專利名稱：博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶的原核表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種高效表達(dá)博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶蛋白(FDH)的原核表達(dá)載體pET28a-FDH及其在FDH蛋白的原核表達(dá)和制備FDH重組蛋白中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甲酸脫氫酶(FDH，EC 1. 2. 1. 2)在有生命的生物體中廣泛分布，F(xiàn)DH催化甲酸氧化成二氧化碳并在此過程中還原NAD+成NADH。甲酸脫氫酶(FDH)是廣泛存在于甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌，酵母以及高等植物和動(dòng)物中的一個(gè)酶家族。根據(jù)其四級(jí)結(jié)構(gòu)、輔基的存在和類型以及底物特異性，分為幾種不同的類型。其中一類是NAD+依賴的甲酸脫氫酶，催化甲酸離子氧化成二氧化碳，在NAD+的耦聯(lián)反應(yīng)中形成NADH。該類型的甲酸脫氫酶由兩個(gè)相同的亞基組成，不含金屬離子和輔基，對(duì)甲酸和NAD+具有高度的專一性。由于FDH反應(yīng)的不可逆性以及能適應(yīng)較寬的pH條件，這種酶在最適pH下對(duì)許多工序是一種多用途的高效生物催化劑，因此甲酸脫氫酶具有相當(dāng)大的生物技術(shù)應(yīng)用潛力。 FDH可用于在有機(jī)合成中發(fā)展NAD+再生系統(tǒng)，用來(lái)生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品。德固賽公司(德國(guó)) 最近開始使用商業(yè)技術(shù)制造叔丁基-L-亮氨酸，用FDH作為NADH再生的催化劑，這在藥物化學(xué)中是一個(gè)最大的酶法工藝。來(lái)源于耐熱微生物的FDH有較好的耐熱性能，因此具有很好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。微生物甲酸脫氫酶的研究特別受重視，其中研究最多的是甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌和酵母FDH的特性、結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制等。近年來(lái)，甲酸脫氫酶在輔酶再生中的應(yīng)用已成為輔酶酶法再生研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。它主要應(yīng)用于輔酶NADH的酶耦聯(lián)法再生系統(tǒng)中，所謂的酶耦聯(lián)就是利用2個(gè)平行的氧化還原反應(yīng)酶系統(tǒng)，1個(gè)酶催化底物轉(zhuǎn)化，另1個(gè)酶則催化輔酶NADH循環(huán)再生。甲酸/甲酸脫氫酶體系是最成功的再生系統(tǒng)，它具有諸多優(yōu)點(diǎn)(1) FDH容易得到，且適宜的pH范圍寬， 易于實(shí)現(xiàn)再生反應(yīng)與合成反應(yīng)的有效耦合；(2)甲酸是最廉價(jià)的氫源之一；(3)甲酸在FDH 作用下轉(zhuǎn)化為二氧化碳，可直接從產(chǎn)物中分離出去，使反應(yīng)接近于不可逆過程；(4)甲酸的存在并不會(huì)影響體系中另一氧化還原酶的活性。甲酸脫氫酶在工業(yè)NADH再生中的應(yīng)用已在酵母和細(xì)菌中被廣泛研究。此外，甲酸脫氫酶還有相當(dāng)大的農(nóng)學(xué)應(yīng)用潛力。例如，F(xiàn)DH可用作診斷酶在溶液和生理體液中用于測(cè)定甲酸和草酸的含量。在研究多種脅迫條件對(duì)FDH的影響時(shí)，可產(chǎn)生一些抗脅迫植株，如抗旱和抗凍等，這在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有很大的應(yīng)用價(jià)值。博伊丁假絲酵母是一種甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母菌，能以甲醇為碳源生長(zhǎng)，F(xiàn)DH催化甲醇氧化途徑的最后一步反應(yīng)，在博伊丁假絲酵母的甲基營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)中起很重的作用，來(lái)自博伊丁假絲酵母FDH是個(gè)由兩個(gè)性質(zhì)完全相同的亞基構(gòu)成的二聚體，每個(gè)亞基由364個(gè)氨基酸構(gòu)成，都有各自的活性中心。與其他生物的FDH相比，博伊丁假絲酵母FDH具有較高的活性 (6U/mg蛋白)，對(duì)NAD和甲酸也具有較高的親和性(NAD的Km值為0. 04mM,甲酸的Km值為2. 4mM)，對(duì)熱穩(wěn)定性也比較好(Labrou 和 Rigden, Biochem. J. 2001，354 :455_463)，因此該
