專利名稱：一株丙酮丁醇梭桿菌菌株及其篩選方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株通過離子束誘變選育得到的高溶劑產量和高丁醇比的丙酮丁醇梭桿菌菌株，以及該菌株的篩選方法和其在溶劑發酵工業中的應用，屬于生物發酵技術領 域。
背景技術：
丁醇是重要的有機化工原料，廣泛應用于油漆、表面涂料、皮革處理、塑料等領域。 作為燃料，丁醇具有能量密度大，對水的穩定性高、可直接用于內燃機、運輸方便等優點，在 能源危機日益嚴峻的今天，丁醇作為燃料有著廣闊的發展前景。2005年我國丁醇表觀消費 量已達到68萬噸，預計2010年國內丁醇需求量將達到97. 2萬噸。由于國內產量不能夠滿 足需要，我國已經是世界上最大的丁醇進口國。丁醇的生產方法主要有乙醛縮合法，丙烯羰基合成法和發酵法。乙醛縮合法工藝 流程長，收率低，成本較高，目前在國外已被淘汰；丙烯羰基合成法生產丁醇的原料為石化 下游產品丙烯；隨著石油價格飛漲和資源加速枯竭，發酵法生產丁醇受到了廣泛的重視，逐 漸成為生物能源的研究熱點之一。近年來，國內對丙酮丁醇發酵的研究很多，主要圍繞著菌種誘變選育、基因工 程改造、發酵工藝條件優化和溶劑提取等發面進行。山西大學顏敘秀(山西食品工 業.1995，2 :26 28)采用紫外誘變處理，篩選到代謝產物提高、穩定性好的菌種，總 溶劑比出發菌提高約36% ；中國專利申請ZL95111733.5報道了通過化學誘變處理丙 酮丁醇梭桿菌，利用玉米粉或高粱為底物，發酵得到總溶劑產量在20g/L左右，丁醇比 為 70 % 的穩定菌株；Mermelstein 等(Biotechnology and Bioengineering. 1993,42 1053 1060)構建了含有乙酰乙酸脫羧酶、CoA轉移酶A、CoA轉移酶的質粒pFNK6，轉化 Clostridiumnacetobutylicum ATCC 824 后，丙酮、丁醇和乙醇產量分別提高了 95%、37% 和90%;Kim等(Applied Environment Microbiology. 1994,60 :337 340)將Clostridium cellulorans的內切葡聚糖酶基因eng B導入Clostridium beijerinckii中，其內切葡 聚糖酶活力比原始菌種提高了 4倍，這對丙酮、丁醇發酵中纖維素的利用具有重要意義； Tomas φ (AppliedEnvironment Microbiology. 2003,69 4951 4965) M groESL 基因在Clostridiumacetobutylicum ATCC 824中過量表達，溶劑產量比野生型高40%。可見，菌種改良是提高丙酮-丁醇發酵經濟競爭力的關鍵手段之一，而建立針對 誘變菌種高效準確的篩選條件是獲得優良丙酮丁醇梭桿菌的重要環節之一。目前國內外僅 有2-脫氧-D-葡萄糖平板篩選丙酮_ 丁醇產生菌的報道。

發明內容
本發明要解決的技術問題之一在于培育具有新的性能的丙酮丁醇菌株，使其夠高 效利用木糖和淀粉，且發酵的溶劑產量和丁醇比高；本發明要解決的技術問題之二在于提 供所述丙酮丁醇菌株的新篩選方法；本發明要解決的技術問題之三在于提供所述丙酮丁醇菌株的用途。為了解決本發明的技術問題，本發明的技術方案在于一、本發明培育了一株新的丙酮丁醇梭桿菌菌株，其分類命名為丙酮丁醇梭桿菌 Clostridium acetobutylicum XY16，保藏號登記號為CCTCC NO :M 2010011。
