氨基氮源YNB，4X10—5%生物素，2%葡萄糖)，從MD平板得到的His+轉化子經滅菌水刮取后取100iiL涂布不同濃度的YPD-G418平板(1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂糖，不同濃度的6418)，3-5(1后挑取轉化子，分別點種匪(l.34%酵母無氨基氮源YNB，4X10—5%生物素，0.5%甲醇)、MD板，然后分別按搖瓶培養誘導目標蛋白表達，每隔24小時取樣，1000rpm離心10min，取上清按下述DNS法測定酶活，經篩選從YPD-G418(8mg/mL)平板得到含有重組質粒pPIC9K-Licl6A的GS115菌株，菌株表型Mut+His+。二、搖瓶培養將上述篩選酶活最高的菌株在BMGY培養基(1%酵母粉，2%蛋白胨，100mM、pH7.0的磷酸鹽緩沖液，1.34%YNB，4X10—5%生物素，1%甘油)搖瓶培養16_18h，3000g離心5min，收集菌體，用B匪Y培養基(1%酵母粉，2%蛋白胨，100mM、pH7.0的磷酸鹽緩沖液，1.34%YNB，4X10—5%生物素，0.5%甲醇)重懸菌體0D6。。至1.0左右，誘導目標蛋白表達。以上培養條件為500mL三角瓶裝量100mL培養基，溫度3(TC，轉速250rpm。誘導96h，酶活可達1698U/mL上清液。酶活力通過DNS法(Miller,G丄1959.Useofdinitrosalicylicacidreagentfordeterminationofreducingsugars.Anal.Chem.31，426-428)測定將大麥葡聚糖底物配制成lg/100mL濃度，測定時在小試管中加入50L底物，然后加入100yLpH7.0、75mM的MES緩沖液，混勻使緩沖液濃度為50mM，底物濃度為0.25g/100ml。70。C預熱3min，加入50iiL適當稀釋的酶液，反應lOmin后加入200yLDNS試劑，煮沸15min后加入200iiL飽和酒石酸鉀鈉溶液，冷卻后測定540nm吸光度值，以葡萄糖作為標準。l個酶活力(U)的單位定義為在上述條件下(pH7.0，溫度7(TC)，每分鐘生成lymol葡萄糖所需要的酶量。三、高密度發酵本步驟設置空載體對照按照實施例2步驟一獲得重組菌的方法，將pPIC9K質粒線性化后電轉化嗜甲醇畢赤酵母GS115，得到空載體對照pPIC9K/GS115。71、發酵罐高密度發酵表達采用5L的發酵罐(BIOTECH,上海保興生物設備工程有限公司)。種子培養基BMGY;發酵基本培養基BSM(85%H3P04，26.7mL;CaS04，0.93g;K2S04，18.2g;MgS047H20，14.9g;K0H，4.13g;甘油，40.Og，加蒸餾水水至1L)。甘油分批補料培養基50g/100ml甘油高壓滅菌后，加入PTM1(CuS04*7H20，6.Og;NaI，O.08g;MnS04H20，3.Og;Na2Mo042H20，0.2g;硼酸，O.02g;CoC12，0.5g;ZnC12，20.Og;FeS047H20，65.Og;生物素，O.2g;濃硫酸，5.OmL;加水至1L)12mL/L甘油。100%甲醇誘導培養基100%甲醇，加入PTMi12mL/L甲醇。發酵過程(1)種子培養從保藏的甘油管吸取0.2mL菌液接種200mLBMGY培養基，3(TC，250rpm過夜培養至0D6。。10.0左右。(2)分批培養裝量2.OL(發酵基本培養基BSM)，發酵罐滅菌，28%濃氨水調pH4.O，加入PTM^.35mL/L起始發酵液(2L發酵基本培養基BSM)，接種量10%，轉速700rpm，通氣量1.Ovvm，發酵18-24h。(3)甘油分批補料培養待分批培養至甘油耗盡(根據DOspikes操作，30s內溶氧迅速上升至接近100%又迅速下降)，流加甘油分批補料培養基，流速18.4mL/h/L起始發酵液，始終監視DO，通過停止流加、調整轉速和通氣量等保持DO>20%。流加時間4小時，待0De。。220左右，停止流加。(4)100%甲醇誘導培養停止流加甘油后，根據DOspikes，饑餓30min左右，流加100%甲醇誘導培養基，在4h內使流速從3.6mL/h/L起始發酵液增加至10.9mL/h/L起始發酵液左右，監控溶氧(DO)>20%。發酵過程中取樣分析細胞濃度及酶活(測定方法同步驟二)，結果顯示，在72h達到最高酶活，發酵液上清酶活55，300U/mL，粗蛋白9.lg/L。蛋白濃度參照Lowry等(Lowry，0.H.，Rosebrough，N.J.，Farr，A.L，andRandall,R.J.Proteinmeasurementwiththefolinphenolreagent.JBiolChem，1951，193:265-275)的方法，以牛血清白蛋白作為標準蛋白)。而空載體對照無酶活，故未在圖中顯示。蛋白經Gelpro4.5凝膠分析軟件分析，目標蛋白占胞外總蛋白的80%以上，發酵過程參數見圖3、圖4。