專利名稱：單核細胞增生李斯特菌熒光定量pcr檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種食品安全技術領域的試劑盒及檢測方法，具體是一種單核細胞增 生李斯特菌(Listeria monocytogenes)熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術：
李斯特菌是革蘭氏陽性無芽孢桿菌，該屬內共有7種菌(單核細胞增生李斯特菌 (Listeriamonocytogenes)、綿羊李其jf特菌(L. ivanovii)、墨氏李其jf特菌(L. murrayi)、西 爾李斯特菌(L. seeligeri)、格氏李斯特菌(L. grayi)、威爾氏李斯特菌(L. welshimeri)、 英諾克李斯特菌(L. irmocua))，其中僅單核細胞增生李斯特菌對人有致病性，是一種人畜 共患病的病原菌，中毒癥狀嚴重，除了常見的嘔吐、腹瀉等胃腸道表現外，還可以侵蝕人體 中樞神經系統(主要表現為敗血癥、腦膜炎、流產等疾病)，對機體造成極大的傷害。人類李 斯特菌病的大多數病例分為零散性發生，爆發性發生或二者兼而有之。其發病率雖不高，但 致死率可高達20% 30%。孕婦、新生兒、老年人和免疫缺陷者是易感人群。它在自然界 廣泛分布，蔬菜、乳制品、海產品、肉類和禽類等食品中都已證實是李斯特菌的傳播載體，它 可在4°C的環境中生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。近年發展起來的熒光定量PCR (Fluorescence Quantitative，FQ-PCR)技術以其靈 敏度高、速度快、特異性強等優點在基因表達水平分析(如Walker CG，Meier S，Mitchell MD等在《BMC Molecular Biology》(BMC分子生物學)2009年第10卷第100頁發表的題 為((Evaluationof real-time PCR endogenous control genes for analysis of gene expression in bovineendometrium》(實時熒光定量PCR法分析牛子宮內膜內源控制基 因的表達)一文中所述的)和病原體的定性定量檢測(如Zago M，Bonvini B, Carminati D等在《Systematic and AppliedMicrobiology))(系統與應用微生物學)2009第32卷第 514 521 頁發表白勺題為((Detection andquantification of Enterococcus gilvus in cheese by real-time PCR》(熒光定量PCR法定性定量檢測奶酪中的腸球菌)一文中所述 的)等方面得到廣泛應用。經對現有技術的文獻檢索發現，陳慧燕等發表于《中國熱帶醫學》2006年第6卷第 770 772頁的題為《食品中李斯特菌檢測方法探討及藥敏結果分析》的文章。該技術通過 對8類食品45件樣品的檢測，其采用的國標法以及改良方法需要制備培養基、計算菌落數 量和鑒定菌落的生化特性等，耗時較長，操作繁瑣；其采用的Mini VIDAS法檢出率較低，檢 測靈敏度不高。因此該現有技術并不適合當前食品快速檢測的需求。目前常規鑒定單核細胞增生李斯特菌的方法以常規培養方法為主(可見標準GB/ T4789. 30-2003)，根據生化特性、致病力及協同溶血試驗等進行鑒定，鑒定周期需要5 10 天。免疫學方法較快，但單克隆抗體制備困難，易產生交叉反應，特異性差。常規PCR方法 雖然具有簡便、快速、靈敏的優勢，但是有不能精確定量和PCR后處理產生污染導致的假陽 性等問題，因此亟待開發精確、靈敏、快速、無污染的快速檢測方法。

發明內容
本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種單核細胞增生李斯特菌熒光定量 PCR檢測試劑盒及檢測方法。本發明的試劑盒可用于單核細胞增生李斯特菌的定性和定量 檢測；本發明的試劑盒檢測特異性高，檢測靈敏度高，定量準確，檢測速度快。本發明是通過以下技術方案實現的本發明涉及一種單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒，包括熒光定 量PCR反應液、熒光探針、熱啟動TaqDNA聚合酶、標準陽性模板和陰性質控標準品；所述的熒光定量PCR反應液具體為10XPCR buffer、Mg2+、dNTPs、正向引物、反向 引物；其中正向引物的堿基序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物的堿基序列如SEQ ID No. 2 所示；所述的熒光探針的堿基序列如SEQ ID NO :3所示，其中，熒光報告基團為FAM，熒 光淬滅基團為ELIPCE ；所述的標準陽性模板為重組質粒的DNA，該重組質粒的質粒為pMD18-T，整合的基 因的堿基序列如SEQ ID No. 4所示；所述的陰性質控標準品為沙門氏菌、副溶血弧菌或金黃色葡萄球菌DNA等。