二、本發明所述的丙酮丁醇梭桿菌Clostridium acetobutylicum XY16的篩選方 法，其特征在于將丙酮丁醇梭桿菌出發菌株離子束誘變后，利用木糖平板和2-脫氧-D-葡 萄糖平板篩選得到能夠高效利用木糖和淀粉的丙酮丁醇菌株，再利用溴甲酚綠平板、刃天 青平板篩選得到產酸能力和還原力強的菌株，最后經搖瓶發酵篩選獲得總溶劑產量和丁醇 比高的丙酮丁醇梭桿菌目標菌株。其具體步驟如下a)離子束誘變將丙酮丁醇梭桿菌原始菌株活化培養，培養溫度30 40°C，250mL 搖瓶裝液量100 150mL，石蠟液封2 5cm，培養時間12 18h，得到生長旺盛、菌體粗壯 的菌液，將培養的細胞稀釋5 10倍，涂布于滅菌的空培養皿中，用無菌空氣吹干；以5 15KeV作為離子注入的能量，以1. 0 2. OX 1016ions/cm2作為誘變劑量對菌株進行離子束 誘變；b)木糖平板篩選菌株經離子誘變后，用生理鹽水洗出，稀釋成不同濃度涂布于 以0. 5 2%的木糖作為唯一碳源的平板上，在30 40°C溫度下厭氧培養24 72h，挑選 出在該平板上能夠生長的菌落；c) 2-脫氧-D-葡萄糖平板篩選將步驟b)篩選出的突變株點植于含有0. 05 0. 2%的2-脫氧-D-葡萄糖的常規固體培養基平板上進行篩選，在30 40°C溫度下厭氧培 養12 36h，挑選生長情況顯著好于出發菌的菌落；d)溴甲酚綠平板篩選將步驟C)篩選的菌株接種于常規固體培養基平板上，30 40°C厭氧培養12 36h，無菌生理鹽水制成濃度相同的菌懸液，加入到含有0. 001% 0. 01%的溴甲酚綠的常規固體培養基平板的孔洞中，在30 40°C溫度下厭氧培養12 36h，挑選出變色圈明顯大于出發菌的菌落；e)刃天青平板篩選將步驟d)篩選的菌株接種于常規固體培養基平板上，30 40°C厭氧培養12 36h，無菌生理鹽水制成濃度相同的菌懸液，加入到含有0. 001% 0. 01%的刃天青平的常規固體培養基平板的孔洞中，在30 40°C溫度下厭氧培養12 36h，挑選出變色圈明顯大于出發菌的菌落；f)搖瓶發酵篩選將步驟e)篩出的菌落接入種子培養基擴大培養，培養溫度 30 40°C，厭氧培養培養時間12 36h，然后在發酵培養基中發酵，接種量5% 15% (ν/ ν)，發酵溫度30 40°C，厭氧發酵發酵時間30 60h ；考察步驟d)和e)篩選出的菌落發 酵產總溶劑的量和溶劑中的丁醇比，同時選出總溶劑產量和丁醇比最高的菌落。在上述篩選方法中步驟a)中所述的離子誘變方法中，優選IOKeV作為離子注入 的能量，1.6X1016ions/cm2作為誘變劑量。在上述篩選方法中步驟c)、d)和e)所采用的常規固體培養基、碳源為木糖、淀粉 中的一種或者多種；氮源為有機或無機含氮化合物，其中無機含氮化合物為乙酸銨、氯化銨 中的一種或多種，有機含氮化合物為蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米漿中的一種或多種；無 機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中的一種或多種，固體培養基中添加瓊脂。
在上述篩選方法中步驟f)所采用的種子培養基和發酵培養基中，1)碳源為木 糖；氮源為有機或無機含氮化合物，其中無機含氮化合物為乙酸銨、氯化銨中的一種或多 種，有機含氮化合物為蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米漿中的一種或多種；無機鹽為鈉鹽、鉀 鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽、亞鐵鹽中的一種或多種。或者2)種子培養基和發酵培養基為，20 80g/L玉米粉，煮沸后糊化0. 5 2h，補足揮發的水分，自然pH。