專利名稱：一種鑒別免疫動(dòng)物感染a型流感病毒的抗體間接免疫熒光試驗(yàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒別接種了 A型流感“標(biāo)記”疫苗動(dòng)物，如禽、豬等是否感染相應(yīng) 亞型流感病毒的抗體間接免疫熒光試驗(yàn)方法，具體涉及一種檢測A型流感病毒NA蛋白血清 抗體的間接免疫熒光試驗(yàn)方法，是A型流感“標(biāo)記”疫苗的配套檢測方法。
背景技術(shù)：
A型流感，如H5m亞型禽流感、Hmi甲型流感是一種嚴(yán)重的人畜共患病，既可給養(yǎng) 禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，又可以導(dǎo)致人的死亡，在世界許多國家流行，其中包括我國。經(jīng) 典的預(yù)防A型流感(如禽流感H5m亞型)的措施包括采取嚴(yán)格的生物安全措施、限制有感 染流感病毒風(fēng)險(xiǎn)動(dòng)物的移動(dòng)，撲殺感染病毒的動(dòng)物。疫苗接種是防控流感的一種非常有效 地手段，盡管免疫接種能提高動(dòng)物的抵抗力，使免疫動(dòng)物不表現(xiàn)出臨床癥狀和感染動(dòng)物減 少排毒數(shù)量，但并不能完全阻止病毒的感染，也就是說接種了疫苗的動(dòng)物接觸到病毒后，可 能成為健康的帶毒者。所以，作為免疫接種的配套手段，需要嚴(yán)密的監(jiān)測接種了疫苗的動(dòng) 物，檢測動(dòng)物群是否存在健康帶毒禽，以便采取相應(yīng)的措施，以防病毒隨著帶毒動(dòng)物的移動(dòng) 而向外傳播，更不利于該病的控制。鑒別免疫動(dòng)物，如禽、豬等是否攜帶A型流感病毒歷來是動(dòng)物疫病防控措施難點(diǎn)， 尤其是通過檢測抗體進(jìn)行鑒別診斷。一個(gè)有效方法是給動(dòng)物，如禽、豬等免疫接種“標(biāo)記” 疫苗，然后針對疫苗的“標(biāo)記”，檢測相應(yīng)蛋白抗體，可鑒別診斷出免疫動(dòng)物是否感染A型流 感病毒。例如給雞接種表達(dá)H5W病毒HA基因的重組雞痘病毒疫苗或用與流行病毒(H5N1) 不同NA亞型的病毒(H5N3)制備滅活疫苗等，通過檢測血清中附蛋白抗體(這種抗體只有 病毒能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生，而“標(biāo)記”疫苗不能產(chǎn)生)判定免疫了 “標(biāo)記”疫苗的雞是否感染H5W 亞型流感病毒，一旦檢測到m抗體就表明該禽感染了禽流感病毒(H5W亞型)。現(xiàn)有技術(shù)中一般采用“哨兵”動(dòng)物，來判定免疫動(dòng)物群是否感染A型流感病毒。所 謂的“哨兵”動(dòng)物是指沒有免疫的動(dòng)物，即不含有相應(yīng)A型流感病毒的抗體。把“哨兵”動(dòng) 物隨機(jī)放到免疫動(dòng)物群中，經(jīng)過與免疫動(dòng)物接觸一段時(shí)間，檢測“哨兵”動(dòng)物血清中相應(yīng)亞 型流感病毒的抗體，如果為陽性，則判定該動(dòng)物群有相應(yīng)亞型流感病毒流行。用“哨兵”動(dòng) 物來判定免疫動(dòng)物群是否感染A型流感病毒存在以下缺點(diǎn)1.成本高。“哨兵”動(dòng)物必須是無特定病原動(dòng)物，即不能含有某種病原，如A型流 感病毒，才能作為“哨兵”動(dòng)物，在使用“哨兵”動(dòng)物前，必須飼養(yǎng)在特殊的環(huán)境中，因此，“哨 兵”動(dòng)物的成本很高，而且在使用時(shí)需要投放一定數(shù)量。2.難以大范圍使用。為了鑒別動(dòng)物群是否感染野毒，必須對每群動(dòng)物投放一定比 例的“哨兵”動(dòng)物，這在實(shí)際操作中不具有可行性，只能針對風(fēng)險(xiǎn)性最高的動(dòng)物群實(shí)施，因 此，難以大范圍應(yīng)用。