優選地，所述的熒光定量PCR反應液的組分為按體積比，2體積的10XPCR buffer, 1體積的5 u mol/L的正向引物，1體積的5 u mol/L的反向引物，1. 5體積的25mM的 MgCl2,1. 5 體積的 25mM dNTPs。本發明涉及上述單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒的檢測方法，包 括以下步驟①采用常規方法提取待測樣品DNA為模板，②用單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒進行PCR擴增，得反應產物，③將反應產物置于定量PCR儀中進行熒光檢測，④對樣品中單核細胞增生李斯特菌進行定性檢測或定量檢測。所述的定性檢測具體為選擇熒光檢測模式為FAM熒光，基線調整取3 15個循 環的熒光信號，設定閾值線，若待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈對數增長，則判斷 為陽性，即樣品中存在單核細胞增生李斯特菌，否則則樣品中不存在單核細胞增生李斯特 菌；所述的定量檢測具體為設定梯度濃度的標準陽性模板，采用與步驟二的PCR擴 增相同的反應體系和參數進行PCR擴增，以標準陽性模板的對數值為橫坐標，Ct值為縱坐 標繪制標準曲線，根據樣品測得的Ct值，對照標準曲線，得到樣品單核細胞增生李斯特菌 的含量。 所述的PCR擴增中，20 ill的PCR反應體系組成如下模板DNA 2u l,5U/u 1的熱 啟動TaqDNA聚合酶0.2 iil，5 ii mol/L熒光探針0. 4 yl，熒光定量PCR反應液10iU，陰性 質控標準品7.4iU。所述的PCR反應的參數為95°C 15S，95°C 5S，65°C 34S ；45個循環。本發明的單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒中有一條兩端標記有 熒光基團的特異性熒光探針，在探針完整時，兩基團在空間結構上距離相互靠近，5'端報告基團產生的熒光因為熒光共振能量轉移(FRET)而被3'端淬滅基團淬滅，故體系中沒有 熒光信號變化。在PCR退火和延伸過程中，探針和模板特異性結合，隨著引物的延伸，熱啟 動Taq DNA聚合酶利用其5' -3'外切活性對探針進行切割釋放出報告基團，這樣破壞了 兩基團之間的熒光共振能量轉移(FRET)，報告基團所釋放的熒光可以被內置在定量檢測儀 內的熒光計檢測，熒光量的增加與PCR產物的積累量呈比例關系。對單核細胞增生李斯特 菌的定量可通過與標準品的循環閾值相比較得出。Ct值是PCR過程中，熒光量的積累超過 基底熒光量的循環個數，Ct值與起始模數呈一定比例關系，Ct值越小，起始模板數越多，相 反，Ct值越大，起始模板數越少。利用陽性梯度標準模板的Ct值制成標準曲線，再根據待 測樣品的Ct值可準確測出該樣品的起始拷貝數。本發明的試劑盒可用于單核細胞增生李斯特菌的定性和定量檢測；本發明的試劑 盒檢測特異性高，降低了常規PCR方法的假陽性率；檢測靈敏度高，定量準確；利用本發明 的試劑盒進行檢測，速度快，僅需1小時，加上樣品DNA的提取制備時間，總體檢測時間可控 制在3小時以內。


圖1是實施例中試劑盒檢測單核細胞增生李斯特菌標準菌株特異性結果圖；圖2是實施例中試劑盒檢測標準菌株DNA模板等比例稀釋結果；圖3是實施例中試劑盒的熒光定量PCR的標準曲線圖。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施 例。實施例本實施例涉及的單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒的組分為(均購自寶生物工程(大連)有限公司)熒光定量PCR反應液，熒光探針(51^，1111)，熱啟動！~叫0嫩聚合酶(5U/iU， 0. 2ul)，標準陽性模板，陰性質控標準品；所述的熒光定量PCR 反應液具體為10XPCR buffer 2ul、25mM MgCl2l. 5ul、 2. 5mM dNTPsl. 5ul、正向引物(5 y M，lul)、反向引物(5 u M, lul)；其中正向引物的堿基序 列如SEQIDNo. 1所示，反向引物的堿基序列如SEQID No. 2所示；所述的熒光探針的堿基序列如SEQID NO :3所示，其中，熒光報告基團為FAM，熒光 淬滅基團為ELIPCE ；所述的標準陽性模板為重組質粒的DNA，該重組質粒的質粒為pMD18T，整合的基 因的堿基序列如SEQ ID No. 4所示；(濃度為109拷貝/ yl標準陽性模板pM-Lm)所述的陰性質控標準品沙門氏菌、副溶血弧菌或金黃色葡萄球菌DNA等。利用所述的試劑盒進行檢測，包括如下步驟步驟一，DNA模板的制備參考菌株培養及制備
