專利名稱：一株異戊酰螺旋霉素高含量主組分基因工程菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及利用調節基因構建高含量抗生素主組分的基因工程菌。
背景技術：
必特螺旋霉素(原名生技霉素)[專利號ZL97104440. 6]是利用基因工程技術研 制的螺旋霉素衍生物。螺旋霉素是一種大環內酯類抗生素，其主核是一個由16元環組成的 內酯環，與普拉特內酯同質，含有三個糖分子福洛糖胺、碳霉糖胺和碳霉糖。而必特螺旋霉 素主組分是螺旋霉素碳霉糖4’位羥基被異戊酰基酯化的衍生物。由于螺旋霉素內酯環3 位R羥基可以被乙酰或丙酰基酯化，而形成相應的螺旋霉素I、II、III組分，所以必特螺旋 霉素也至少含有異戊酰螺旋霉素I、II、III三個組分。必特螺旋霉素主組分的化學結構如 下
H3C"
H3C
OR'
福洛糖胺 其中
普拉特內酯 必特螺旋霉素結構
碳霉糖胺
碳霉糖異戊酰螺旋霉素III異戊酰螺旋霉素II異戊酰螺旋霉素I
R = COCH2CH3 R = COCH3 R = H
R’ = COCH2CH(CH3)2 R，= COCH2CH(CH3)2 R，= COCH2CH(CH3)2必特螺旋霉素對革蘭氏陽性菌有較強的活性，尤其對肺炎鏈球菌、肺炎支原體、衣 原體活性強，對紅霉素和β -內酰胺類抗生素耐藥菌、流感桿菌、軍團菌、產氣莢膜梭菌有 抗菌活性；與同類藥沒有完全交叉耐藥性。它有較高的親脂性，口服吸收快，組織滲透性強， 分布廣，體內維持時間長，有較好的抗生素后效應。前已完成基因工程必特螺旋霉素新藥的 三期臨床試驗研究，結果顯示了良好的療效和安全性。目前正在申報國家一類新藥證書。必特螺旋霉素主組分異戊酰螺旋霉素，是由異戊酰基轉移酶催化螺旋霉素分子中 的碳霉糖4”位羥基，進行0-酰基化反應，使碳霉糖4”位羥基異戊酰酯化而形成的。因此， 異戊酰基轉移酶的活性直接影響螺旋霉素的轉化率和異戊酰螺旋霉素的產率，而異戊酰轉 移酶的活性，又受基因劑量、基因啟動子強度和環境因素(即發酵條件)的影響與調節。已知來源于耐熱鏈霉菌的異戊酰基轉移酶基因ist與調節基因acyB2連鎖，調節 基因的存在可以激活ist基因的表達，含有完整ist和acyB2調節基因的變鉛青鏈霉菌 可以將67-79%泰洛菌素轉化為4”異戊酰泰洛菌素，而僅含有單個ist或ist與不完整 acyB2基因的變鉛青鏈霉菌，對泰洛菌素的轉化率僅為0-2. 4% [Arisawa A et al =BiosciBiotechnol Biochem 1993,57(12) :2020_2025]。將 ist 和 acyB2 基因轉入泰洛菌素產生 菌(Str印tomyces fradiae)，其轉化子經發酵可以產生4”異戊酰泰洛菌素[Arisawa A. et al J Antibiotics 1996,49 (4) :349_354]。acyB2調節基因與螺旋霉素產生菌(Str印tomyces ambofaciens)中的轉錄調控 蛋白 Srm28c 同源[Fatma Karray et al Microbiology 2007，153，4111-4122]，其一致性 (identity)為69%，與泰洛菌素產生菌(Str印tomyces fradiae)中的調控蛋白tylR的 一致性為41 %。tylR為泰洛菌素產生菌生物合成正調控蛋白，它調控泰洛菌素中一個聚 酮合酶模塊(tylGI)的表達，同時還對泰洛菌素糖基的合成和聚酮環的氧化起調控作用。 tylR基因在產生菌的高表達，可以提高泰洛菌素的產量[GeorgeS. etal Mol. Microbiology 2004，54(5) 1326-1334]。本實驗室曾利用基因工程技術將ist基因進行串連，使ist基因在螺旋霉素產 生菌中增加其拷貝數，通過增強其基因劑量提高產生菌異戊酰基化能力；同時也利用強啟 動活性的啟動子如紅霉素抗性基因ermE啟動子序列替換原ist基因啟動子序列，以增強 ist基因的表達，使基因工程菌產生異戊酰螺旋霉素主組分含量提高了 62% [專利申請號 200910148767. 8]。本發明的目的，旨在利用調節基因acyB2激活ist基因表達的特點，將ist與調節 基因acyB2在螺旋霉素產生菌中共表達，以提高菌種產生必特螺旋霉素主組分異戊酰螺旋
霉素的含量。本發明所述將acyB2調節基因與異戊酰基轉移酶基因ist連鎖，在螺旋霉素產生 菌中共表達，以構建高含量異戊酰螺旋霉素主組份菌株，迄今尚未見有相關報道。

發明內容