3.只能在群體水平進(jìn)行鑒別。使用“哨兵”動(dòng)物只能在群體水平鑒別動(dòng)物群是否 感染野毒，不能了解和掌握動(dòng)物群感染的比例和狀態(tài)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種鑒別免疫動(dòng)物，如禽、豬等是否 感染A型流感病毒的抗體間接免疫熒光試驗(yàn)。通過檢測A型流感病毒NA蛋白血清抗體進(jìn) 行判斷，該方法操作簡單，結(jié)果判定直觀，特異性好。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種檢測A型流感病毒NA蛋白血清抗 體的間接免疫熒光試驗(yàn)方法，包括如下步驟(1)采集接種了 A型流感“標(biāo)記”疫苗的動(dòng)物，如禽、豬等血液，分離血清，并用PBS 溶液稀釋；(2)表達(dá)NA基因的重組桿狀病毒接種昆蟲細(xì)胞，并表達(dá)NA蛋白；(3)將步驟(1)中稀釋的禽血清加入到步驟(2)中表達(dá)NA蛋白的昆蟲細(xì)胞上，室 溫作用一段時(shí)間；(4)用PBS溶液漂洗，然后加入適量FITC標(biāo)記的兔抗雞二抗，室溫作用一段時(shí)間；(5)用PBS溶液漂洗，然后加入適量碳酸甘油緩沖液，在熒光顯微鏡下觀察是否有 熒光出現(xiàn)；(6)根據(jù)觀察的結(jié)果判斷動(dòng)物，如禽、豬等是否感染相應(yīng)亞型流感病毒。進(jìn)一步，如上所述的鑒別免疫動(dòng)物感染A型流感病毒的抗體間接免疫熒光試驗(yàn)方 法，在步驟(2)中獲得接種了表達(dá)NA基因的重組桿狀病毒，具體方法如下①使用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增A型流感病毒NA基因；②把NA基因克隆到昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體(pFast-Bac)中，獲得表達(dá)NA基因的 重組桿狀病毒；③把重組桿狀病毒接種到昆蟲細(xì)胞上表達(dá)NA蛋白，一段時(shí)間后，去掉細(xì)胞培養(yǎng)上 清液，用丙酮固定細(xì)胞，直接作為抗原檢測NA血清抗體。進(jìn)一步，如上所述的鑒別免疫動(dòng)物感染A型流感病毒的抗體間接免疫熒光試驗(yàn)方 法，在步驟(6)中，如果觀察無特異熒光，判為陰性，動(dòng)物，如禽、豬等沒有受到相應(yīng)亞型流 感病毒感染；如果觀察出現(xiàn)特異熒光，判為陽性，動(dòng)物，如禽、豬等受到相應(yīng)亞型流感病毒感
^fe o進(jìn)一步，如上所述的鑒別免疫動(dòng)物感染A型流感病毒的抗體間接免疫熒光試驗(yàn)方 法，其特征在于該方法是A型流感“標(biāo)記”疫苗的配套檢測方法，用于判定接種了“標(biāo)記” 疫苗的動(dòng)物，如禽、豬等是否感染相應(yīng)亞型流感病毒；該方法適用臨床樣品檢測，是判定接 種了 “標(biāo)記”疫苗的動(dòng)物，如禽、豬等是否感染相應(yīng)亞型流感病毒的篩選方法。本發(fā)明的有益效果如下1)本發(fā)明采用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)A型流感病 毒NA蛋白，表達(dá)的NA蛋白，作為一種真核表達(dá)系統(tǒng)，保證了 NA蛋白的正確折疊和糖鏈修 飾，保持更好的抗原性。2)本發(fā)明建立的間接免疫熒光操作簡單，不需要計(jì)算陽性/陰性閾 值；本發(fā)明結(jié)果判定直觀，陰性和陽性結(jié)果非常容易判定，從而節(jié)省了判定的時(shí)間。