專利名稱：一種昆蟲幾丁質合成酶1A基因片段及其dsRNA和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域。具體涉及昆蟲幾丁質合成酶IA基因片段及其dsRNA 和dsRNA在致死害蟲中的應用。
背景技術：
農業害蟲為害是我國農業產量的重要制約因素，長期施用化學殺蟲劑導致一系列 問題1)昆蟲出現抗藥性，用藥劑量加大，防治成本提高；2)農藥殘留導致環境污染嚴重； 3)對非靶標生物有較大影響。現有生物殺蟲劑在害蟲防治中應用較廣，但殺蟲時間較長且 效果緩慢。RNA干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA分子引起的特異性轉錄后基因沉默現象，2006 年獲諾貝爾獎。RNAi的發現不僅為基因的功能研究提供了方法上的突破，同時也為人類疾 病治療和作物害蟲防治開辟了新的途徑。2007年，“Nature Biotechnology”雜志先后兩篇 論文報道了施用表達靶向害蟲重要致死基因V-ATPaseA，CYP6AE14 and GSTl的dsRNA轉基 因植物作為一種控制病蟲害的新方法(Baum et al，2007 ；Mao et al，2007)。2008年，Price 和Gatehouse提出了基于RNAi的害蟲防治策略。基于RNA干擾技術的害蟲防治具有如下 優勢1)選擇對害蟲專一的基因進行干擾，對高等動物和人類是安全的；2)抗蟲具有專一 性，對非靶標生物無殺傷作用；3)對環境無毒無害。研究表明，RNA干擾技術能夠有效控制特殊的植物害蟲，在害蟲防治領域具有重要 的發展前景。而實現基于RNAi進行害蟲有效控制的關鍵是篩選對昆蟲高效致死的dsRNA。幾丁質合成和代謝是昆蟲等節肢動物特有的生物學現象，由于人類和其它高等動 物沒有幾丁質，因此昆蟲幾丁質合成系統已被公認為新型殺蟲劑作用的靶標。幾丁質合 成酶在昆蟲幾丁質合成的最后一步起著關鍵作用，采用RNA干擾技術，開展幾丁質合成酶 dsRNA在害蟲防治中的應用具有重要意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種昆蟲幾丁質合成酶IA基因片段及其dsRNA和dsRNA在 致死害蟲中的應用。本發明提供的一種昆蟲幾丁質合成酶IA基因片段，其核苷酸序列是SEQ ID NO I。本發明提供的一種昆蟲幾丁質合成酶IA基因片段獲得的方法，根據NCBI數據庫 中登錄號為⑶067730的幾丁質合成酶序列，設計上游引物序列為SEQ ID NO :2，下游引物 序列為SEQ ID NO :3，通過PCR擴增獲得SEQ ID NO :1。以昆蟲幾丁質合成酶IA基因片段為模板，通過試劑盒合成dsRNA。dsRNA在致死害蟲中的應用注射dsRNA到昆蟲體腔，結果表明dsRNA可以特異 性地沉默昆蟲體內幾丁質合成酶基因IA的mRNA表達，昆蟲蛻皮困難死亡。


圖1 :2齡東亞飛蝗若蟲注射dsRNA后對昆蟲生長發育的影響。(左側為注射dsGFP 的對照組，右側為注射dsRNA的實驗組)。注射dsRNA實驗組昆蟲因蛻皮困難死亡。圖2 2齡東亞飛蝗若蟲注射dsRNA后對幾丁質合成酶基因IA(LmCHSlA)轉錄的影 響。β -actin為內參基因(1為注射dsGFP的對照組，2為注射dsRNA的實驗組)。