酶可能具有較好的應(yīng)用前景。用較低的成本和簡(jiǎn)便 的方法快速生產(chǎn)并純化有活性的FDH蛋白是滿足其工業(yè)應(yīng)用的必需條件，而FDH蛋白特異性抗體是檢測(cè)植物中FDH蛋白表達(dá)水平的有效工具。但現(xiàn)有研究中還未有制備博伊丁假絲酵母FDH的抗體報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種FDH的原核表達(dá)載體(pET28a_FDH)，該載體含有T7啟動(dòng)子和終止子、細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)和FDH基因及一個(gè)組氨酸標(biāo)簽，利用該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(BL21)，可實(shí)現(xiàn)FDH蛋白的高水平表達(dá)。表達(dá)的重組蛋白質(zhì)40%為可溶性蛋白，用親和層析很容易從大腸桿菌可溶性總蛋白中純化出高純度的重組FDH蛋白質(zhì)，用于FDH酶制劑的生產(chǎn)以及生化特性分析。其余60%以包涵體形式存在，用高濃度的尿素溶解包涵體后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離FDH蛋白，再?gòu)哪z中回收FDH蛋白可得到純度極高的FDH蛋白，用于抗體的制備。FDH重組蛋白表達(dá)量很高，因此不需要大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)菌，純化FDH蛋白的操作相當(dāng)簡(jiǎn)單，成本也很低，極易重復(fù)使用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案FDH的原核表達(dá)載體pET28a_FDH，該載體含有T7啟動(dòng)子和終止子、細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)和FDH基因及一個(gè)組氨酸標(biāo)簽。所述的原核表達(dá)載體，其中甲酸脫氫酶基因FDH來(lái)源于博伊丁假絲酵母，在 GenBank中的登錄號(hào)為DQ458777。所述的原核表達(dá)載體，其中FDH基因的上游有T7啟動(dòng)子和細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn) RBS, T7啟動(dòng)子的下游有可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列，緊靠FDH基因的起始密碼子上游還有一個(gè)組氨酸標(biāo)簽序列。所述的原核表達(dá)載體，由下述方法構(gòu)建而得(1)從GenBank中查找博伊丁假絲酵母FDH的全長(zhǎng)基因序列，并設(shè)計(jì)序列如下的一對(duì)引物FDH5 :5， -CATATGAAGATCGTTTTAGTCTTAT-3’FDH3 :5， -CTCGAGTTTCTTATCGTGTTTACCGTAAG-3‘5，端引物有CATATG特征序列，并由此形成Nde I酶切位點(diǎn)；3，端引物末端加Xho I酶切位點(diǎn)。以Candida boidinii的基因組為模版擴(kuò)增，得到FDH的全長(zhǎng)DNA序列；(2)回收并純化FDH全長(zhǎng)基因片段，并將其連接到pMDlS-Τ載體上，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切檢測(cè)獲得重組質(zhì)粒pMD-FDH ；(3)構(gòu)建原核載體pET28a-FDH，用NdeI和XhoI雙酶切pMD-FDH和pET28a，并回收純化FDH基因片段以及載體片段pET28a，然后連接、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測(cè)，獲得原核表達(dá)載體pET28a-FDH。所述的原核表達(dá)載體的制備方法，包括下述步驟(1)從GenBank中查找博伊丁假絲酵母FDH的全長(zhǎng)基因序列，并設(shè)計(jì)序列如下的一對(duì)引物FDH5 :5， -CATATGAAGATCGTTTTAGTCTTAT-3’