李斯特菌參考菌株單核細胞增生李斯特菌Listeria monocytogenes (ATCC BAA-751、ATCC13313、ATCC13932、ATCC 7644、ATCC 27708、CMCC54002、CMCC54003、CCTCC AB97021)；綿羊李斯 特菌 L. ivanovii(CCTCC AB97016)；西爾李斯特菌 L. seeligeri (CCTCC AB97018)、格氏李 斯特菌 L. grayi (CCTCCAB97017、CCTCC AB97019)、威爾氏李斯特菌 L. welshimeri (CCTCC AB97020)和英諾克李斯特菌 L. innocua (CCTCC AB97022)；非李斯特菌屬菌株金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus (ATCC13565)、沙門氏 菌 Salmonella(ATCC10708)、弧菌 Vibrio(ATCC27562)、變形桿菌 Bacillus proteus(ATCC12453)、痢疾志賀氏菌 Shigella dysenteriae (CMCC51335)、藤黃八疊 球菌 Sarcina lutea (ATCC9341)、陰溝腸桿菌 Enterobacter cloacae (ATCC700323)、 糞腸球菌 Enterococcus faecalis (ATCC49452)、月市炎鏈球菌 Sti^ptococcus pneumoniae (ATCC27336)、大腸桿菌 Escherichiacoli 0157 :H7 (ATCC43889)、枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis (ATCC6633)、弗氏檸檬酸桿菌 Citrobacter freundii (ATCC8090)和沙 雷氏菌 Serratia liquefaciens (ATCC27592)。(注ATCC 美國標準菌種收藏所；CMCC 中 國醫學細菌菌種保藏管理中心；CCTCC 中國典型培養物保藏中心)DNA的提取取菌懸液1ml，充分震蕩搖勻，轉至1. 5ml離心管中，10，OOOg離心 5min,重復洗滌1次，再次離心后采用試劑盒(上海奧潤微納新材料科技有限公司)提取 DNA,取2ul做PCR反應，提取的DNA模板在_20°C貯存備用。步驟二，熒光定量PCR反應反應體系如下成分加樣量(μ )模板 DNA2熱啟動TaqDNA 聚合酶(5U/ μ 1)0. 2熒光探針(5ymol/L)0.4熒光定量PCR反應液10陰性質控標準品7. 4總體積20PCR 反應參數如下95°C 15S，95°C 5S，65°C 34S ；45 個循環。儀器ABI7500熒光定量PCR儀，美國應用生物系統公司。步驟三，定量標準曲線的制作將標準陽性模板10倍倍比稀釋成IO9 IO1拷貝/ μ 1的濃度梯度，在上述反應 條件下每個濃度平行加入3個反應管同時進行擴增，反應結束后采用ABI 7500Software v2. 0. 1軟件分析。如圖3所示，起始模板在IO7-IO1拷貝/ μ 1線性良好，得到線性回歸方 程:y = -3. 914X+41. 718，R2 = 0. 999。步驟四，敏感性及特異性測定取單核細胞增生李斯特菌標準菌株儲備液提取基因組DNA后，按照10倍比例稀 釋，用熒光定量PCR分析，以確定最低下限。取綿羊李斯特菌、墨氏李斯特菌、西爾李斯 特菌、格氏李斯特菌、威爾氏李斯特菌、英諾克李斯特菌以及金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等非李斯特菌株儲備液提取DNA后分析檢測。結果如圖2所示，其中1 6分別為濃度 為 5. 4 X 106CFU/ml，5. 4 X 105CFU/ml，5. 4 X 104CFU/ml，5. 4 X 103CFU/ml，5. 4 X 102CFU/ml， 5. 4 X IO1CFUAiI的標準菌株基因組DNA，7是陰性對照。由圖2可知，標準菌株基因組DNA等 比例稀釋，Q-PCR結果呈現規律的Ct值變化，說明儀器參數穩定，最低檢測下限達到67CFU/ ml。單核細胞增生李斯特菌標準菌株呈陽性擴增，綿羊李斯特菌等及金黃色葡萄球菌等非 李斯特菌的檢測結果均為陰性，與預期結果完全相同，無非特異性擴增。步驟五，重復性測定將標準陽性模板10倍系列稀釋，在上述反應條件下進行擴增。循環結束后，運用 儀器自帶軟件，讀取待檢樣品拷貝數。結果為單核細胞增生李斯特菌標準陽性模板IO7拷 貝/μ1、106拷貝/μ1、105拷貝/μ1、104拷貝/μ1、103拷貝/μ 的Ct值分別為13.12， 16. 96，20. 97，25. 00，28. 88 ；陰性對照為0。反復重復試驗3次，得到Ct值進行統計學分析 Ρ>0. 05，數據差異無顯著意義，說明其不同批次之間的檢測結果具有可比性，具有良好的 重復性。由本實施例的實驗數據可證實，利用本實施例的試劑盒進行熒光定量PCR方法定 量重復性好，定量準確，而且熒光定量PCR檢測試劑盒對樣品的檢測僅需2小時就可完成， 傳統的培養方法全過程需要4 7天，使用本實施例的試劑盒可大大縮短檢測時間，且操作 過程僅需1人即可。
