專利名稱：產河豚毒素的氣單胞菌從暗紋東方鲀組織分離、發酵培養和所產河豚毒素的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種從暗紋東方飩Takifugu fasciatus組織分離產河豚毒素的氣單 胞菌Aeromonas molluscorum，氣單胞菌的發酵培養及所產河豚毒素的檢測方法，本發明涉 及藥用微生物開發和利用的領域，更具體地涉及從細菌中提取河豚毒素，可用作河豚毒素 的規模化生產，可為科學研究、醫藥行業等相關領域提供原料。
背景技術：
河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)，是一種神經毒素，特異性阻斷神經細胞細胞膜上 的電壓門控鈉離子通道，可潛在地作為鎮痛、麻醉、戒毒、美容等的藥品，臨床實踐證明了 TTX對頭痛、關節炎、破傷風、霍亂、傷寒、哮喘、百日咳、晚期癌癥等多種疾病都有一定療效 目前，河豚毒素的應用還主要局限在科學研究領域。雖然河豚毒素的人工合成成功了，但合成成本非常昂貴，目前，人工提取的河豚毒 素主要來自于于東方飩屬的河飩。一方面，目前國內外TTX的提取的原材料全部來源于野 生河豚的內臟組織，人工養殖的河豚內臟組織幾乎不含TTX或含量極低，僅為野生河豚魚 TTX含量的1%，由于野生河飩魚數量有限、且原料昂貴、提取成本也相對較高。因為另一方 面，從河飩中提取河豚毒素，會破壞河飩魚的天然資源。因此，有必要從其它生物資源中提 取河豚毒素。已有很多研究表明河飩體內的河豚毒素，是來自其體內的某些細菌所分泌的，但 細菌分泌的河豚毒素和來自河豚體內的河豚毒素是否完全一樣，還沒有定論。如果兩者是 同一物質，那么通過分離篩選產河豚毒素的細菌，再經過微生物發酵技術，就可以大規模的 TTX,降低生產成本，也會相應地保護野生河飩魚的資源。雖然，目前國內已經有從紅鰭東方飩Takifugu obscurus中分離能產河豚毒素細 菌的報道，但這些細菌所分泌的產物是否為真正的河豚毒素，還需要更嚴格的檢測鑒定。 目前鑒定從河飩中提取的河豚毒素的常見方法有小鼠法、高效液相色譜法、質譜法、酶聯免 疫法等，其中，最可靠的方法是質譜法和酶聯免疫法。質譜法可以鑒定分子量，酶聯免疫法 可以幫助鑒定有相似或相同的分子結構。在目前還不清楚細菌來源的河豚毒素晶體三維結 構的情況下，應該需要同時利用高效液相色譜-質譜和酶聯免疫法來鑒定細菌來源的河豚 毒素，否則，很難確定細菌來源的河豚毒素和河豚來源的河豚毒素是同一物質。

發明內容
本發明的目的在于提供一種從野生暗紋東方飩(Takifugu obscurus)卵巢中分離 的能產河豚毒素的氣單胞菌Aeromonas molluscorum的方法，包括分離氣單胞菌Aeromonas molluscorum所用的方法、氣單胞菌Aeromonasmolluscorum發酵培養方法、氣單胞菌 Aeromonas molluscorum所產河豚毒素的競爭性ELISA檢測方法、氣單胞菌Aeromonas molluscorum所產河豚毒素的LC-MS檢測方法。
河飩為暖溫帶及熱帶近海底層魚類，棲息于海洋的中、下層，有少數種類進入淡 水江河中，當遇到外敵，腹腔氣囊則迅速膨脹，使整個身體呈球狀浮上水面，同時皮膚上的 小刺豎起，借以自衛。每年3月由外海游至江河口的咸淡水區域產卵。唯有暗紋東方飩 (Takifugu obscurus，英文名0bscure puffer) 一種成群溯河進入淡水，5-6月在江河中有 產卵；懷卵量一般在4-5萬粒間。秋季水溫下降，開始降河，和其它種類一樣游向深海區，12 月初返回深海區越冬。當年出生的幼魚在江河或通江的湖泊中生活，到翌年春才回到海里， 在海里長大至性成熟后再復進入江河產卵。進入長江的河飩于4-6月，在中游江段或洞庭 湖、鄱陽湖中產卵。河飩的食性雜，以魚、蝦、蟹、貝殼類為食，亦食昆蟲幼蟲、枝角類、橈足類 以及高等植物的葉片和絲狀藻類。在生殖洄游期間一般很少攝食。暗紋東方飩Takifugu obscurus中分離出能產河豚毒素的細菌 Aeromonasmolluscorum的方法，該細菌所產的河豚毒素與河豚來源的河豚毒素一樣或非常 相似，可用作河豚毒素的商業開發和相關的科學研究。產河豚毒素的氣單胞菌(Aeromonas molluscorum)，保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心。保藏地址中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學 院微生物研究所郵編100101。保藏日期2010年4月23日，保藏編號CGMCC N0. 3760。