三、本發明所述的丙酮丁醇梭桿菌Clostridium acetobutylicum XY16在發酵生 產丁醇中的應用，其具體過程如下平板培養將丙酮丁醇梭桿菌Clostridium acetobutylicum XY16接種至平板培 養基厭氧培養，培養溫度30 40°C，培養時間12 36h ；種子培養將平板培養的丙酮丁醇梭桿菌Clostridium acetobutylicum XY16接 種到種子培養基中，培養溫度30 40°C，250mL搖瓶裝液量100 150mL，石蠟液封1 3cm，培養時間12 36h ；
發酵產丁醇將種子培養液熱激1 5min，接種到發酵培養基中，接種量5% 15% (ν/ν)，發酵溫度30 40°C，250mL搖瓶裝液量100 150mL，石蠟液封1 3cm，發酵 培養時間為48 80h。其中，平板培養基、種子培養基和發酵培養基的組成為碳源為木糖；氮源為有機 或無機含氮化合物，其中無機含氮化合物為乙酸銨、氯化銨中的一種或多種，有機含氮化合 物為蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米漿中的一種或多種；無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽、磷 酸鹽、亞鐵鹽中的一種或多種，平板培養基中添加瓊脂；或者，平板培養基、種子培養基和發酵培養基的組分為種子培養基和發酵培養基 為，20 80g/L玉米粉，煮沸后糊化0. 5 2h，補足揮發的水分，自然pH，平板培養基中添加 瓊脂。本發明的有益效果在于本發明根據丙酮丁醇發酵代謝途徑中先產酸后產溶劑及高活力厭氧發酵細胞具 有較強還原力的特點，采用離子束誘變丙酮丁醇梭桿菌，首次利用木糖平板、溴甲酚綠平板 和刃天青平板聯合篩選高效利用木糖和淀粉，高溶劑產量和高丁醇比的發酵高產菌。利用 本發明的菌株和工藝進行發酵，以木糖作為唯一碳源，在5L發酵罐中總溶劑產量和丁醇產 量分別達到了 17. 8g/L和12. 9g/L，而出發菌株無法以木糖為唯一碳源發酵生產丁醇；以玉 米粉為原料，在5L發酵罐中總溶劑產量和丁醇產量分別達到了 20. 2g/L和15. 9g/L，比出發 菌株提高了 66. 9%和114.9%，丁醇比達到了 78.7%，具有重大的社會意義和經濟價值。


圖1丙酮丁醇梭桿菌的離子注入存活率曲線本發明的微生物分類命名為丙酮丁醇梭桿菌Clostridium acetobutylicum XY16，其保藏日期為2010年1月15日，保藏單位全稱為中國典型培養物保藏中心，簡稱 CCTCC，保藏編號為 CCTCC NO :M 2010011。
具體實施例方式實施例一
本實施例說明將丙酮丁醇梭桿菌原始菌株進行第一步離子束誘變的方法。丙酮丁醇梭桿菌原始菌株來源于自行篩選，具體方法如下1.用含有25g/L 丁醇的發酵篩選培養基對南京地區土壤樣品中的耐丁醇微生物 進行富集培養，篩選出能夠耐受25g/L 丁醇的菌株。將能夠生長的樣品管中的菌液在固體 平板培養基上劃線，37 0C培養48h，獲得單菌落。
其中，發酵篩選培養基丁醇1 %，酵母粉0. 2 %，蛋白胨0. 3 %，可溶性淀粉1 %，乙 酸銨0.2%，氯化鈉0.2%，硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.1%，磷酸氫二鉀0. 1 %，7水硫酸亞 鐵 0. 01%，pH6。2.將初篩獲得的單菌落挑至發酵篩選培養基中，37°C培養48h，檢測發酵產物中 總溶劑和丁醇的產量，選取總溶劑和丁醇產量最高的菌株，作為誘變菌株。其中，搖瓶發酵篩選培養基玉米粉5% (固型物含量40 50% )，混勻，煮沸后 糊化lh，補足揮發水分，pH自然。