權利要求
一種單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒，包括熒光定量PCR反應液、熒光探針、熱啟動TaqDNA聚合酶、標準陽性模板和陰性質控標準品，其特征在于所述的熒光定量PCR反應液具體為10×PCR buffer、Mg2+、dNTPs、正向引物、反向引物；其中正向引物的堿基序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的堿基序列如SEQ ID No.2所示；所述的熒光探針的堿基序列如SEQ ID NO3所示，其中，熒光報告基團為FAM，熒光淬滅基團為ELIPCE；所述的標準陽性模板為重組質粒的DNA，該重組質粒的質粒為pMD18-T，整合的基因的堿基序列如SEQ ID No.4所示；所述的陰性質控標準品為沙門氏菌、副溶血弧菌或金黃色葡萄球菌DNA。
2.根據權利要求1所述的單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征 是，所述的熒光定量PCR反應液的組分為按體積比，2體積的10XPCR buffer，1體積的 5 u mol/L的正向引物，1體積的5 u mol/L的反向引物，1. 5體積的25mM的MgCl2，1. 5體積 的 25mM dNTPs。
3.一種根據權利要求1所述的單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒的檢測 方法，其特征在于，包括以下步驟①采用常規方法提取待測樣品DNA為模板，②用單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒進行PCR擴增，得反應產物，③將反應產物置于定量PCR儀中進行熒光檢測，④對樣品中單核細胞增生李斯特菌進行定性檢測或定量檢測。
4.根據權利要求3所述的單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒的檢測方 法，其特征是，所述的PCR擴增中，20iU的PCR反應體系組成如下模板DNA 2u l,5U/u 1 的熱啟動TaqDNA聚合酶0.2 iil，5 ii mol/L熒光探針0. 4 yl，熒光定量PCR反應液10 yl， 陰性質控標準品7.4 yl。
5.根據權利要求3所述的單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒的檢測方 法，其特征是，所述的PCR反應的參數為95°C 15S，95°C 5S，65°C 34S;45個循環。
6.根據權利要求3所述的單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒的檢測方 法，其特征是，所述的定性檢測為選擇熒光檢測模式為FAM熒光，基線調整取3 15個循 環的熒光信號，設定閾值線，若待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈對數增長，則判斷 為陽性，即樣品中存在單核細胞增生李斯特菌，否則則樣品中不存在單核細胞增生李斯特 菌。
7.根據權利要求3所述的單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒的檢測方 法，其特征是，所述的定量檢測為設定梯度濃度的標準陽性模板，采用與PCR擴增相同的 反應體系和參數進行PCR擴增，以標準陽性模板的對數值為橫坐標，Ct值為縱坐標繪制標 準曲線，根據樣品測得的Ct值，對照標準曲線，得到樣品單核細胞增生李斯特菌的含量。
全文摘要
一種食品安全技術領域的增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法，其中的試劑盒包括熒光定量PCR反應液、熒光探針、熱啟動TaqDNA聚合酶、標準陽性模板和陰性質控標準品；本發明通過采用常規方法提取待測樣品DNA，并以所得DNA為模板，利用單核細胞增生李斯特菌熒光定量PCR檢測試劑盒進行PCR擴增，得反應產物，之后將反應產物置于定量PCR儀中進行熒光檢測，對樣品中單核細胞增生李斯特菌進行定性檢測或定量檢測。本發明的試劑盒可用于單核細胞增生李斯特菌的定性和定量檢測；本發明的試劑盒檢測特異性高，檢測靈敏度高，定量準確，檢測速度快。
文檔編號C12Q1/04GK101805799SQ201010148950
公開日2010年8月18日 申請日期2010年4月17日 優先權日2010年4月17日
發明者史賢明, 張丹丹, 施春雷, 王大鵬, 龍飛 申請人:上海交通大學