3)本發(fā) 明是A型流感“標(biāo)記”疫苗的配套檢測方法，用于鑒別接種了 A型流感“標(biāo)記”疫苗的動(dòng)物， 如禽、豬等是否感染相應(yīng)亞型流感病毒；作為一種篩選方法，該方法可用于臨床血清樣品檢 測，判定接種了 A型流感“標(biāo)記”疫苗的動(dòng)物，如禽、豬等是否感染相應(yīng)亞型流感病毒，以便 盡早采取相應(yīng)的防控措施，有利于根除和消滅臨床上流行的相應(yīng)A型流感病毒。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例的方法流程圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。如圖1所示，鑒別免疫動(dòng)物，如禽、豬等是否感染A型流感病毒的抗體間接免疫熒 光試驗(yàn)，包括如下步驟(1)采集接種了 A型流感“標(biāo)記”疫苗的動(dòng)物，如禽、豬等的血液，分離血清并稀釋， 具體過程如下①動(dòng)物，如禽、豬等免疫接種A流感(如H5亞型)“標(biāo)記”疫苗；②采集接種了 A型流感“標(biāo)記”疫苗的動(dòng)物，如禽、豬等的血液，分離血清；③用PBS溶液(磷酸鹽緩沖溶液)將血清稀釋到100 1000倍數(shù)。(2)獲得表達(dá)A型流感病毒NA基因的重組桿狀病毒，并接種昆蟲細(xì)胞(sf9)，表達(dá) NA蛋白，具體過程如下 ①使用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增A型流感病毒(如H5W) NA基因，RT-PCR是將RNA的反 轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)，為本領(lǐng)域的公知技術(shù)；②把NA基因克隆到昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體(pFast-Bac)中，獲得表達(dá)NA基因的 重組桿狀病毒；③把重組桿狀病毒接種到昆蟲細(xì)胞(sf9)上，36 48小時(shí)后，去掉細(xì)胞培養(yǎng)上清 液，用冷丙酮固定細(xì)胞。上述步驟(1)和步驟(2)可以同時(shí)進(jìn)行。(3)將步驟(1)中100 200微升稀釋的動(dòng)物血清加入到步驟(2)中得到的昆蟲 細(xì)胞上，室溫作用2 3小時(shí)。同時(shí)設(shè)陰性對照和陽性對照。(4)用PBS溶液漂洗三次，干燥后加入適量FITC標(biāo)記的兔抗雞二抗(1 50 100 稀釋)，室溫作用1小時(shí)；(5)用PBS溶液漂洗三次，干燥，在熒光顯微鏡下觀察；(6)在陽性和陰性對照結(jié)果成立的條件下，如果觀察無特異熒光，判為陰性，禽類 沒有受到禽流感病毒感染；如果觀察出現(xiàn)特異熒光，判為陽性，禽類受到禽流感病毒感染。通過以上的具體實(shí)施例可見，本發(fā)明用昆蟲桿狀病毒表達(dá)A型流感病毒NA蛋白， 重組昆蟲桿狀病毒接種昆蟲細(xì)胞(sf9)，表達(dá)的NA蛋白直接作為抗原，不需要純化。本發(fā) 明是A型流感“標(biāo)記”疫苗的配套檢測方法，用于鑒別接種了 A型流感“標(biāo)記”疫苗的動(dòng)物， 如禽、豬等是否感染相應(yīng)亞型流感病毒；作為一種篩選方法，該方法可用于臨床血清樣品檢 測，判定接種了 A型流感“標(biāo)記”疫苗的動(dòng)物，如禽、豬等是否感染相應(yīng)亞型流感病毒，以便 盡早采取相應(yīng)的防控措施，有利于根除和消滅臨床上流行的相應(yīng)A型流感病毒。本發(fā)明所述的方法并不限于具體實(shí)施方式
中所述的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù) 本發(fā)明的技術(shù)方案得出其他的實(shí)施方式，同樣屬于本發(fā)明的技術(shù)創(chuàng)新范圍。
權(quán)利要求