丙酮丁醇梭桿菌原始菌株進行第一步離子束誘變的方法如下用將保藏的自行篩選獲得的丙酮丁醇梭桿菌原始菌株活化培養，培養溫度30 40°C,250mL搖瓶裝液量100 150mL，石蠟液封2 5cm，培養時間12 18h，得到生長旺 盛、菌體粗壯的菌液；取新鮮培養的細胞稀釋至細胞濃度OD6tltl = 0. 05 0. 1，涂布于滅菌 的空培養皿中，無菌空氣吹干；用IOKeV注入不同劑量，脈沖方式每次注入5s，間隔15s。 離子注入誘變后，將菌膜洗脫下來，計算存活率。實驗結果如附圖1所示；由圖1可知， 1.6X1016ions/cm2是最佳的誘變劑量。實施例二本實例說明進一步篩選優良丙酮丁醇梭桿菌的方法。其中，所使用的培養基配方(％為質量百分比)(1)固體平板培養基酵母粉0.2%，蛋白胨0.3%，可溶性淀粉1%，乙酸銨 0.2%,氯化鈉0. 2 %，硫酸鎂0. 3 %，磷酸二氫鉀0. 1 %，磷酸氫二鉀0. 1 %，7水硫酸亞鐵 0. 01%，pH6。(2)木糖平板培養基玉米漿0. (固形物含量為40 50%)，木糖1%，乙酸 銨0. 2 %，氯化鈉0.2%，硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.1%，磷酸氫二鉀0. 1 %，7水硫酸亞鐵 0. 01%，瓊脂 1. 5%, pH5 7。(3) 2-脫氧-D-葡萄糖平板培養基酵母粉0. 2%，蛋白胨0. 3%，可溶性淀粉1%， 乙酸銨0.2%，氯化鈉0.2%，硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.1%，磷酸氫二鉀0.1%，七水硫酸 亞鐵0. 01%，瓊脂1. 5%，2_脫氧-D-葡萄糖0. 1%，pH5 7。(4)溴甲酚綠平板培養基酵母粉0. 2%，蛋白胨0. 3%，可溶性淀粉1%，乙酸銨 0.2%,氯化鈉0.2%，硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.1%，磷酸氫二鉀0.1%，七水硫酸亞鐵 0. 01%，瓊月旨1. 5%，溴甲酚綠0. 002%, pH5 7。(5)刃天青平板培養基酵母粉0. 2%，蛋白胨0. 3 %，可溶性淀粉1 %，乙酸銨 0.2%,氯化鈉0. 2 %，硫酸鎂0. 3 %，磷酸二氫鉀0. 1 %，磷酸氫二鉀0. 1 %，七水硫酸亞鐵 0. 01%，瓊脂 1. 5%，刃天青 0. 002%, pH5 7。(6)種子培養基酵母粉1 %，蛋白胨1 %，可溶性淀粉4%，乙酸銨0. 2 %，氯化鈉 0.2%,硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.1%，磷酸氫二鉀0. 1 %，7水硫酸亞鐵0. 01 %，pH6。
(7)搖瓶發酵篩選培養基I :玉米粉5% (固型物含量40 50%)，混勻，煮沸后 糊化lh，補足揮發水分，pH自然。(8)搖瓶發酵篩選培養基II 玉米漿0.8% (固型物含量40 50%)，木糖5%， 乙酸銨0.2%，氯化鈉0.2%，硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.1%，磷酸氫二鉀0. 1 %，7水硫酸 亞鐵 0. 01%,瓊脂 1. 5%，pH5 7。篩選步驟1、木糖平板篩選用生理鹽水洗出經離子束誘變的菌株，稀釋成不同濃度涂布于木糖平板上，在 37°C溫度下厭氧培養48h挑選出15株可以在木糖平板上生長的菌株。2、2-脫氧-D-葡萄糖平板篩選將木糖平板篩選出的15株突變株點植于2-脫氧-D-葡萄糖平板，放入37°C溫度下厭氧培養24h，其中4株生長情況顯著好于出發菌。