本發明所需要解決的技術問題，可以通過以下技術方案來實現作為本發明的第一方面，一種產河豚毒素的氣單胞菌Aeromonasmolluscorum從 暗紋東方飩Takifugu fasciatus組織分離方法，其特征在于，包括如下步驟(1)取具河飩毒素(TTX)的暗紋東方飩組織。(2)勻漿處理，并以生理鹽水1 10的比例制成稀釋液，取Iml稀釋液涂布于TCBS
固體培養基上。(3) 23°C培養48h，以挑取平板上的特征菌落，劃線于另一 TCBS固體培養基上。(4)23°C培養24h，再將分離到的單菌落再次劃線分離培養。(5)重復劃線分離培養，直到分離到單菌落。其中，步驟⑴所述組織為卵巢組織。其中，所述TCBS固體培養基的組成為0. 5%酵母抽提物，0.5%酪蛋白胨，0.5% 牛肉蛋白胨，1.0%檸檬酸鈉，1.0%硫代硫酸鈉，0.5%牛膽汁，0.3%膽酸鈉，2.0%蔗糖， 1. 0%氯化鈉，0. 檸檬酸鐵，0. 004%百里酚藍，0. 004%溴酚藍，1. 4%瓊脂，余量為蒸餾 水，pH 8. 6。利用16S rDNA全長序列鑒定細菌的方法(1)將分離得到的菌株基因組DNA的提取；(2) 16S rDNA 全長序列的 PCR 擴增，上游引物5，-AGA GTT TGA TCC TGGCTC AG-3，，下游引物:5，-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3，；(3)25μ 1 PCR 反應體系中，包括2. 5μ 1 IOxPCR 反應緩沖液，1 μ 1 2. 5mM dNTP， IU Taq酶，各Ιμ 6. 25mM的上下游引物，細菌基因組DNA50ng ；(4)PCR反應程序95°C預變性5min后，進行30個循環95°C lmin,50°C lmin，72°C 延伸2min。最后72°C延伸IOmin0(5)將16S rDNA全長序列的擴增產物純化回收；(6)回收的產物克隆在pMD18-T載體中；
(7)轉化大腸桿菌T0P10 ；(8)挑選陽性克隆測序。(9)測序結果經BLAST N在GenBank比對，獲得同源性較高的序列；(10)利用MEGA 4. 0軟件進行聚類分析，確定該分離的菌株為氣單胞菌Aeromonas molIuscorum0作為本發明的第二方面，所述氣單胞菌Aeromonas molluscorum的發酵培養方法， 其特征在于，包括如下步驟(1)將細菌接種在ORI液體培養基中；(2) 23°C 下，225 轉 / 分鐘，培養 5-6 天。其中，所述ORI液體培養基的組成為0. 2%動物蛋白胨，0. 2%植物蛋白胨，0. 1% 酵母抽提物，0.088%檸檬酸鐵，3% NaCl，余量為蒸餾水，pH 8.0。作為本發明的第三方面，所述的氣單胞菌Aeromonas molluscorum所產河豚毒素 的競爭性酶聯免疫吸附試驗方法(即競爭性ELISA)檢測方法，其特征在于，包括如下步 驟(1)在0-250叫/1111范圍內分別把0、50、100、150、200、250叫/1111的河豚源的河豚毒