FDH3 :5， ~CTCGAGTTTCTTATCGTGTTTACCGTAAG~3‘5，端引物有CATATG特征序列，并由此形成Nde I酶切位點(diǎn)；3，端引物末端加Xho I酶切位點(diǎn)。以Candida boidinii的基因組為模版擴(kuò)增，得到FDH的全長(zhǎng)DNA序列； (2)回收并純化FDH全長(zhǎng)基因片段，并將其連接到pMD18_T載體上，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切檢測(cè)獲得重組質(zhì)粒pMD-FDH ；(3)構(gòu)建原核載體pET28a_FDH，用NdeI和XhoI雙酶切pMD-FDH和pET28a，并回收純化FDH基因片段以及載體片段pET28a，然后連接、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測(cè)，獲得原核表達(dá)載體pET28a-FDH。本發(fā)明的原核表達(dá)載體在制備重組FDH蛋白中的應(yīng)用。本發(fā)明的原核表達(dá)載體在制備FDH特異性抗體的抗原中的應(yīng)用。應(yīng)用本發(fā)明的原核表達(dá)載體制備FDH重組蛋白的方法，本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用 0. 5mM IPTG于28°C誘導(dǎo)6小時(shí)后可使FDH重組蛋白達(dá)到很高的表達(dá)量，表達(dá)的FDH重組蛋白40%為可溶性蛋白，60%形成包涵體蛋白，各占大腸桿菌總蛋白50%，用親和層析很容易從大腸桿菌可溶性總蛋白中純化出高純度的重組FDH蛋白質(zhì)，可用于FDH酶制劑的生產(chǎn)以及生化特性分析。60%的重組蛋白以包涵體形式存在于沉淀中，利用高濃度的尿素溶解后進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)極易純化FDH重組蛋白，然后割下含有FDH重組蛋白的凝膠，通過透析從凝膠中回收獲得純度很高的FDH重組蛋白，可作為抗原用于FDH特異性抗體的制備，為FDH酶制劑的生產(chǎn)以及生化特性分析、FDH特異性抗體抗原的制備提供一條新途徑。


圖1、博伊丁假絲酵母菌基因組DNA的檢測(cè)。M =DNA marker III ； 1-3 基因組DNA。圖2、FDH基因的TA克隆策略。圖3、FDH基因TA克隆質(zhì)粒的檢測(cè)。(A)重組質(zhì)粒pMD18_FH的電泳檢測(cè).M DL2000 ； 1-3 重組質(zhì)粒pMD18-FDH ；4 正對(duì)照(分子量為3. 9kb的質(zhì)粒DNA)。(B)重組質(zhì)粒 PMD18-FDH 的單酶切檢測(cè)· M :DNA marker III ； 1-4 用 Sal I+EcoRI 雙酶切的 pMD18_FDH。 (C)重組質(zhì)粒 pMD18-FDH 的 PCR 檢驗(yàn)。M :DL2000 ； 1-4 以 pMD18_FDH 為模版用 FDH5 和 FDH3 引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；5 負(fù)對(duì)照。圖4、FDH基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建策略。圖5、FDH基因原核表達(dá)載體的檢測(cè)。㈧重組質(zhì)粒pET28a_FDH的電泳檢測(cè)。1_7 重組質(zhì)粒pET28a-FDH ；8 正對(duì)照(分子量為6. 6kb的質(zhì)粒DNA)。(B)重組質(zhì)粒pET28a_FDH 的單酶切檢測(cè)。M =DNA marker III ； 1-5 用Pst I酶切的pET28a_FDH ；6 沒有酶切的質(zhì)粒 pET28a-FDH。(C)重組質(zhì)粒 pET28a_FDH 的雙酶切檢測(cè)。M :DNA marker III ;1_5 用 Pst I+Sph I雙酶切的pET28a-FDH ；6 沒有酶切的質(zhì)粒pET28a_FDH。圖6、FDH重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化。