3、溴甲酚綠平板和刃天青平板篩選溴甲酚綠平板篩選將2-脫氧-D葡萄糖平板篩選出的具有高淀粉酶活力的突 變株點植于固體培養基平板上，37°C厭氧培養12h，無菌生理鹽水制成菌懸液，加入到含有 0.01%的溴甲酚綠的常規固體培養基平板的孔洞中，在37°C溫度下厭氧培養24h，挑選出 變色圈明顯大于出發菌的菌落；刃天青平板篩選將上述篩選得到的菌株接種于固體培養基平板上，37°C厭氧培 養12h，無菌生理鹽水制成與上一步驟濃度相同的菌懸液，加入到含有0. 01 %的刃天青平 的常規固體培養基平板的孔洞中，在37°C溫度下厭氧培養12h，挑選出變色圈明顯大于出 發菌的菌落；最終菌株XY16和XYlO顯示了較強的木糖和淀粉利用效率，產酸能力和還原活力。4、發酵搖瓶篩選將菌株XY16、XY10和原始菌株接入種子培養基擴大培養，培養溫度37°C，250mL搖 瓶裝液量lOOmL，石蠟液封2 5cm，培養時間12h。然后在發酵培養基中發酵，接種量10% (ν/ν)，發酵溫度37°C，250mL搖瓶裝液量IOOmL,石蠟液封2 5cm，發酵時間48h后檢測各 菌株的總溶劑產量和丁醇產量如表1所示表 1
“~發酵時間總溶劑產量丁醇產量丁醇比
___(h)(g/L) (g/L) (%)
.出發菌株(培養基I ) 48 12l TA 63Λ~~ 「 j ΧΥ16(培養基 I) 48 15.7 11.1 70.7 L 」 XYlO (培養基 I ) 48 14.9 10.2 68.5 出發菌株(培養基II) 48 0 00
ΧΥ16(培養基 II) 48 12.8 8.6 67.1 ΧΥ10(培養基 II)_48_1^9_6.65 61經過平板組合篩選獲得的兩株突變株在發酵過程中總溶劑產量和丁醇產量均明 顯高于出發菌株，其中ΧΥ16具有最高的溶劑和丁醇產量，丁醇比也最高。這與組合平板篩 選的結果一致。實施例三
本實施例說明突變株XY16和XYlO的傳代穩定性。菌株XY16和XYlO傳代發酵試驗結果如表2所示表2 從實驗結果可知，經過7次連續傳代，兩株突變株的總溶劑產量和丁醇產量較穩 定，具有較好的傳代穩定性，可作為進一步研究和開發的生產菌株。實施例四本實施例說明丙酮丁醇梭桿菌Clostridium acetobutylicum XY16發酵生產丁醇 的工藝。本實施例所述的培養基配方(％為質量百分比)平板培養基酵母粉0. 2%，蛋白胨0. 3%，可溶性淀粉1 %，乙酸銨0.2%，氯化鈉 0.2%,硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.1%，磷酸氫二鉀0. 1 %，7水硫酸亞鐵0. 01 %，pH6。種子培養基玉米粉4%，煮沸后糊化1. 5h，補足揮發的水分，pH自然。發酵培養基玉米粉6%，煮沸后糊化1. 5h，補足揮發的水分，pH自然。將丙酮丁醇梭桿菌Clostridium acetobutylicum XY16接種至平板培養基厭氧 培養，培養溫度37°C，培養時間12h。將平板培養的XY16接種到種子培養基中，培養溫度 370C，250mL搖瓶裝液量lOOmL，石蠟液封2 5cm，培養時間12h ；將種子培養液熱激lmin， 接種到發酵培養基中，接種量10% (ν/ν)，發酵溫度37°C，250mL搖瓶裝液量IOOmL,石蠟液 封2 5cm，發酵培養12h，添加0. 2 %的乙酸和0. 3 %的丁酸，發酵培養72h后檢測總溶劑 產量和丁醇產量分別達到了 18. 6g/L和13. 7g/L，比出發菌株提高了 53. 7%和85. 1%，丁醇 比達到了 73.6%。實施例五本實施例說明丙酮丁醇梭桿菌Clostridium acetobutyicum XY16發酵生產丁醇 的工藝。