專利名稱：一種二氫吡啶二羧酸合成酶的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地說，涉及一種沙門氏菌(Salmonella typhimu-rium)來源的二氫吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)。
背景技術：
L-賴氨酸是人體必需氨基酸之一，能促進人體發育、增強免疫功能。由于谷物食品中的L-賴氨酸含量甚低，在加工過程中易被破壞，而人體及動物不能自己合成L-賴氨酸， 只能從食物中獲取，故稱為限制性氨基酸。L-賴氨酸主要用于飼料添加劑以補充限制性氨基酸提高飼料的吸收利用率，食品添加劑，醫藥，化學制劑等。以年產量比較，L-賴氨酸目前是僅次于谷氨酸的世界第二大氨基酸品種，并且以5% -10%的年增長率增加。國際上生產L-賴氨酸主要通過微生物發酵法。許多種類野生型或者誘變微生物都能夠生產L-賴氨酸。基因工程大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌是主要的生產L-賴氨酸的微生物。L-賴氨酸的合成途徑在許多微生物中都是從天冬氨酸起始的，包括兩步和甲硫氨酸和蘇氨酸共用的步驟，經過九步的酶催化過程，最終產生L-賴氨酸。其中，天冬氨酸激酶(aspartate kinase)是天冬氨酸起始的第一個酶，二氫吡啶二羧酸合成酶 (dihydrodipicolinate synthase, DHDPS)是L-賴氨酸合成分支途徑的第一個酶，它們的活力在微生物體內受復雜的調控，在一些革蘭氏陰性菌中，天冬氨酸激酶和二氫吡啶二羧酸合成酶都受終產物L-賴氨酸的負反饋抑制。而在一些革蘭氏陽性菌，這兩種酶都對L-賴氨酸卻不敏感。DHDPS是L-賴氨酸合成分支途徑的一個重要的酶，它的活力決定著代謝流流向 L-賴氨酸合成途徑的比例，因此，DHDPS的活力和其對L-賴氨酸反饋抑制的敏感性直接決定著L-賴氨酸合成的量。而專利號為6，040，160的美國專利所保護的大腸桿菌DHDPS正是經過突變增強了其對于終產物L-賴氨酸的抗反饋抑制能力。利用基因工程大腸桿菌表達異源DHDPS，如谷氨酸棒桿菌(C. glutamicum)和甲醇芽孢桿菌(B. Methanolicus)來源的DHDPS，生產L-賴氨酸均有見諸報道。由于異源的DHDPS在大腸桿菌體內受到了和本來源微生物體內不同的調控，或者在不同的催化環境中表現了不同的活力性質，如不同的發酵溫度和PH，因此異源表達不同種類的DHDPS對于 L-賴氨酸的產量有著不同的影響，尋找具有高比活和高抗L-賴氨酸反饋抑制能力的DHDPS 需要進行大量工作，且存在很多困難。

發明內容
本發明的第一個目的，在于提供一種二氫吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)，具有高比活和高抗L-賴氨酸反饋抑制能力。本發明的第二個目的，在于提供一種所述二氫吡啶二羧酸合成酶的DNA序列。本發明的第三個目的，在于提供一種用于表達二氫吡啶二羧酸合成酶的重組質粒。本發明的第四個目的，在于提供一種表達二氫吡啶二羧酸合成酶的重組菌株。根據一個具體實施例，本發明的二氫吡啶二羧酸合成酶來源于沙門氏菌 (Salmonella typhimurium)。根據一個優選實施例，所述二氫吡啶二羧酸合成酶經過了定點突變，其氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。根據另一個優選實施例，所述定點突變的二氫吡啶二羧酸合成酶的DNA序列如 SEQ ID NO 2 所示。根據一個優選實施例，本發明的用于表達二氫吡啶二羧酸合成酶的重組質粒包括上述二氫吡啶二羧酸合成酶的DNA序列以及一種合適的載體。根據本發明，所述合適的載體優選的是pDCtet，或pDCkan。根據一個具體實施例，本發明的表達二氫吡啶二羧酸合成酶的重組菌株轉化有所述表達二氫吡啶二羧酸合成酶的重組質粒。經驗證，本發明的二氫吡啶二羧酸合成酶具有高比活和高抗L-賴氨酸反饋抑制能力，可用于高效生產L-賴氨酸，且相比野生型L-賴氨酸生產菌株，在發酵成本和生產效率方面具有明顯的優勢。
具體實施例方式下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。以下實施例中使用的菌株和質粒如下大腸桿菌 BL21 (DE3 (Novagen))，質粒 pET24a (Novagen)，pTRC99a (Pharmacia)，大腸桿菌 DH5 α (TaKaRa)。質粒pDCtet、pDCkan，菌株DC209 長春大成生化集團；谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)長春大成生化集團。沙門氏菌(Salmonella typhimurium LT2) =Nature 2001，413 :852_6。以下實施例中使用的酶和試劑如下Kod plusDNA 聚合酶=Toyobo 公司；限制性內切酶 NdeI，XhoI，EcoRI,HindIII,TthlllI，SpeI，DpnI，DraI 等=TaKaRa 公司或Fermentas公司；pMD18-T simple 載體，T4DNA 連接酶=TaKaRa 公司；Axygen gel純化試劑盒和DNA膠回收試劑盒=Axygen公司；Taq DNA聚合酶，改良型Lowry法蛋白濃度測定試劑盒生工生物工程有限公司；其它常規試劑均為國產或進口分裝。