專利名稱：表達抗炎細胞因子il-10的骨髓源神經干細胞的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種骨髓來源的、可表達抗炎細胞因子IL-10的新型神經干細胞系的 建立方法，及此種將細胞替代與基因治療結合為一體的新型神經干細胞對多發性硬化的治 療作用。
背景技術：
神經干細胞(Neural stem cell, NSCs)是指具有自我更新能力、并能分化為神經 元和神經膠質細胞(少突膠質、星形膠質細胞)的一組細胞群。近年來許多學者用神經干 細胞移植治療多發性硬化(multiple sclerosi^MS)、帕金森氏病、阿爾茨海默病等神經系 統疾病及神經損傷，取得了顯著治療效果。但該神經干細胞來源于胚胎或成體動物的側腦 室周圍和海馬等區域，取材困難、損傷較大，胚胎來源的神經干細胞無法回避免疫排斥和道 德倫理等問題，降低了臨床治療的可行性[1_3]。因此，尋找取材方便、來源豐富、無免疫排斥 的神經干細胞的新來源具有重要的意義。骨髓間充質干細胞具有較強的自我更新和多分化 潛能，在一定條件下可分化為神經干細胞[4_5]，且取材容易，可直接抽取病人骨髓、經體外分 選而獲得，無免疫原性，來源豐富穩定，因而日漸受到人們的重視，可成為神經干細胞臨床 應用的一個理想的新來源。多發性硬化(multiple sclerosisJS)是一種常見的由自身免疫反應介導的中樞 神經系統炎性脫髓鞘疾病。病灶多發于腦和脊髓的白質，呈多灶性炎性細胞侵潤、脫髓鞘及 神經元損傷，可導致感覺、運動、意識和神經認知等多方面的功能障礙。該病多發于20-40 歲的青壯年人，復發率和致殘率高，是青壯年人非外傷性神經殘疾最常見的原因，迄今為止
還無法治愈[6_7]。神經干細胞的發現及成功分離，為MS患者的治療帶來了新的希望。本發明以自體 骨髓為來源的神經干細胞移植入體內后，能與腦源神經干細胞一樣遷移、整合入CNS病變 部位，分化為神經元及少突膠質細胞，成為髓鞘修復和神經元再生的潛在來源。但由于其抗 炎作用較弱，不能解除中樞持續性炎癥對髓鞘和神經元的損傷，因此治療效果不十分理想。 為增強其療效，我們選擇了白細胞介素10 (IL-10)，將其基因轉入骨髓源神經干細胞(Bone Marrow-NSCs，BM-NSCs)。IL-10是一種抗炎細胞因子，主要由Th2類細胞產生，可抑制T細 胞增殖分化，抑制單核細胞、巨噬細胞和NK細胞的生物學活性，抑制Thl細胞產生致炎細 胞因子IL-2、IFN-γ等[3’8]。表達IL-10的新型BM-NSCs靜脈移植后不僅可在外周及中樞 發揮抗炎作用，保護中樞病變區的神經細胞免受或減輕炎癥反應的損害，維持神經元的存 活與髓鞘的完整性，而且還能促進神經干細胞分化為髓鞘修復與再生所必需的少突膠質細 胞，抑制形成MS病灶斑塊的星形膠質細胞增生，發揮神經修復/保護和免疫調節的雙重作 用，使療效顯著增強。綜上所述，本發明以自體骨髓為來源的神經干細胞不僅是一種理想的、無限制的 神經干細胞的新來源，還是基因治療的良好載體，可將細胞替代和基因治療有機地結合為 一體，為多發性硬化及其它神經系統疾病的治療提供了一種全新的途徑，具有十分廣闊的開發和應用前景。

發明內容