(A)O. 2mM IPTG誘導(dǎo)。1 未加IPTG ；2-3 :16°C 誘導(dǎo) 4h、8h ；4-6 :23°C 誘導(dǎo) 2h、4h、6h ；7-9 :30°C 誘導(dǎo) 2h、4h、6h ；M 蛋白 Marker#SM0431 ； 10 :pET28a 空載體。(B)O. 5mM IPTG 誘導(dǎo)。M 蛋白 Marker#SM0431 ；1 未加 IPTG ；2-3 :16°C 誘導(dǎo) 4h、8h ；4-6 :23°C誘導(dǎo) 2h、4h、6h ；7-9 :30°C誘導(dǎo) 2h、4h、6h ；10 :pET28a 空載體。(C) ImM IPTG 誘導(dǎo)。M:蛋白 Marker#SM0431 ；1 未加 IPTG ；2-5 :30°C誘導(dǎo) 2h、4h、6h、8h ；6 :pET28a空載體。圖7、可溶性和不溶性FDH重組蛋白的分布(A)及其純化(B)圖8、可溶性FDH重組蛋白的純化圖9、可溶 性FDH重組蛋白的酶活性分析圖10、可溶性FDH重組蛋白酶活性的熱穩(wěn)定性分析
具體實(shí)施例方式試劑與儀器試劑主要分為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑。各種限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、dNTP等為日本寶生物工程有限公司(大連)產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自博大泰克生物技術(shù)有限公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。儀器均為分子生物學(xué)以及基因工程實(shí)驗(yàn)室常用儀器。所有引物序列均在上海生工合成。本發(fā)明實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1 博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)基因組DNA的制備與檢測(cè)本發(fā)明所用的假絲酵母(Candida boidinii)購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心， 假絲酵母菌基因組DNA的制備采用CTAB法。取1. 5mL菌液于4°C 4000rpm離心2min，棄盡上清液，收集菌體。加 400 μ 1 2 X CTAB (Tris-HCl ρΗ 7. 5100mM, EDTA20mM, NaCl 1.4M，CTAB 2% )勻漿，65°C保溫20min，加500 μ 1氯仿混勻后于室溫下13000rpm離心lOmin。轉(zhuǎn)移上清，加50μ 1的10% CTAB，加650 μ 1異丙醇置于室溫1小時(shí)，4°C 12000rpm離心25min.， 沉淀用500 μ 1 75%酒精洗一次，真空干燥，力卩20 μ 1含有RNase的TE溶解，37°C保溫一小時(shí)。實(shí)施例2 =FDH基因的擴(kuò)增與TA克隆FDH基因的擴(kuò)增及TA克隆的策略如圖2所示，首選從GenBank中查找FDH的全長(zhǎng)基因序列(FDH基因的GenBank登錄號(hào)為DQ458777)，并設(shè)計(jì)一對(duì)引物，序列如下FDH5 CATATGAAGATCGTTTTAGTCTTATFDH3 CTCGAGTTTCTTATCGTGTTTACCGTAAG5，端引物有CATATG特征序列，并由此形成Nde I酶切位點(diǎn)；3，端引物末端加Xho I酶切位點(diǎn)。在PCR反應(yīng)混合液中加入IOng的博伊丁假絲酵母基因組DNA作為模板，同時(shí)加 Λ 50ng 的特異性引物 FDH5 和 FDH3U. 8μ IdNTP (IOmM), 2. 5 μ 1 的 ExTaq 反應(yīng) Buffer 禾口 0. 15 μ 1的ExTaq (5U/μ 1)聚合酶(大連寶生物公司)，加雙蒸水使反應(yīng)終體積為20 μ 1。 在PCR儀上于94°C加熱3分鐘，然后按照94°C、45秒，53°C、30秒，72°C、1分鐘30秒的程序進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，最后在72°C延長(zhǎng)反應(yīng)10分鐘的程序進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到FDH 基因。反應(yīng)完成后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物?