本實施例所述的培養基配方(％為質量百分比)平板培養基酵母粉0. 3%，蛋白胨0. 5%，可溶性淀粉1 %，乙酸銨0. 2 %，氯化鈉 0.2%，硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0. 1%，磷酸氫二鉀0. 1%，7水硫酸亞鐵0.01%，？!1 6。種子培養基酵母粉1%，蛋白胨1%，可溶性淀粉4%，乙酸銨0.2%，氯化鈉 0.2%,硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.1%，磷酸氫二鉀0. 1 %，7水硫酸亞鐵0. 01 %，pH6。發酵培養基玉米漿1. 6 %，木糖8 %，乙酸銨0. 2 %，氯化鈉0.2%，硫酸鎂0.3%， 磷酸二氫鉀0. 1 %，磷酸氫二鉀0. 1 %，7水硫酸亞鐵0. 01 %，pH6。將丙酮丁醇梭桿菌Clostridium acetobutylicum XY16接種至平板培養基厭氧培養，培養溫度37°C，培養時間12h。將平板培養的XY16接種到種子培養基中，培養溫度370C，250mL搖瓶裝液量lOOmL，石蠟液封2 5cm，培養時間12h。將種子培養液熱激lmin， 接種到發酵培養基中，接種量10% (ν/ν)，發酵溫度37°C，250mL搖瓶裝液量IOOmL,石蠟液 封2 5cm，發酵培養12h，添加0. 2 %的乙酸和0. 3 %的丁酸，發酵培養72h后檢測總溶劑 產量和丁醇產量分別達到了 16. 6g/L和11.7g/L，丁醇比達到了 70.5%。實施例六本實施例說明丙酮丁醇梭桿菌Clostridium acetobutylicum XY16發酵生產丁醇 的工藝。本實施例所述的培養基配方(％為質量百分比)平板培養基酵母粉0. 3%，蛋白胨0. 5%，可溶性淀粉1 %，乙酸銨0.2%，氯化鈉 0.2%，硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.1%，磷酸氫二鉀0. 1 %，7水硫酸亞鐵0. 01 %，pH6。種子培養基酵母粉1%，蛋白胨1%，可溶性淀粉4%，乙酸銨0.2%，氯化鈉 0.2%,硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.1%，磷酸氫二鉀0. 1 %，7水硫酸亞鐵0. 01 %，pH6。發酵培養基木糖5%，玉米粉3. 5%，煮沸后糊化1. 5h，補足揮發的水分，pH自然。將丙酮丁醇梭桿菌Clostridium acetobutylicum XY16接種至平板培養基厭氧 培養，培養溫度37°C，培養時間12h。將平板培養的XY16接種到種子培養基中，培養溫度 370C，250mL搖瓶裝液量lOOmL，石蠟液封2 5cm，培養時間12h。將種子培養液熱激lmin， 接種到發酵培養基中，接種量10% (ν/ν)，發酵溫度37°C，250mL搖瓶裝液量IOOmL,石蠟液 封2 5cm，發酵培養12h，添加0. 2%的乙酸和0. 3%的丁酸，發酵培養72h后檢測總溶劑 產量和丁醇產量分別達到了 17. 2g/L和12. 3g/L，丁醇比達到了 71. 5%。實施例七本實施例說明丙酮丁醇梭桿菌Clostridium acetobutylicum XY16在5L發酵罐 中發酵生產丁醇的工藝。本實施例所述的培養基配方(％為質量百分比)平板培養基酵母粉0. 2%，蛋白胨0. 3%，可溶性淀粉1 %，乙酸銨0. 2%，氯化鈉 0. 2%，硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0. 1%，磷酸氫二鉀0. 1%，7水硫酸亞鐵0.01%，？!1 6。