素標準樣品先固定在微孔板上；(2)在微孔板中加入河豚毒素單克隆抗體MAb_TTX(購自商業公司(北京中衛食品 衛生科技公司)，分光光度計檢測吸光值，以Ao表示；(3)建立河豚毒素濃度在0-250ng/ml范圍的標準曲線；(4)發酵培養的河豚毒素和河豚毒素單克隆抗體MAb-TTX —起加入微孔板中，分 光光度計檢測吸光值，以Ai表示；(5)Ai/Ao比例，得出氣單胞菌Aeromonas molluscorum的細菌源河豚毒素的濃度。作為本發明的第四方面，所述的氣單胞菌Aeromonas molluscorum所產河豚毒素 的液相色譜質譜(即LC-MS)檢測方法，其特征在于，包括如下步驟(1)氣單胞菌Aeromonas molluscorum細菌發酵培養后，4°C下4000Xg離心3Omin 收集細胞；(2)用0. 乙酸溶解細胞，超聲波破碎細胞；(3) 100°C煮20-25min，冷卻后離心去除細胞碎片；(4)上清用直徑0. 25 μ m濾紙過濾；(5)過濾液過活性碳柱，用洗脫液洗脫活性碳，洗脫液的配方為甲醇的乙 酸溶液=20 80;(6)洗脫液45°C減壓至0. 001-0. 003MPa濃縮，冷凍干燥；(7)溶于2ml無菌去離子水中；(8)過 IX80cm 的 Bio-Gel P2 柱子(Bio-Rad Lab, Richmond, VA, USA)；(9)用0.03M乙酸洗脫，從洗脫液流出開始收集，收集2ml ；(10)洗脫液再用 C18 Sep-Pak cartridges 過柱(Waters，Milford, ΜΑ)；(11)用IOmlO. 3%的乙酸洗脫，從第二個柱體積洗脫液流出開始收集，收集兩個 柱體積的洗脫液；
(12)將洗脫液過濾；(13)過濾液冷凍干燥后，溶解在Iml無菌去離子水中；(14)利用系統來分析河豚
毒素；(15)對河豚毒素質譜分析。其中，步驟(10)所述C18 Sep-Pak cartridges在使用前，需要用IOml甲醇和IOml
水清洗。其中，步驟(12)洗脫液用 3000MW cut-off Ultrafree microcentrifugefilter (Micron YM-3, Waters)過濾。其中，步驟(14)利用ACQUITY Ultra Performance LC system(UPLC) (Waters, Milford,MA)系統來分析河豚毒素。其中，步驟(15)河豚毒素質譜分析利用Quadrupole-Time of Flight MassSpectrometry (Q-T0F MS) (Waters, Milford, MA)。本發明的有益效果1)本發明是通過選擇合適的培養基TCBS分離到能產河豚毒素的細菌。2)本發明所提供的細菌氣單胞菌Aeromonas molluscorum能分泌與河豚源河豚 毒素一樣的物質。


以下結合附圖和具體實施方式
來進一步說明本發明。圖1為氣單胞菌Aeromonas molluscorum細菌全長16S rDNA的細菌鑒定。圖2為氣單胞菌Aeromonas molluscorum的細菌源河豚毒素鑒定的競爭性酶聯免 疫吸附試驗的定量結果。圖3為離子色譜圖表明來自氣單胞菌Aeromonas molluscorum細菌源樣品(A)和 河豚毒素標準品(B)都在m/z 320. 11出現。圖4為氣單胞菌Aeromonas molluscorum細菌源樣品(A)和河豚毒素標準品(B) 的質譜圖。
具體實施例方式為了使本發明的技術手段、創作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合具 體圖示，進一步闡述本發明。實施例1從野生暗紋東方飩Takifugu fasciatus的卵巢中分離氣單胞菌 Aeromonasmolluscorum的方法,可按照以下步驟操作(1)選取野生暗紋東方飩Takifugu fasciatus活體，發明人采集自中國，江蘇省。(2)用95%酒精擦洗消毒魚體體表，用無菌解剖刀、剪刀和鑷子解剖魚體，取出卵桌。(3)用無菌的勻漿器勻漿卵巢，并以0.9%的生理鹽水以1 10的比例制成稀釋 液，(4)取Iml稀釋液涂布于TCBS固體培養基上，23°C培養48h。