；厥詹⒓兓疐DH全長(zhǎng)基因 DNA(1.2kb)，然后用寶生物(TaKaRa)的TA克隆試劑盒亞克隆到pMD18_T (大連寶生物公司)載體上，實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行，反應(yīng)過夜后用反應(yīng)混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5ci (購(gòu)自天根生化科技公司)，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其大小(圖3A)，選取大小和理論值相符的重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測(cè)。用Sal I.EcoR I雙酶切重組質(zhì)粒，用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，連接成功的重組質(zhì)粒pMD-FDH有兩條帶，其中一條較小為1. 2kb左右的FDH基因DNA片段(圖，另一條為2. 7kb的載體片斷。選取酶切檢測(cè)正確的重組質(zhì)粒PMD18-FDH做進(jìn)一步的PCR檢測(cè)，用FDH基因上下游特異性引物FDH5和FDH3作PCR，亞克隆成功的重組質(zhì)粒均能擴(kuò)增出1. 2kb左右的FDH基因 DNA片段(圖3C)，測(cè)序分析證明重組質(zhì)粒載體中插入的FDH全長(zhǎng)基因序列正確。再次確認(rèn)是連接成功的質(zhì)粒后，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒 pMD18-FDH。實(shí)施例3 原核表達(dá)載體pET28a_FDH的構(gòu)建pET28a-FDH 的構(gòu)建策略如圖 4 所示，用 Nde I (Fermentas)和 Xho I (Fermentas) 切開純化的原核表達(dá)質(zhì)粒載體pEI^8a (購(gòu)自Novagen公司)和pMD18_FDH，通過瓊脂糖凝膠電泳分離已切開的載體和插入片段，從凝膠中回收pET28a被切割后產(chǎn)生的載體片斷 pET28a(5. 3kb)及pMD18_FDH被切割產(chǎn)生的FDH基因的DNA片斷(1. 21Λ)，然后用寶生物 (TaKaRa)的連接酶試劑盒連接pET28a載體片段和FDH基因的DNA片斷產(chǎn)生原核表達(dá)載體pET28a-FDH。用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5 α，天根生化科技)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有卡那霉素(Km，50yg/ml)的平板上，于37°C 過夜培養(yǎng)，篩選Km抗性重組子菌落，從Km抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒(圖5A)，用Pst I (Fermentas)進(jìn)行酶切檢測(cè)，連接成功的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上產(chǎn)生一條6. 2kb大小的條帶(因?yàn)镮3St I在FDH基因處有單一識(shí)別位點(diǎn)，在pET48a(+)載體沒有識(shí)別位點(diǎn)，故單酶切質(zhì)粒應(yīng)有一個(gè)片段)(圖5B)。用I^st I、Sph I (Fermentas)進(jìn)行雙酶切檢測(cè)，連接成功的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上產(chǎn)生1. 171Λ和5. 38kb兩條帶(因?yàn)镮^st I和Sph I分別只在基因片段和載體上有單一識(shí)別位點(diǎn)，故雙酶切質(zhì)粒應(yīng)有兩個(gè)片段)(圖5C)。將連接成功的質(zhì)粒載體pET28a_FDH重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒pET28a-FDH.實(shí)施例4 重組FDH蛋白的表達(dá)與表達(dá)條件的優(yōu)化用原核表達(dá)載體pET28a_FDH轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21的感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技)。 