具體實施例方式實施例1 東亞飛蝗幾丁質合成酶IA基因片段及其dsRNA的獲得1)東亞飛蝗幾丁質合成酶IA基因片段的獲得根據NCBI數據庫中登錄號為⑶067730的東亞飛蝗幾丁質合成酶IA基因序列， 采用primer premier5. 0軟件設計特異性引物，上游引物序列為SEQ ID NO :2，下游引物序 列為SEQ ID NO :3，所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。選取大小一致雌雄各 半東亞飛蝗5齡若蟲，四頭一組，冷凍于液氮中，待提取RNA，提取RNA的具體操作步驟參照 TaKaRa Trizol試劑盒。M-MLV反轉錄酶將所提RNA反轉錄成第一鏈cDNA，以此為模板，PCR 擴增獲得幾丁質合成酶 IA基因片段，Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega) 試劑盒將所獲幾丁質合成酶IA基因片段進行純化。2)東亞飛蝗幾丁質合成酶IA基因片段的dsRNA的獲得以1)步驟獲得的幾丁質合成酶IA基因片段為模板，按照T7RiboMAX Express RNAiSystem(Promega)試劑盒說明，體外轉錄合成dsRNA。得到的dsRNA用1. 5%的瓊脂糖 凝膠電泳檢測其單一性，用酶標儀(Molecular Devices SpectraMax 190,Menlo Park,CA, USA)將其定量至終濃度為1 μ g/μ L。保存至_70°C備用。實施例2 幾丁質合成酶IA基因片段合成的dsRNA致死東亞飛蝗1、東亞飛蝗幾丁質合成酶IA基因片段合成的dsRNA注射選取2齡東亞飛蝗第四天大小均一、健康狀況一致的若蟲用于注射上述合成的 dsRNA。25μ 1規格微量注射器用于注射，注射時不可用力過大，順著血液流動的方向，側腹 部第2至3腹節的連接處作為注射點，要避開氣門。注射幾丁質合成酶IA基因片段合成 的dsRNA的量為3 μ g，并設置dsGFP (3 μ g)的對照組，每組15頭蟲子，3個生物學重復，共 計45頭。注射完畢后，將蟲子用IL的燒杯于人工氣候箱中進行飼養(光照黑暗時間= 14h 10h，溫度30士2°C，濕度60% )，給以新鮮小麥幼苗和適當的光照，噴水保持濕度。2、注射dsRNA后東亞飛蝗表型的觀察若蟲注射完畢后繼續飼養，并及時地觀察。注射dsRNA的實驗組與對照組在取食 量、體型變化及體重增長并無顯著差異。對照組飛蝗均可順利蛻皮，從脊線開裂至身體完全 蛻出只需短短幾分鐘，注射dsRNA的實驗組若蟲中，有部分若蟲生長發育出現畸形，因蛻皮 困難死亡。表型見圖1。3、東亞飛蝗幾丁質合成酶IA基因沉默效果檢測取上述畸形但未死亡的3齡若蟲，每組收蟲6只，雌雄各半，實驗組和對照組均取3 個生物學重復。采用Trizol法提取總RNA，采用M-MLV反轉錄酶獲得第一鏈cDNA，以此為 模板進行RT-PCR，檢測幾丁質合成酶IA mRNA的表達量是否降低。結果表明注射dsRNA實 驗組幾丁質合成酶IA mRNA的表達量顯著降低。見圖2。
4、注射dsRNA后東亞飛蝗死亡情況的觀察注射dsRNA的東亞飛蝗實驗組死亡率為88 %。這與注射dsGF P的對照組(死亡率 為0% )相比,致死效果明顯。
權利要求
一種昆蟲幾丁質合成酶1A基因片段，其核苷酸序列是SEQ ID NO1。
2.如權利要求1所述的一種昆蟲幾丁質合成酶基因1A片段合成的dsRNA。
3.如權利要求2所述的一種昆蟲幾丁質合成酶基因1A片段合成的dsRNA在致死害蟲 中的應用。
全文摘要
本發明提供一種昆蟲幾丁質合成酶1A dsRNA的應用，根據NCBI數據庫中登錄號為GU067730的東亞飛蝗幾丁質合成酶1A基因序列獲得序列為SEQ ID NO1的幾丁質合成酶基因1A片段，由該片段合成dsRNA。將上述合成的dsRNA注入昆蟲體腔后，昆蟲因蛻皮困難死亡。為安全無公害的害蟲防治方法的研制提供新的途徑。
文檔編號C12N15/52GK101831447SQ20101016364
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月30日 優先權日2010年4月30日
發明者劉曉健, 張建珍, 李大琪, 郭亞平, 馬恩波 申請人:山西大學