本發明的目的在于提供一種來源于骨髓、可表達抗炎細胞因子IL-10的新型神經 干細胞的制備方法，用于治療MS及其它多種神經系統疾病。為達到上述目的，本發明采用 如下技術方案—種表達抗炎細胞因子IL-10的骨髓源神經干細胞的制備方法，包括下述步驟一、小鼠骨髓源神經干細胞的生成與鑒定1、提取成年小鼠全骨髓細胞，用微珠標記抗體及磁性細胞分選儀 (MiltenyiBiotec)篩選出間充質干細胞[lineage_/CD117 (c_kit)+]，體外用 bFGF 和 EGF誘導分化為神經干細胞，經免疫組化染色、熒光顯微鏡檢測，證實與腦源神經干細胞 (SVZ-NSCs)具有相同的細胞表型，都表達Nestin與S0X2，可鑒定為未分化神經干細胞。見 附圖1。2、體外自我更新與分化能力的檢測繪制生長曲線，檢測其自我更新能力；以維 甲酸(RA)和BDNF為誘導劑，體外誘導分化2周，免疫組化檢測NF_M、NG2、GFAP的表達。結 果證實BM-NSCs與SVZ-NSCs具有相同的自我更新與分化為神經元和神經膠質細胞的能力。 見附圖2。二、構建IL-10和EGFP共表達的質粒、轉染骨髓源神經干細胞及檢測IL-10的表 達神經元(NF-M+)、少突膠質細胞前體細胞(NG2+)、星形膠質細胞(GFAP+)，少數細胞 仍維持于未分化狀態(Nestin+)。紅色神經細胞特異性標志蛋白陽性染色。放大倍數 100X?？寺⌒∈驣L-10基因、構建共表達IL-10和EGFP的逆轉錄病毒質粒，由CMV啟動 子驅動；以293T細胞包裝病毒；用病毒上清轉染BM-NSCs ；以免疫組化法和ELISA法檢測， 證實被轉染的BM-NSCs可有效表達IL-10。見圖3。三、IL-10基因修飾骨髓源神經干細胞移植治療多發性硬化動物模型UMS模型制作與骨髓源神經干細胞移植治療雌性C57BL/6小鼠(8_12周)皮下 注射髓鞘少突膠質細胞糖蛋白乳化液(M0G35-55)，200ug/只，誘導MS動物模型。22天后尾 靜脈注射IL-10基因修飾BM-NSCs (IL 10-BM-NSCs)和對照組BM-NSCs各1. 5 X IO6個細胞/ 只。結果顯示ILlO-BM-NSCs治療組臨床癥狀明顯較對照組減輕，證實IL-10表達明顯增強 了 BM-NSCs對MS的治療作用。見圖4。2、抗炎作用檢測骨髓源神經干細胞靜脈移植2周后取模型小鼠脾細胞，用ELISA 法檢測各種細胞因子的分泌。結果表明ILlO-BM-NSCs明顯降低了小鼠脾淋巴細胞分泌炎 性細胞因子IFN-r和IL-17，而增加了抗炎細胞因子IL_4、IL_5、IL-13的分泌，從而使抗炎 作用顯著增強。見圖5。3、體內分化、神經修復與髓鞘再生作用檢測靜脈移植6周后，取腦與脊髓制成冰 凍切片，免疫組化檢測NeuN、GalC、GFAP的表達，以GFP陽性作為外源性移植細胞的追蹤標 志；電鏡觀察髓鞘修復與再生。結果證實IL-10的表達促使BM-NSCs更多地分化為能修復 髓鞘的GalC+少突膠質細胞，抑制其分化為形成MS病灶斑塊的GFAP+星型膠質細胞；電鏡檢查結果證實IL-10的表達促進了髓鞘的修復與再生，使有髓鞘軸突所占百分率明顯增加。 見圖6。本發明提供一種制備神經干細胞的簡捷而有效的方法，制備的神經干細胞能為MS 患者帶來希望，并能治療其它多種神經系統疾病。


圖1為骨髓源神經干細胞(BM-NSCs)和腦源神經干細胞(SVZ_NSCs)的生成與鑒 定示圖。
圖2和圖3為BM-NSCs與SVZ-NSCs自我更新與分化能力的比較示圖。 圖4至圖7為構建IL-10與EGFP共表達質粒、轉染BM-NSCs及IL-10表達的檢測示圖。