挑取單菌落加入2mL LB (含有Km 50mg/L)中，37°C過夜培養(yǎng)(OD6tltl值約為1. 5)。在不同濃度 IPTG(0. 2mM(圖 6A)/0. 5mM(圖 6B)/lmM(圖 6C))、不同時(shí)間(ai/4h/6/ i)、不同溫度 (160C /230C /300C )誘導(dǎo)后離心收集菌體，去除上清液，用wash buffer(IOmM Tris-Cl, pH7. 5)洗 2 次，加入適量 5 X SDS-PAGE 上樣緩沖液(Sample loading buffer)，于 95°C加熱 10分鐘。冰浴冷卻后于4°C離心(12000rpm)10分鐘，取上清作SDS-PAGE。根據(jù)文獻(xiàn)資料和軟件分析預(yù)測(cè)目的蛋白大小為45kDa左右，采用12%分離膠。SDS-PAGE電泳參看《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》。SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖6)表明用0. 5mM的IPTG于30°C誘導(dǎo)的時(shí)間越長(zhǎng)，F(xiàn)DH蛋白表達(dá)量越高，6小時(shí)后FDH蛋白表達(dá)量最高，占大腸桿菌總蛋白的50% (圖 6B)。實(shí)施例5 重組FDH蛋白的純化用原核表達(dá)載體pET28a_FDH轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21的感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落入 500mL LB (含有Km 50mg/L)中，37°C培養(yǎng)至0D600值約為0. 6時(shí)，加0. 5mM IPTG誘導(dǎo)后6 小時(shí)，離心收集菌體，用wash buffer洗2次，加入30ml蛋白抽提緩沖液(磷酸鈉緩沖液 (pH7. 4) 20mmol/L)，懸浮菌體。于冰浴上超聲波破碎細(xì)菌細(xì)胞(工作3秒，間歇9秒，功率30W，全程30分鐘)。于4°C離心(6000g)30分鐘，得到上清和沉淀。取適量上清和沉淀蛋白樣品加入適量上樣緩沖液作SDS-PAGE，結(jié)果說(shuō)明所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)40%為可溶性蛋白， 60%形成包涵體蛋白(圖7A)。沉淀用8M尿素(IOml)溶解，加入適量上樣緩沖液，跑12% SDS-PAGE，然后用0. 25M KCl于4°C染色30分鐘，割出FDH蛋白條帶，放入透析袋，加入2ml SDS-PAGE buffer,進(jìn)行水平電泳4_5小時(shí)或過夜，將FDH蛋白從凝膠中洗脫出來(lái)，可獲得純度達(dá)95%以上的FDH蛋白樣品(圖7B)，最后在1 XPBS溶液中透析過夜后可作為抗原用于 FDH抗體的制備。上清過0.45um濾膜，用親和層析柱分離純化可溶性FDH重組蛋白。參看His-Trap HP說(shuō)明書，首先用5柱體積純水洗柱，用5柱平衡緩沖液(磷酸鈉緩沖液(pH7. 4) 20mmol/ L，5mM咪唑)平衡柱子，然后上蛋白樣品，用5柱體積濃度分別為30、70、500mM的咪唑緩沖液(磷酸鈉鹽緩沖液20mmol/L，NaClO. 5mmol/L,咪唑)進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液，每管 2mL。最后分別用5柱體積純水和5柱體積20%乙醇洗柱。測(cè)定及各洗脫液中蛋白的濃度， 用50ug跑SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的純度，圖8的數(shù)據(jù)說(shuō)明FDH重組蛋白在500mM的咪唑緩沖液中被洗脫下來(lái)，蛋白質(zhì)的純度達(dá)90%，加70%硫酸銨沉淀洗脫液中的蛋白質(zhì)，用磷酸鉀緩沖液(磷酸鉀緩沖液(PH7. 5) 100mmol/L,DTT lmmol/L，20%甘油)溶解后可用于固定化酶的制備或生化特性分析。實(shí)施例6 重組FDH蛋白的酶活性分析由于FDH酶催化的反應(yīng)伴隨著NAD的還原形成NADH，因此可通過測(cè)量FDH反應(yīng)液在340nm吸光度增加的量計(jì)算出其酶活。通過Bradford法測(cè)定可溶性總蛋白樣品和純化后蛋白樣品的濃度，在Iml的反應(yīng)體系(磷酸鉀緩沖液(pH7. 