種子培養基玉米粉4%，煮沸后糊化1. 5h，補足揮發的水分，pH自然。發酵培養基玉米粉6%，煮沸后糊化1. 5h，補足揮發的水分，pH自然。將丙酮丁醇梭桿菌Clostridium acetobutylicum XY16接種至平板培養基厭氧培 養，培養溫度37°C，培養時間12h。將平板培養的XY16接種到種子培養基中，培養溫度37°C， 250mL搖瓶裝液量lOOmL，石蠟液封2 5cm，培養時間12h ；將種子培養液熱激lmin，接種 到裝有3L發酵培養基的5L發酵罐中，接種量10% (ν/ν)，發酵溫度37°C，發酵過程中連續 通入氮氣，流速為0. 8L/min,發酵培養12h，添加0. 2 %的乙酸和0. 3 %的丁酸，發酵培養72h 后檢測總溶劑產量和丁醇產量分別達到了 20. 2g/L和15. 9g/L，比出發菌株提高了 66. 9% ^P 114.9%, 丁醇比達到 7 78. 7 %0實施例八本實施例說明丙酮丁醇梭桿菌Clostridium acetobutylicum XY16在5L發酵罐 中發酵生產丁醇的工藝。本實施例所述的培養基配方(％為質量百分比)
平板培養基酵母粉0. 3 %，蛋白胨0. 5 %，可溶性淀粉10A，乙酸銨0.2%，氯化鈉 0.2%,硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.1%，磷酸氫二鉀0. 1 %，7水硫酸亞鐵0. 01 %，pH6。種子培養基酵母粉1%，蛋白胨1%，可溶性淀粉4%，乙酸銨0.2%，氯化鈉 0.2%,硫酸鎂0.3%，磷酸二氫鉀0.1%，磷酸氫二鉀0. 1 %，7水硫酸亞鐵0. 01 %，pH6。發酵培養基玉米漿1. 6 %，木糖8 %，乙酸銨0. 2 %，氯化鈉0.2%，硫酸鎂0.3%， 磷酸二氫鉀0. 1 %，磷酸氫二鉀0. 1 %，7水硫酸亞鐵0. 01 %，pH6。將丙酮丁醇梭桿菌Clostridium acetobutylicum XY16接種至平板培養基厭氧培 養，培養溫度37°C，培養時間12h。將平板培養的XY16接種到種子培養基中，培養溫度37°C， 250mL搖瓶裝液量lOOmL，石蠟液封2 5cm，培養時間 12h。將種子培養液熱激lmin，接種 到裝有3L發酵培養基的5L發酵罐中，接種量10% (ν/ν)，發酵溫度37°C，發酵過程中連續 通入氮氣，流速為0. 8L/min,發酵培養12h，添加0. 2 %的乙酸和0. 3 %的丁酸，發酵培養72h 后檢測總溶劑產量和丁醇產量分別達到了 17. 8g/L和12. 9g/L，丁醇比達到了 72. 5%。
權利要求
一株丙酮丁醇梭桿菌菌株，其分類命名為Clostridium acetobutylicum XY16，其保藏號登記號為CCTCC NOM 2010011。
2.根據權利要求1所述的丙酮丁醇梭桿菌菌株的篩選方法，其特征在于將丙酮丁醇梭 桿菌出發菌株離子束誘變后，利用木糖平板和2-脫氧-D-葡萄糖平板篩選得到能夠高效利 用木糖和淀粉的丙酮丁醇菌株，再利用溴甲酚綠平板、刃天青平板篩選得到產酸能力和還 原力強的菌株，最后經搖瓶發酵篩選獲得總溶劑產量和丁醇比高的丙酮丁醇梭桿菌目標菌 株。