(5)挑取培養基上的特征菌落，劃線于另一 TCBS固體培養基上，(6)23°C培養24h，再將分離到的單菌落重新劃線分離培養，(7)重復劃線分離培養，直到分離到足夠純的單菌落。(8)分離到的各個單菌落用作細菌鑒定分離氣單胞菌Aeromonas molIuscorum的TCBS固體培養基組成如下0.5%酵母抽提物，0.5%酪蛋白胨，0. 5%牛肉蛋白胨，1.0%檸檬酸鈉，1.0%硫代 硫酸鈉，0.5%牛膽汁，0.3%膽酸鈉，2.0%蔗糖，1.0%氯化鈉，0. 檸檬酸鐵，0. 004%百 里酚藍，0. 004%溴酚藍，1. 4%瓊脂，余量為蒸餾水，pH8. 6。實施例2利用16S rDNA全長序列鑒定Aeromonas molluscorum細菌的方法，可按照以下步 驟操作(1)將分離到的細菌菌株接種在液體培養基ORI中。(2) 23 °C 下，225 轉 / 分鐘，培養 5-6 天。(3)提取菌株基因組DNA。(4) 16S rDNA全長序列的PCR擴增，所用的上游引物5，_AGA GTT TGA TCCTGG CTC AG-3，，下游引物:5，-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T_3，。(3) 25 μ 1 PCR反應體系中，包括2. 5 μ 1 IOxPCR 反應緩沖液，1 μ 1 2. 5mM dNTP,IU Taq 酶，各1 μ 1 6. 25mM的上下游引物，細菌基因組DNA50ng。(4) PCR 反應程序95°C預變性 5min 后。進行30 個循環95°C Imin，50 °C Imin，72°C 延伸 2min。最后72°C延伸 lOmin。(5)將16S rDNA全長序列的擴增產物純化回收。(6)回收的產物克隆在pMD18-T載體中。(7)轉化大腸桿菌T0P10。(8)挑選陽性克隆測序。(9)測序結果經BLAST N在GenBank比對，獲得同源性較高的序列。(10)利用 MEGA 4. 0 軟件進行聚類分析，確定 Aeromonas molluscorum。(11)結果如圖1所示，該分離的菌株為氣單胞菌Aeromonas molluscorum。氣單胞菌Aeromonas molIuscorumORI液體培養基的組成為0. 2 %動物蛋白胨，0. 2 %植物蛋白胨，0. 1 %酵母抽提物，0. 088 %檸檬酸鐵，3 % NaCl，余量為蒸餾水，pH 8.0。實施例3氣單胞菌Aeromonas molluscorum的細菌源河豚毒素鑒定的競爭性酶聯免疫吸附 試驗方法，包括以下步驟進行
(1)在0-250叫/1111范圍內分別把0、50、100、150、200、250叫/1111的河豚源的河豚毒
素標準樣品先固定在微孔板上；(2)在微孔板中加入購自商業公司(北京中衛食品衛生科技公司)的河豚毒素單 克隆抗體MAb-TTX，分光光度計檢測吸光值，以Ao表示；(3)建立河豚毒素濃度在0-250ng/ml范圍的標準曲線。(4)發酵培養河豚毒素和河豚毒素單克隆抗體MAb-TTX —起加入微孔板中，分光 光度計檢測吸光值，以Ai表示；(5)Ai/Ao比例，可以得知氣單胞菌Aeromonas molluscorum細菌源河豚毒素的濃度。(6)結果如圖2所示的河豚毒素競爭性酶聯免疫吸附試驗的定量結果。實施例4氣單胞菌Aeromonas molluscorum細菌源河豚毒素鑒定的液相色譜質譜檢測方 法，包括如下步驟(I)Aeromonas molluscorum 細菌發酵培養后，4°C下 4000Xg 離心 30min 收集細 胞；(2)用0. 乙酸溶解細胞，超聲波破碎細胞；(3) 100°C煮約20min，冷卻后離心去除細胞碎片；(4)上清用直徑約0. 25 μ m濾紙過濾；(5)過濾液過活性碳柱，用洗脫液洗脫活性碳，洗脫液的配方為甲醇的乙 酸溶液=20 80;(6)洗脫液45°C減壓至0. 001-0. 003MPa濃縮，冷凍干燥；(7)溶于2ml無菌去離子水中；(8)過 IX80cm 的 Bio-Gel P2 柱子(Bio-Rad Lab, Richmond, VA, USA)；(9)用0.03M乙酸洗脫，從洗脫液流出開始收集，收集2ml ；(10)洗脫液再用 C18 Sep-Pak cartridges 過柱(Waters，Milford, MA), C18 Sep-Pak cartridges在使用前，需要用IOml甲醇和IOml水清洗；(11)用IOmlO. 