5) 100mmol/L,甲酸鈉162mmol/ L，NAD+L 62mmol/L)于40°C溫育10分鐘后加入200 μ g蛋白啟動(dòng)反應(yīng)，測(cè)定340nm吸光度的增值。一個(gè)酶活單位U定義為40°C每分鐘還原1 μ mol NAD+為NADH所需的酶量。按公式酶活性(U/mg) = (A/6. 22) X (1/B) X (1/C)計(jì)算酶的活性，其中A是Δ A34tlnm，B是反應(yīng)中可溶性蛋白含量，C是時(shí)間，6. 22是每μ mol NADH在340nm處吸光系數(shù)。如圖9A所示， 未純化的粗蛋白酶活為0. 12U/mg，而純化后蛋白酶活達(dá)到0. 376U/mg。在30°C、40°C、5(rC、 65°C四個(gè)溫度下分別測(cè)定了 FDH酶蛋白的活力，結(jié)果表明(圖9B)在40°C左右FDH活性最高，達(dá)到0. 376U/mg。FDH在65°C溫育IOmin后仍具有77% (0. 289U/mg)的活性，表明重組 FDH是一種適用溫度范圍較廣、耐熱性較強(qiáng)的酶蛋白。實(shí)施例7 重組FDH蛋白酶活性的熱穩(wěn)定性分析取適量FDH純化蛋白樣品在不同溫度(30°C、40°C、5(rC、65°C )下保溫不同時(shí)間 (0min、10min、20min、40min、IOOmin)后測(cè)定其剩余酶活力，結(jié)果如圖10所示。從圖10可以看出，F(xiàn)DH重組蛋白具有較好的熱穩(wěn)定性，在30°C -50°C的環(huán)境下都較為穩(wěn)定，酶活變化不大，在IOOmin保溫后仍有接近70%的相對(duì)活性。FDH對(duì)高溫環(huán)境(65°C )并不敏感，長(zhǎng)時(shí)間保溫對(duì)酶活影響并不大，65°C保溫IOOmin后仍然具有51%的相對(duì)活性。通過上述的實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明達(dá)到了如下的結(jié)果利用本發(fā)明的原核表達(dá)載體 (pET28a-FDH)轉(zhuǎn)化大腸桿菌(BL21)，可實(shí)現(xiàn)FDH蛋白的高水平表達(dá)。表達(dá)的重組蛋白質(zhì) 40%為可溶性蛋白，用親和層析很容易從大腸桿菌可溶性總蛋白中純化出高純度的重組 FDH蛋白質(zhì)，用于FDH酶制劑的生產(chǎn)以及生化特性分析。其余60%以包涵體形式存在，用高濃度的尿素溶解包涵體后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離FDH蛋白，再?gòu)哪z中回收FDH蛋白可得到純度極高的FDH蛋白，用于抗體的制備。FDH重組蛋白表達(dá)量很高，因此不需要大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)菌，純化FDH蛋白的操作相當(dāng)簡(jiǎn)單，成本也很低，極易重復(fù)使用。
權(quán)利要求
1.FDH的原核表達(dá)載體pET28a-FDH，該載體含有T7啟動(dòng)子和終止子、細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)和FDH基因及一個(gè)組氨酸標(biāo)簽。
2.如權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)載體，所述甲酸脫氫酶基因FDH來(lái)源于博伊丁假絲酵母，在GenBank中的登錄號(hào)為DQ458777。
3.如權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)載體，其中FDH基因的上游有T7啟動(dòng)子和細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS，T7啟動(dòng)子的下游有可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列，緊靠FDH基因的起始密碼子上游還有一個(gè)組氨酸標(biāo)簽序列。