圖8為IL-10的表達增強了骨髓源神經干細胞對MS的治療作用示圖。 圖9為IL-10的表達增強了骨髓源神經干細胞的抗炎作用示圖。 圖10至圖12為ILlO-BM-NSCs的體內分化及促進髓鞘修復與再生作用示圖。 圖1為骨髓源神經干細胞(BM-NSCs)和腦源神經干細胞(SVZ-NSCs)的生成與鑒定 示圖。從成年小鼠的腓骨中提取全骨髓細胞，用微珠標記抗體及磁性細胞分選儀篩選出 lineage7CD117(c-kit)+ 細胞，以 1. OX 105/ml 密度置于 DMEM/F12+bFGF 20ug/ml+EGF 20ug/ml+2%B27中培養，每隔3天換液一次。3_5周后誘導形成神經干細胞球(A)；分離 上述小鼠腦組織SVZ區細胞，以上述培養基培養，1-2周后形成神經干細胞球(B)。免疫組 化染色、熒光顯微鏡檢測結果顯示BM-NSCs與SVZ-NSCs細胞球及單個細胞都為Nestin (綠 色)和S0X2(紅色)陽性，可鑒定為未分化NSCs，兩者的細胞表型相同。藍色細胞核DAPI 染色。放大倍數神經球10X，單細胞85X。圖2為BM-NSCs與SVZ-NSCs自我更新與分化能力的比較示圖。㈧生長曲線測 定取第三代BM-與SVZ-NSCs神經球，打散成單細胞，以相同細胞密度(1.0X105/ml)置于 DMEM/F12+bFGF 20ug/ml+EGF 20ug/ml+2% B27 中培養。第 5，9，13，16 天分別取出，分散為 單細胞，計數，繪制生長曲線，結果顯示BM-與SVZ-NSCs增值速度無顯著差別；(B)體外分 化實驗將上述兩種神經球打散成單細胞，加入DMEM/F12+RA 15ug/ml+BDNF 20ug/ml中體 外分化，兩周后免疫組化檢測，顯示BM-NSCs與SVZ-NSCs都分化為神經元(NF-M+)、少突膠 質細胞前體細胞(NG2+)、星形膠質細胞(GFAP+)，少數細胞仍維持于未分化狀態(Nestin+)。 紅色神經細胞特異性標志蛋白陽性染色。放大倍數100X。圖3為構建IL-10與EGFP共表達質粒、轉染BM-NSCs及IL-10表達的檢測示圖。 (A)共表達IL-10與EGFP (Lv. IL-10)及只表達GFP (Lv. EGFP)的逆轉錄病毒載體結構圖， 由CMV啟動子驅動；⑶免疫組化法檢測IL-10的轉染與表達用293T細胞包裝病毒、收集 72小時內病毒上清液；用濃縮的病毒上清轉染BM-NSCs，3天后以免疫組化染色、熒光顯微 鏡檢測，顯示兩組BM-NSCs都顯著表達GFP (綠色)，說明兩組BM-NSCs都被病毒質粒有效 轉染，但IL-10 (紅色)只在ILlO-BM-NSCs中顯著表達，在對照組BM-NSCs幾乎不表達；(C) ELISA法檢測IL-10的表達轉染3天后取兩組BM-NSCs培養液上清，用ELISA法檢測兩組 上清液中IL-10含量。結果顯示在IL10-BM-NSCs上清中IL-10濃度高達710ng/ml，而在對 照組未能檢測到。以上結果說明IL-10基因修飾BM-NSCs能有效表達IL-10。