一種鑒別免疫動(dòng)物感染A型流感病毒的抗體間接免疫熒光試驗(yàn)方法，包括如下步驟(1)采集接種了A型流感“標(biāo)記”疫苗的動(dòng)物的血液，分離血清，并用PBS溶液稀釋；(2)表達(dá)NA基因的重組桿狀病毒接種昆蟲細(xì)胞，并表達(dá)NA基因；(3)將步驟(1)中稀釋的禽血清加入到步驟(2)中表達(dá)NA蛋白的昆蟲細(xì)胞上，室溫作用一段時(shí)間；(4)用PBS溶液漂洗，然后加入適量FITC標(biāo)記的兔抗雞二抗，室溫作用一段時(shí)間；(5)用PBS溶液漂洗，然后加入適量碳酸甘油緩沖液，在熒光顯微鏡下觀察是否有熒光出現(xiàn)；(6)根據(jù)觀察的結(jié)果判斷動(dòng)物是否感染相應(yīng)亞型流感病毒。
2.如權(quán)利要求1所述的鑒別免疫動(dòng)物感染A型流感病毒的抗體間接免疫熒光試驗(yàn)方 法，其特征在于步驟(2)中獲得接種了表達(dá)NA基因的重組桿狀病毒，具體方法如下①使用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增A型流感病毒NA基因；②把NA基因克隆到昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體pFast-Bac中，獲得表達(dá)NA基因的重組桿 狀病毒；③把重組桿狀病毒接種到昆蟲細(xì)胞上表達(dá)NA蛋白，一段時(shí)間后，去掉細(xì)胞培養(yǎng)上清 液，用丙酮固定細(xì)胞，直接作為抗原檢測NA血清抗體。
3.如權(quán)利要求1或2所述的鑒別免疫動(dòng)物感染A型流感病毒的抗體間接免疫熒光試驗(yàn) 方法，其特征在于在步驟(6)中，如果觀察無特異熒光，判為陰性，接種“標(biāo)記”疫苗的動(dòng)物 沒有受到相應(yīng)亞型流感病毒感染；如果觀察出現(xiàn)特異熒光，判為陽性，接種“標(biāo)記”疫苗的動(dòng) 物受到相應(yīng)亞型流感病毒感染。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的鑒別免疫動(dòng)物感染A型流感病毒的抗體間接免疫熒光 試驗(yàn)方法，其特征在于該方法是A型流感“標(biāo)記”疫苗的配套檢測方法，用于鑒別接種了 A 型流感“標(biāo)記”疫苗的動(dòng)物是否感染相應(yīng)亞型流感病毒；作為一種篩選方法，該方法可用于 臨床血清樣品檢測，以便盡早采取相應(yīng)的防控措施，有利于根除和消滅臨床上流行的相應(yīng)A 型流感病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鑒別免疫動(dòng)物是否感染A型流感病毒的抗體間接免疫熒光試驗(yàn)方法。該方法是用昆蟲桿狀病毒表達(dá)A型流感病毒NA蛋白作為抗原，建立抗體間接免疫熒光試驗(yàn)方法，檢測A型流感病毒NA蛋白血清抗體。表達(dá)的蛋白可直接作為抗原，不需要純化。本發(fā)明建立的方法是A型流感病毒“標(biāo)記”疫苗的配套檢測方法，用于鑒別接種了A型流感“標(biāo)記”疫苗的動(dòng)物，如禽、豬等是否感染相應(yīng)亞型流感病毒；作為一種篩選方法，該方法可用于臨床血清樣品檢測，判定接種了A型流感“標(biāo)記”疫苗的動(dòng)物，如禽、豬等是否感染相應(yīng)亞型流感病毒，以便盡早采取相應(yīng)的防控措施，有利于根除和消滅臨床上流行的相應(yīng)A型流感病毒。
文檔編號C12N15/866GK101833002SQ20101015134
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月21日
發(fā)明者孫慶杰, 李一經(jīng), 葛俊偉, 邵衛(wèi)星, 魏榮 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué);中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心