4.如權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)載體，由下述方法構(gòu)建而得(1)從GenBank中查找博伊丁假絲酵母FDH的全長(zhǎng)基因序列，并設(shè)計(jì)序列如下的一對(duì)引物FDH5 :5’ -CATATGAAGATCGTTTTAGTCTTAT-3’ FDH3 :5’ -CTCGAGTTTCTTATCGTGTTTACCGTAAG-3‘5，端引物有CATATG特征序列，并由此形成Nde I酶切位點(diǎn)；3，端引物末端加Xho I酶切位點(diǎn)。以Candida boidinii的基因組為模版擴(kuò)增，得到FDH的全長(zhǎng)DNA序列；(2)回收并純化FDH全長(zhǎng)基因片段，并將其連接到pMDlS-Τ載體上，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切檢測(cè)獲得重組質(zhì)粒pMD-FDH ；(3)構(gòu)建原核載體pET28a-FDH，用NdeI和XhoI雙酶切pMD_FDH和pET28a，并回收純化FDH基因片段以及載體片段pET28a，然后連接、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測(cè)，獲得原核表達(dá)載體pET28a-FDH。
5.權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)載體的制備方法，包括下述步驟(1)從GenBank中查找博伊丁假絲酵母FDH的全長(zhǎng)基因序列，并設(shè)計(jì)序列如下的一對(duì)引物FDH5 :5’ -CATATGAAGATCGTTTTAGTCTTAT-3’ FDH3 :5’ -CTCGAGTTTCTTATCGTGTTTACCGTAAG-3‘5，端引物有CATATG特征序列，并由此形成Nde I酶切位點(diǎn)；3，端引物末端加Xho I酶切位點(diǎn)。以Candida boidinii的基因組為模版擴(kuò)增，得到FDH的全長(zhǎng)DNA序列；(2)回收并純化FDH全長(zhǎng)基因片段，并將其連接到pMDlS-Τ載體上，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切檢測(cè)獲得重組質(zhì)粒pMD-FDH ；(3)構(gòu)建原核載體pET28a-FDH，用NdeI和XhoI雙酶切pMD-FDH和pET28a，并回收純化FDH基因片段以及載體片段pET28a，然后連接、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測(cè)，獲得原核表達(dá)載體pET28a-FDH。
6.權(quán)利要求1的原核表達(dá)載體在制備重組FDH蛋白中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1的原核表達(dá)載體在制備FDH特異性抗體的抗原中的應(yīng)用。
8.應(yīng)用權(quán)利要求1-4所述原核表達(dá)載體制備FDH重組蛋白的方法，將上述載體熱刺激法導(dǎo)入大腸桿菌蛋白表達(dá)專用受體菌株BL21中，獲得轉(zhuǎn)化子菌落，用0.5mM IPTG于28°C誘導(dǎo)6小時(shí)可表達(dá)FDH重組蛋白，表達(dá)的重組蛋白質(zhì)40%以可溶性形式存在于上清中(占大腸桿菌可溶性總蛋白40% )，60%存在于包涵體中，通過割膠純化從上包涵體中獲得高純度的重組蛋白質(zhì)，可作為抗原用于FDH抗體的制備。用親和層析從大腸桿菌可溶性總蛋白中純化出有活性的重組FDH蛋白質(zhì)，可用于FDH酶制劑的生產(chǎn)或生化特性分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效表達(dá)博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶蛋白的原核表達(dá)載體pET28a-FDH。該載體是含有博伊丁假絲酵母甲酸脫氫酶基因(FDH)的原核表達(dá)載體。本發(fā)明從博伊丁假絲酵母中克隆出FDH基因，用T7啟動(dòng)子控制它在大腸桿菌中的表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白質(zhì)40％以可溶性形式存在于上清中(占大腸桿菌可溶性總蛋白40％)，60％存在于包涵體中，通過割膠純化從包涵體中很容易獲得高純度的重組蛋白質(zhì)，可作為抗原用于FDH特異性抗體的制備。用親和層析很容易從大腸桿菌可溶性總蛋白中純化出有活性的重組FDH蛋白質(zhì)，用于FDH酶制劑的生產(chǎn)及其生化特性分析。
文檔編號(hào)C12N15/53GK102277370SQ20101017202
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者張婧, 李昆志, 陳麗梅 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)