3%的乙酸洗脫，從第二個柱體積洗脫液流出開始收集，收集兩個 柱體積的洗脫液；(12)洗脫液用 3000MW cut-off Ultrafree microcentrifuge filter (Micron YM-3, Waters)過濾；(13)過濾液冷凍干燥后，溶解在Iml無菌去離子水中；(14)利用 ACQUITY Ultra Performance LC system(UPLC) (Waters, Milford, MA) 系統來分析河豚毒素；(15) 可月豕普 禾lJffl Quadrupole-Time of Flight MassSpectrometry (Q-T0F MS) (Waters, Milford, MA)；(16)結果如圖4所示的質譜圖，(A)為來自Aeromonas molluscorum細菌源樣品； (B)為河豚毒素標準品。在本發明中，采用從暗紋東方飩卵巢中分離細菌，采用TCBS培養基進行篩選，首 次從河豚魚體中分離到能產河豚毒素的氣單胞菌Aeromonasmolluscorum，所分離的細菌采用了 16S rDNA法進行了鑒定。分離到的氣單胞菌所產的河豚毒素首次采用競爭性酶聯免疫吸附試驗檢測方法 (競爭性ELISA)和液相色譜質譜檢測方法(LC-MS)，同時檢測的方法，競爭性酶聯免疫吸附 試驗適用于河豚毒素的檢測，靈敏度高。本發明的所要檢測的河豚毒素為大分子、熱不穩定 化合物，所以選擇液質聯用儀。明確所產河豚毒素與從河豚體內提取的河豚毒素為同一種 物質。本發明所分離的氣單胞菌Aeromonas molluscorum，經培養后可從細菌中大規模 分離河豚毒素。以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發明的優點。本行業的技術 人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本 發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下本發明還會有各種變化和改進，這些變 化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其 等同物界定。
權利要求
1.一種產河豚毒素的氣單胞菌Aeromonas moIluscorum從暗紋東方飩Takifugu fasciatus組織分離方法，其特征在于，包括如下步驟(1)取具河飩毒素(TTX)的暗紋東方飩卵巢組織；(2)勻漿處理，并以生理鹽水1 10的比例制成稀釋液，取Iml稀釋液涂布于TCBS固體培養基上；(3)23°C培養48h，以挑取平板上的特征菌落，劃線于另一TCBS固體培養基上；(4)23°C培養24h，再將分離到的單菌落再次劃線分離培養，(5)重復劃線分離培養，直到分離到單菌落。
2.根據權利要求1所述的產河豚毒素的氣單胞菌從暗紋東方飩組織分離方法，其特征 在于，其中，所述組織為卵巢組織。
3.根據權利要求1所述的產河豚毒素的氣單胞菌從暗紋東方飩組織分離方法，其特 征在于，所述的TCBS固體培養基的組成為0. 5%酵母抽提物，0. 5%酪蛋白胨，0. 5%牛肉 蛋白胨，1. 0 %檸檬酸鈉，1. 0%硫代硫酸鈉，0. 5 %牛膽汁，0. 3 %膽酸鈉，2. 0 %蔗糖，1. 0 % 氯化鈉，0. 檸檬酸鐵，0. 004%百里酚藍，0. 004%溴酚藍，1. 4%瓊脂，余量為蒸餾水，pH 8. 6。
4.一種如權利要求1所述氣單胞菌Aeromonas molluscorum的發酵培養方法，其特征 在于，包括如下步驟(1)將細菌接種在ORI液體培養基中；(2)23°C下，225轉/分鐘，培養5-6天。
5.根據權利要求4所述的氣單胞菌的發酵培養方法，其特征在于，其特征在于，所 述ORI液體培養基的組成為0. 2%動物蛋白胨，0.2%植物蛋白胨，0. 酵母抽提物， 0. 088%檸檬酸鐵，3% NaCl，余量為蒸餾水，pH 8. 0。