以下實施例中，二氫吡啶二羧酸合成酶DHDPS的檢測方法如下1、酶活力測定1)溶液配制L-賴氨酸溶液(ρΗ7. 0)的配制0. 146g L-賴氨酸加SOOul雙蒸水溶解，以鹽酸調節PH值至7. 0左右，定容到Iml ；重組DHDPS酶液緩沖液的配制20mM Tris-HCl (pH8. 0)，IOmM丙酮酸鈉，IOOmM KCl ；DL-ASA (天冬氨酸- β -半醛)底物溶液的配制酶液緩沖液730 μ 1中加入IM咪唑(ρΗ7. 4) 100 μ 1, IOOmM Κ2ΗΡ04100 μ 1，丙酮酸鈉(IOOmM) 50 μ 1，DL_ASA(200mM) 10 μ 1。2)活力測定方法預熱至30°C底物溶液990ul加入石英比色皿(光程1cm，狹縫寬度3mm)中，根據酶液活力將粗酶液適當稀釋，加入稀釋后的酶液10 μ 1，顛倒混勻，立刻讀取0分鐘空白對照，以0. 5分鐘時間為間隔，讀取0D270吸光值。繪制0D270與時間(min)的曲線圖，以酶活遲滯期之后的數據點模擬線性方程。本實驗DHDPS酶活定義為30°C，以AOT27(1/min增加值為1定義為1單位DHDPS酶活。2、蛋白濃度測定(改良型Lowry法蛋白濃度測定試劑盒)1)標準曲線制備在十個1.5ml的離心管中分別加入0、12、24、36、48、60、72、84、 96、108 μ 1 的 BSA (100 μ g/ml)，加入超純水，補足至 120μ 1 ；2)取120 μ 1溶液B (試劑盒自帶)和6ml溶液C (試劑盒自帶)，混勻，各管加入 0. 6ml混合液，混勻，室溫下靜置lOmin。各管加入60 μ 1 Folin酚試劑，迅速混勻，室溫下靜置30min ；3)在分光光度計測定A750值，并制作標準曲線；4)樣品的蛋白濃度可以根據標準曲線得到稀釋后樣品的濃度，乘以稀釋倍數，得到蛋白濃度。本實驗重組DHDPS比活定義為30°C，1 μ g蛋白使得AQ_/min增加值為1定義為 DHDPS 比活為 lAQD27Q/min/y g。3、重組DHDPS抗L-賴氨酸反饋抑制能力測定在底物溶液中加入不同終濃度的L-賴氨酸(lmM，5mM, IOmM等)，按照酶活測定方法測定在不同濃度L-賴氨酸存在情況下稀釋酶液的活力，與底物溶液中L-賴氨酸濃度為零時的活力相比較，酶活力降低百分比較高的為抗L-賴氨酸反饋抑制能力較差的DHDPS。以下通過具體實施例作進一步詳細描述。應理解，以下實施例僅用于說明本發明而非用于限定本發明的范圍。實施例1、蛋白質同源性搜索大腸桿菌DHDPS同源性相近的微生物的DHDPS經過同源性搜索，大腸桿菌的DHDPS的活力比較高，腸桿菌屬、埃希氏桿菌等屬種微生物來源的DHDPS與其氨基酸序列同源性較高；此外，枯草芽孢桿菌的DHDPS具有天然的抗L-賴氨酸反饋抑制能力，芽孢桿菌等屬種的微生物來源的DHDPS與其氨基酸序列同源性較高。因此，本發明選取表1所列的各微生物作為待選微生物。實施例2、選定微生物的二氫吡啶二羧酸合成酶基因(dapA基因)的克隆2.1、引物設計根據NCBI數據庫中的核酸序列，設計克隆引物，具體如以下表1所示。表1、引物序列
權利要求
1.一種二氫吡啶二羧酸合成酶，其特征在于，所述二氫吡啶二羧酸合成酶來源于沙門氏菌(Salmonella typhimurium)，其氨基酸序列如 SEQ ID N0:4 所示。
2.根據權利要求1所述的二氫吡啶二羧酸合成酶，其特征在于，所述二氫吡啶二羧酸合成酶由SEQ ID NO 2所示的DNA序列編碼。
3.一種二氫吡啶二羧酸合成酶的DNA序列，其特征在于，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 4 所示。
4.根據權利要求3所述的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列如SEQIDNO 2所示。
5.一種重組質粒，其特征在于，所述重組質粒包括權利要求3或4所述的DNA序列和適合的表達載體。
6.如權利要求5所述的重組質粒，其特征在于，所述表達載體為質粒pDCtet，或 PDCkan0
7.—種重組菌株，其特征在于，所述重組菌株轉化有權利要求6或5所述的重組質粒。
8.根據權利要求7所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株的宿主菌為大腸桿菌 DC209。
9.權利要求1或2所述的二氫吡啶二羧酸合成酶的應用，其特征在于，用于生產L-賴氨酸。
10.權利要求7或8所述的重組菌株的應用，其特征在于，用于發酵法生產L-賴氨酸。
全文摘要
本發明公開了一種二氫吡啶二羧酸合成酶，以及表達該酶的重組質粒和重組菌株。本發明的二氫吡啶二羧酸合成酶的DNA序列如SEQ ID NO2所示，編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示，本發明的重組質粒包含該二氫吡啶二羧酸合成酶的DNA序列，所述重組菌株包含上述重組質粒。本發明的二氫吡啶二羧酸合成酶具有高比活和高抗L-賴氨酸反饋抑制能力，可用于高效生產L-賴氨酸。
文檔編號C12P13/08GK102191227SQ20101011753
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月4日 優先權日2010年3月4日
發明者孫周通, 楊晟, 黃鶴 申請人:上海工業生物技術研發中心