圖4為IL-10的表達增強了骨髓源神經干細胞對MS的治療作用示圖。雌性 C57BL/6小鼠(8-12周)皮下注射髓鞘少突膠質細胞糖蛋白乳化液(M0G35-55) 200ug/ 只誘導MS動物模型，22天后尾靜脈注射(i. v.) IL10-BM-NSCs和對照組GFP_BM_NSCs各 1.5X106/只。結果顯示，PBS組呈現典型的疾病進程，兩種干細胞治療組的病情明顯輕于 PBS組，而IL10-BM-NSCs對疾病的抑制作用較BM-NSCs更快更強。圖5為IL-10的表達增強了骨髓源神經干細胞的抗炎作用示圖。BM-NSCs移植2 周后取小鼠脾細胞，以1. 5X 106/ml細胞濃度置于RPMI 1640+10% FBS+10 μ g/ml M0G35-55 中培養。3天后取培養液上清，以ELISA法檢測各種細胞因子的含量。結果顯示，IL-10的表 達明顯降低了小鼠脾淋巴細胞分泌炎性細胞因子IFN-r和IL-17，而使抗炎細胞因子IL-4、 IL-5、IL-13的分泌明顯增加。< 0. 05，**p < 0. 01，PBS組與其它組的比較；#p < 0. 05， ##p < 0. 01，IL10-BM-NSCs 組與對照組 BM-NSCs 組的比較，η = 8。圖6為ILlO-BM-NSCs的體內分化及促進髓鞘修復與再生作用示圖。干細胞移植6 周后，取各組小鼠腦制成冰凍切片，免疫組化檢測BM-NSCs的體內分化，以GFP陽性作為外 源性移植干細胞的追蹤標志，結果顯示，IL-10的表達促使BM-NSCs更多地分化為GalC+少 突膠質細胞，較少地分化為GFAP+星型膠質細胞(A、B)。電鏡檢查結果顯示，IL-10的表達 促進了髓鞘的修復與再生，使有髓鞘軸突所占百分率明顯增加(C、D)。
具體實施例方式表達抗炎細胞因子IL-10的骨髓源神經干細胞的制備方法，包括如下步驟一、小鼠骨髓源神經干細胞的生成與鑒定1)、骨髓源神經干細胞(BM-NSCs)的生成與培養取8_12周C57BL/6小鼠的腓 骨，提取全骨髓細胞，用德國美天旎公司(Miltenyi Biotec)的微珠標記抗體及磁性細胞 分選儀(QuadroMACS S印arator)分兩步篩選出間充質干細胞。首先用系別細胞去除試 劑盒(Lineage Cell Depletion Kit)去除成熟造血細胞，如T細胞、B細胞、單核/巨噬 細胞、粒細胞和紅細胞以及定向祖細胞(⑶5+，⑶45+，CDllb+, Gr-I+, TERl 19+，7/4+)，保留系 別陰性細胞(lineage-)；再用抗 CDl 17 微(CDl 17 (c_kit)Microbeads)篩選出 lineage7 CD117(c-kit)+間充質干細胞，以 1 XlO5Ail 密度置于 DMEM/F12+bFGF 20ug/ml+EGF 20ug/ ml+2% B27中培養，每隔3天換液一次，3_5周后誘導形成神經干細胞球。結果見圖1A。2)、腦源神經干細胞(SVZ-NSCs)的體外培養分離上述小鼠腦組織SVZ區，切成 Icm3小塊，胰蛋白酶消化20π η、70μ m細胞濾網過濾，將提取出的細胞以IX 105/ml密度加 入DMEM/F 12+bFGF 20ug/ml+EGF 20ug/ml+2% B27中體外培養，1-2周后形成神經干細胞 球。結果見圖1B。3)、取第三代神經干細胞球及打散的單個神經干細胞，以抗小鼠Nestin和S0X2抗 體進行免疫組化染色、熒光顯微鏡檢測。結果顯示BM-NSCs與SVZ-NSCs都為Nestin和S0X2 陽性，可鑒定為未分化NSCs。結果見圖1A，B。2、骨髓源與腦源神經干細胞的自我更新與分化能力的比較，證實兩者具有相同的 自我更新與分化能力，都能分化為神經元與神經膠質細胞(圖2)。