四、重組P-l，3-l，4-葡聚糖酶純化取步驟三中的發酵(72h放罐)上清液10mL，10000rpm/min離心10min，取上清10mL，用pH9.OTris-Cl平衡緩沖液交換三次，最終濃縮至lmL，上樣經pH9.0、20mM的Tris-Cl平衡緩沖液平衡的Q-S印haroseFastFlow強陰離子交換柱(1X10cm)，200mMNaCl洗滌5-10個柱體積，300mMNaCl洗脫，流速lmL/min，收集有活性的部分，超濾濃縮至lmL，分兩次上樣經pH7.2、20mM磷酸緩沖液(含lOOmMNaCl)平衡的S印hacrylS-100HR(1X100cm)，用同樣的磷酸緩沖液洗脫，流速0.3mL/min，電泳檢測，收集目標蛋白。純化蛋白經SDS-PAGE(XaemmliUK.CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.Nature,1970，277:680-685)檢測達至lj電泳純(圖5)。純化結果見表2。其中酶活和蛋白含量的測定方法分別同步驟二和步驟三。表2重組蛋白純化表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>a10mL發酵上清液實施例3、P-l，3-l，4-葡聚糖酶的性質—、P-l，3-l，4-葡聚糖酶最適pH將實施例2中純化后的蛋白溶于不同pH值的4種50mM不同緩沖液體系中(Citric_Na2HP04，pH2.5-5.5;MES，pH5.0-6.5;磷酸緩沖液，pH6.5-8.5;Glycine-NaOH，pH8.5-11.0)，然后在7(TC條件下測定酶活力(酶活力測定方法同步驟二)，以酶活力最高點作為100%作圖。結果表明重組P-l，3-l，4-葡聚糖酶的最適pH為7.0(圖6)。二、e-l，3-1,4-葡聚糖酶最適反應溫度將實施例2中純化后的蛋白適當稀釋于50mMpH7.0的MES緩沖液中，然后分別在40-10(TC不同溫度下按照上述方法測定P-l，3-l，4-葡聚糖酶的酶活力(酶活力測定方法同步驟二)。以酶活力最高點作為100%作圖。結果顯示，P-l，3-l，4-葡聚糖酶的最適反應溫度為70°C(圖7)。權利要求一種蛋白，是如下1)或2)或3)的蛋白質1)由序列表中序列2的第19-314所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；3)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性的由1)衍生的蛋白質。2.權利要求l所述蛋白的編碼基因。3.如權利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因為如下1)-4)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列1的自5'末端第55-945位；2)其編碼序列是序列表中序列1;3)在嚴格條件下與1)或2)的基因雜交且編碼權利要求1所述蛋白的基因；4)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼權利要求1所述蛋白的基因。4.含有權利要求2或3所述基因的重組載體。5.如權利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體是將權利要求2或3所述的基因插入pPIC9K的多克隆位點得到的重組表達載體。6.含有權利要求2或3所述基因的表達盒、轉基因細胞系或重組菌。7.如權利要求6所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是將權利要求2或3所述的基因通過權利要求4或5所述的重組表達載體導入畢赤酵母中，得到的轉基因重組菌。8.權利要求1所述蛋白的制備方法，是將權利要求6或7所述的重組菌進行發酵得到，所述發酵條件是溫度是3(TC，溶氧〉20%。全文摘要本發明公開了一種β-1，3-1，4-葡聚糖酶及其編碼基因。本發明提供的β-1，3-1，4-葡聚糖酶是如下1)或2)或3)的蛋白質1)由序列表中序列2的第19-314位所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；3)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性的由1)衍生的蛋白質。將該蛋白的編碼基因導入畢赤酵母后構成的重組畢赤酵母也屬于本發明的保護范圍。實驗證明重組畢赤酵母發酵液上清酶活最高達55,300U/mL，粗蛋白9.1g/L。本發明的β-1，3-1，4-葡聚糖酶最適反應溫度為70℃，最適pH值為7.0。該β-1，3-1，4-葡聚糖酶在生產中具有很大的推廣應用潛力。文檔編號C12N15/56GK101775385SQ20101011577公開日2010年7月14日申請日期2010年3月1日優先權日2010年3月1日發明者華承偉,唐艷斌,李一男,江正強,閆巧娟申請人:中國農業大學