6.一種如權利要求4所述的氣單胞菌Aeromonas molluscorum所產河豚毒素的競爭性 酶聯免疫吸附試驗檢測方法，其特征在于，包括如下步驟(1)在0-250ng/ml范圍內分別把0、50、100、150、200、250ng/ml的河豚源的河豚毒素標 準樣品先固定在微孔板上；(2)在微孔板中加入河豚毒素單克隆抗體MAb-TTX，分光光度計檢測吸光值，以Ao表示；(3)建立河豚毒素濃度在0-250ng/ml范圍的標準曲線；(4)發酵培養的河豚毒素和河豚毒素單克隆抗體MAb-TTX—起加入微孔板中，分光光 度計檢測吸光值，以Ai表示；(5)Ai/Ao比例，得出氣單胞菌Aeromonasmolluscorum的細菌源河豚毒素的濃度。
7.一種如權利要求4所述的氣單胞菌Aeromonas molluscorum所產河豚毒素的液相色 譜質譜檢測方法，其特征在于，包括如下步驟(1)氣單胞菌Aeromonas molluscorum細菌 發酵培養后，4°C下4000 Xg離心30min收集細胞；(2)用0.乙酸溶解細胞，超聲波破碎細胞；(3)100°C煮20-25min，冷卻后離心去除細胞碎片；(4)上清用直徑0.25 μ m濾紙過濾；(5)過濾液過活性碳柱，用洗脫液洗脫活性碳，洗脫液的配方為甲醇的乙酸溶液=20 80 ；(6)洗脫液45°C減壓至0. 001-0. 003M Pa濃縮，冷凍干燥；(7)溶于2ml無菌去離子水中；(8)過lX80cm 的 Bio-Gel P2 柱子(Bio-Rad Lab, Richmond, VA, USA)；(9)用0.03M乙酸洗脫，從洗脫液流出開始收集，收集2ml ；(10)洗脫液再用C18 Sep-Pak cartridges 過柱(Waters，Milford，MA)；(11)用IOmlO.3%的乙酸洗脫，從第二個柱體積洗脫液流出開始收集，收集兩個柱體 積的洗脫液；(12)將洗脫液過濾；(13)過濾液冷凍干燥后，溶解在Iml無菌去離子水中；(14)利用系統來分析河豚毒素；(15)對河豚毒素質譜分析。
8.根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，步驟(10)所述ClSSep-Pak cartridges在使用前，需要用IOml甲醇和IOml水清洗。
9.根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，步驟(12)洗脫液用3000MWcut-off Ultrafree microcentrifuge filter 過濾。
10.根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，步驟(14)利用ACQUITYUltra Performance LC system UPLC系統來分析河豚毒素。
11.根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，步驟(15)河豚毒素質譜分析利用 Quadrupole-Time of Flight Mass Spectrometry。
全文摘要
一種產河豚毒素的氣單胞菌Aeromonas molluscorum從暗紋東方鲀Takifugu fasciatus組織分離、發酵培養和所產河豚毒素的檢測方法，包括細菌分離、細菌鑒定、細菌發酵培養、氣單胞菌所產河豚毒素的競爭性ELISA檢測和LC-MS檢測等方法。在本發明中，采用從暗紋東方鲀卵巢中分離細菌，采用TCBS培養基進行篩選，首次從河豚魚體中分離到能產河豚毒素的氣單胞菌，所分離的細菌采用了16SrDNA法進行了鑒定，分離到的氣單胞菌所產的河豚毒素首次采用競爭性ELISA和LC-MS同時檢測的方法，明確所產河豚毒素與從河豚體內提取的河豚毒素為同一種物質。本發明所分離的氣單胞菌，經培養后可從細菌中大規模分離河豚毒素。
文檔編號C12N1/20GK101993834SQ20101017936
公開日2011年3月30日 申請日期2010年5月20日 優先權日2010年5月20日
發明者楊桂梅, 鮑寶龍 申請人:上海海洋大學