方法如下1)、生長曲線測定取第三代BM-與SVZ-NSCs神經球，打散成單細胞，以相同細胞 密度(1.0X105/ml)置于 DMEM/F 12+bFGF 20ug/ml+20ug/ml+2% B27 中培養。第 5，9，13，16天分別取出，分散為單細胞，計數，繪制生長曲線。結果顯示BM-與SVZ-NSCs增值速度 無顯著差別。結果見圖2A。2)、體外分化實驗將上述兩種神經球打散成單細胞，加入DMEM/F12+維甲酸 (RA) 15ug/ml+腦源性神經營養因子(BDNF) 20ug/ml中體外誘導分化。兩周后免疫組化鑒 定，證實BM-NSCs與SVZ-NSCs都分化為神經元(NF-M+)、少突膠質細胞前體細胞(NG2+)、星 形膠質細胞(GFAP+)，少數細胞仍維持于未分化狀態(Nestin+)。結果見圖2B。二、IL-10與EGFP共表達質粒的構建、轉染BM-NSCs及IL-10表達的檢測(圖3)。1、克隆小鼠IL-10基因，構建可共表達IL-10與EGFP的逆轉錄病毒表達質粒，由 CMV啟動子驅動；只表達EGFP的質粒作為對照。見圖3A。2、以293T細胞包裝病毒；收集72小時內病毒上清液；用濃縮的病毒上清轉染 BM-NSCs。3天后以免疫組化染色、熒光顯微鏡檢測，結果顯示兩組BM-NSCs都顯著表達GFP， 但IL-10只在IL10-BM-NSCs中顯著表達，在對照組BM-NSCs幾乎不表達(圖3B)；轉染3 天后取細胞培養上清，用ELISA法(IL-lOELISAKit，BD Bioscience)檢測兩組BM-NSCs的 IL-10表達量。結果顯示在IL10-BM-NSCs上清中IL-10濃度高達710ng/ml，而在對照組未 能檢測到IL-10 (圖3C)。三、IL-10基因修飾骨髓源神經干細胞移植治療MS動物模型(圖4，5，6)UMS動物模型的建立與骨髓源神經干細胞移植治療取雌性C57BL/6小鼠(8_12 周)，每組5只，皮下注射髓鞘少突膠質細胞糖蛋白乳化液(M0G35-55) 200ug/只，誘導MS動 物模型。22天后尾靜脈注射(i. v.) IL10-BM-NSCs與對照組BM-NSCs各1. 5X IO6/只，觀察、 記錄臨床評分的改變。結果顯示，PBS組呈現典型的疾病進程，兩個干細胞移植組的發病明 顯輕于PBS組，而IL10-BM-NSCs對疾病的抑制作用較BM-NSCs更快更強(圖4)。2、IL10-BM-NSCs的抗炎作用干細胞移植2周后取各組模型小鼠脾臟，用70 μ m 細胞濾網(BD Falcon)擠壓、過濾脾臟組織制成單細胞懸液，以1. 5X 106/ml細胞濃度置于 RPMI 1640+10% FBS+10 μ g/ml M0G35-55中培養。3天后取培養液上清，以ELISA法檢測各 種細胞因子的改變(IFN-r、IL-17、IL-4、IL-5、IL-13ELISA Kit, BD Bioscience)。結果顯 示，ILlO-BM-NSCs明顯降低了小鼠脾淋巴細胞分泌炎性細胞因子IFN_r和IL-17，增加了抗 炎細胞因子IL-4、IL-5、IL-13的分泌，從而使抗炎作用顯著增強(圖5)。3、IL10-BM-NSCs的體內分化、促進髓鞘修復與再生作用干細胞移植6周后，取 各組小鼠腦與脊髓，制成冰凍切片，免疫組化檢測NeuN、GalC, GFAP表達，以GFP陽性作為 外源性移植干細胞的追蹤標志。電鏡觀察髓鞘修復與再生。結果顯示，IL-10的表達促使 BM-NSCs更多地分化為能修復髓鞘的GalC+少突膠質細胞，抑制其分化為形成MS病灶斑塊 的GFAP+星型膠質細胞；電鏡檢查結果顯示，IL-10的表達促進了髓鞘的修復與再生，使有 髓鞘軸突所占百分率明顯增加(圖6)。