3.根據權利要求2所述的篩選方法，其特征在于，具體的篩選步驟如下a)離子束誘變將丙酮丁醇梭桿菌原始菌株活化培養，培養溫度30 4(TC，250mL搖 瓶裝液量100 150mL，石蠟液封2 5cm，培養時間12 18h，得到生長旺盛、菌體粗壯的菌 液，將培養的細胞稀釋5 10倍，涂布于滅菌的空培養皿中，用無菌空氣吹干；以5 15KeV 作為離子注入的能量，以1. 0 2. OX 1016ions/cm2作為誘變劑量對菌株進行離子束誘變；b)木糖平板篩選菌株經離子誘變后，用生理鹽水洗出，稀釋成不同濃度涂布于以 0. 5 2%的木糖作為唯一碳源的平板上，在30 40°C溫度下厭氧培養24 72h，挑選出 在該平板上能夠生長的菌落；c)2-脫氧-D-葡萄糖平板篩選將步驟b)篩選出的突變株點植于含有0. 05 0. 2%的 2-脫氧-D-葡萄糖的常規固體培養基平板上進行篩選，在30 40°C溫度下厭氧培養12 36h，挑選生長情況顯著好于出發菌的菌落；d)溴甲酚綠平板篩選將步驟c)篩選的菌株接種于常規固體培養基平板上，30 40°C厭氧培養12 36h，無菌生理鹽水制成濃度相同的菌懸液，加入到含有0. 001% 0. 01%的溴甲酚綠的常規固體培養基平板的孔洞中，在30 40°C溫度下厭氧培養12 36h，挑選出變色圈明顯大于出發菌的菌落；e)刃天青平板篩選將步驟d)篩選的菌株接種于常規固體培養基平板上，30 40°C 厭氧培養12 36h，無菌生理鹽水制成濃度相同的菌懸液，加入到含有0. 001 % 0. 01 %的 刃天青平的常規固體培養基平板的孔洞中，在30 40°C溫度下厭氧培養12 36h，挑選出 變色圈明顯大于出發菌的菌落；f)搖瓶發酵篩選將步驟e)篩出的菌落接入種子培養基擴大培養，培養溫度30 400C，厭氧培養培養時間12 36h，然后在發酵培養基中發酵，接種量5% 15% (ν/ν)，發 酵溫度30 40°C，厭氧發酵發酵時間30 60h ；考察步驟d)和e)篩選出的菌落發酵產總 溶劑的量和溶劑中的丁醇比，同時選出總溶劑產量和丁醇比最高的菌落。
4.根據權利要求3所述的篩選方法，其特征在于所述的步驟a)中離子誘變采用IOKeV 作為離子注入的能量，1.6X1016ions/cm2作為誘變劑量。
5.根據權利要求1所述的丙酮丁醇梭桿菌菌株在發酵生產丁醇中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于所述的具體應用步驟如下1)平板培養將丙酮丁醇梭桿菌Clostridiumacetobutylicum XY16接種至平板培養 基厭氧培養，培養溫度30 40°C，培養時間12 36h ；2)種子培養將平板培養的丙酮丁醇梭桿菌Clostridiumacetobutylicum XY16接種 到種子培養基中，培養溫度30 40°C，250mL搖瓶裝液量100 150mL，石蠟液封1 3cm， 培養時間12 36h ；3)發酵產丁醇將種子培養液熱激1 5min，接種到發酵培養基中，接種量5% 15% (ν/ν)，發酵溫度30 40°C，發酵培養時間為36 80h。
7. —種權利要求1所述的丙酮丁醇菌株在生產丁醇中的應用，其特征在于利用丙酮 丁醇菌株XY16發酵，總溶劑產量達到16 23g/L，丁醇比達到了 64 75%。
全文摘要
本發明涉及一株能快速利用木糖和淀粉發酵生產丁醇的丙酮丁醇梭桿菌及其篩選方法和用途。本發明公開了一種丙酮丁醇梭桿菌，分類命名為Clostridium acetobutylicumXY16，其保藏登記號為CCTCC NOM2010011。本發明通過離子束誘變，木糖平板、2-脫氧-D-葡萄糖平板、溴甲酚綠平板和刃天青平板篩選，得到的菌株能高效快速利用木糖和淀粉發酵生產丁醇，其總溶劑產量高、丁醇比高，重復性好，是一種適合工業生產的優良菌種。
文檔編號C12R1/145GK101864389SQ20101017644
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月18日 優先權日2010年5月18日
發明者何冰芳, 吳斌, 姜岷, 柏中中, 歐陽平凱, 靳孝慶 申請人:南京工業大學