權利要求
表達抗炎細胞因子IL 10的骨髓源神經干細胞的制備方法，包括如下步驟1)、骨髓源神經干細胞的生成與培養取8 12周C57BL/6小鼠的腓骨，提取全骨髓細胞，用德國美天旎公司的微珠標記抗體及磁性細胞分選儀分兩步篩選出間充質干細胞；首先用系別細胞去除試劑盒去除成熟造血細胞，包括T細胞、B細胞、單核/巨噬細胞、粒細胞和紅細胞以及定向祖細胞CD5+，CD45+，CD11b+，Gr 1+，TER119+，7/4+，保留系別陰性細胞；再用抗CD117微篩選出lineage /CD117(c kit)+間充質干細胞，以1×105/ml密度置于DMEM/F12+bFGF 20ug/ml+EGF 20ug/ml+2％B27中培養，每隔3天換液一次，3 5周后誘導形成神經干細胞球；2)、腦源神經干細胞的體外培養分離上述小鼠腦組織SVZ區，切成1cm3小塊，胰蛋白酶消化20min、70μm細胞濾網過濾，將提取出的細胞以1×105/ml密度加入DMEM/F12+bFGF 20ug/ml+EGF 20ug/ml+2％B27中體外培養，1 2周后形成神經干細胞球；3)、取第三代神經干細胞球及打散的單個神經干細胞，以抗小鼠Nestin和SOX2抗體進行免疫組化染色、熒光顯微鏡檢測；結果顯示BM NSCs與SVZ NSCs都為Nestin和SOX2陽性，可鑒定為未分化NSCs；4)、骨髓源與腦源神經干細胞的自我更新與分化能力的比較，證實兩者具有相同的自我更新與分化能力，都能分化為神經元與神經膠質細胞；方法如下①、生長曲線測定取第三代BM 與SVZ NSCs神經球，打散成單細胞，以相同細胞密度置于DMEM/F12+bFGF 20ug/ml+EGF 20ug/ml+2％B27中培養；第5，9，13，16天分別取出，分散為單細胞，計數，繪制生長曲線；結果顯示BM 與SVZ NSCs增值速度無顯著差別；②、體外分化實驗將上述兩種神經球打散成單細胞，加入DMEM/F12+維甲酸15ug/ml+腦源性神經營養因子20ug/ml中體外誘導分化；兩周后免疫組化鑒定，證實BM NSCs與SVZ NSCs都分化為神經元NF M+、少突膠質細胞前體細胞NG2+、星形膠質細胞GFAP+，少數細胞仍維持于未分化狀態Nestin+。
全文摘要
本發明提供一種來源于骨髓、可表達抗炎細胞因子IL-10的新型神經干細胞的制備方法，包括①骨髓源神經干細胞的生成與培養、腦源神經干細胞的體外培養。②骨髓源與腦源神經干細胞的自我更新與分化能力的比較，并證實兩者具有相同的自我更新與分化能力，都能分化為神經元與神經膠質細能。本發明方法制備的神經干細胞能用于治療MS疾病及其它多種神經系統疾病，為多發性硬化及其它神經系統疾病的治療提供了一種全新的途徑，具有十分廣闊的應用前景。
文檔編號C12N5/10GK101914492SQ20101019379
公開日2010年12月15日 申請日期2010年6月8日 優先權日2010年6月8日
發明者孟憲生, 康廷國, 徐志立, 楊靜嫻, 王東 申請人:遼寧中醫藥大學