本發明提供的技術方案主要包括以下方面1.構建含ist_acyB2雙基因重組質粒pSET52_ia ；2.將重組質粒pSET52_ia轉入螺旋霉素產生菌，轉化子經發酵培養、提取，并以 HPLC定量分析異戊酰螺旋霉素的含量；3.以含ist單基因必特螺旋霉素菌株作為對照，比較ist-aCyB2基因引入螺旋霉 素菌株后獲得必特螺旋霉素產生菌，產生主組份異戊酰螺旋霉素的比例，證明acyB2調節 基因的引入能明顯提高菌種產生主組分異戊酰螺旋霉素的含量。發明效果本發明的積極效果在于，證明acyB2調節基因引入必特螺旋霉素產生菌，可以明 顯提高主組分異戊酰螺旋霉素比例213-232%，為工業化生產和臨床應用提供了重要保障。


圖1 ist_acyB2基因重組質粒pSET52_ia的構建；圖2含ist-aCyB2基因重組質粒pSET52_ia菌種WSJ-195-IA發酵產生異戊酰螺 旋霉素I、II、III組分HPLC分析；其中A WSJ-195為含單ist基因菌種對照；B WSJ-195-IA為本發明含 ist-acyB2基因重組質粒pSET52_ia菌種。
實施方案以下實施例僅為幫助本領域技術人員更好地理解本發明，但不以任何方式限制本 發明。《實施例1》_構建含ist_acyB2雙基因重組質粒pSET52_ia從本實驗室原先構建的重組質粒pSW4中[尚廣東等生物工程學報1999，15 (2) 171]，利用SmaI-BamHI酶切，獲得含ist完整基因和部分acyB2基因1820bp片段，以 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心提供的耐熱鏈霉菌(Str印tomyces thermotolarences CGMCC4. 1501)總DNA為模板，根據NCBI公布的acyB2序列，設計引物 pi :5’ -CGCTCAGGGACGCAAGACC-3，和 P2 :5’ -CCGGAATTCGCCCCGTGACCTCACCGTC-3‘ (EcoRI)， 通過PCR反應獲得acyB2部分基因1013bp片段，將PCR產物用BamHI-Ec0RI酶切，獲得 934bp 片段，將上述 SmaI-BamHI (1820bp)、BamHI-EcoRI (934bp)片段連入 pBluesript II KS (+)載體(Merck公司)的Smal-EcoRI酶切位點，獲得含ist和完整acyB2基因重組質粒 pBKS-ia。通過XbaI-EcoRI酶切位點連入大腸桿菌/鏈霉菌接合轉移質粒pSET152 (來自 基因酷共享資源www. genecool. com)，獲得ist_acyB2雙基因重組質粒pSET52_ia，構建流 程見圖1。《實施例2》重組質粒pSET52_ia轉化螺旋霉素產生菌螺旋霉素產生菌(S. spiramyceticus)菌種來源于中國醫學科學院醫藥生物技 術研究所菌種保藏中心(CGMCC4. 1118)，該菌種的描述已經公開發表[微生物學報1982， 22(1) :13-16]。菌種在斜面培養基[黃豆餅粉2.0%，葡萄糖1.0%，淀粉3.0%，CaCO3 0. 5%,NaCl 0.4%，瓊脂 2.0% ]上 28°C培養 7-10 天，按照文獻[D. A. Hopwood 等 Genetic manipulation of Streptomyces,ALaboratory Manual, Norwich ；John Innes Foundation UK, 1985]描述的方法制備原生質體。具體來說，是將菌種挖塊接種至含蔗糖R2YE培養基 [蔗糖10. 3 %，葡萄糖1.0%，酵母提取液0. 4%，胰蛋白胨0. 2 %，蛋白胨0. 4%，酪蛋白氨 基酸 0.4%,K2SO4 0. 025%, CaCl2 0. 216%, KH2PO4 0. 005%, MgCl2 ‘ 6H20 1.012%]，在 IOOml 培養基中加入 Na0H(lmol/L)0. 5ml, Tris-HCl (0. 25mol/LpH7. 2) 10ml，微量元素溶液 (ZnCl2 0. 04%, FeCl3 ‘ 6H20 0. 02%, CuCl2 0. 001%, MnCl ‘ 4H200. 001%, Na2B4O7 ‘ 10H20 0. 001%, (MM)6MO7O2 · 4H20 0. 0012% )0. 2ml]，28°C培養 2-4 天，以 10%接種量轉種上述 培養基，并加入0. 5%甘氨酸，培養20小時，離心收集菌絲，用10. 3%蔗糖溶液洗滌2-3次， 在含溶菌酶 2mg/ml 的 P 溶液[Tris-HCl (pH8. 0) lmol/L 0.31ml，CaCl2 · 2H20 0. 368 %, MgCl2 · 6H20 0. 204 %，蔗糖10. 3 %，葡萄糖0. 1 %，微量元素溶液0. 2ml]中，37 °C溶菌 15-60分鐘，經棉花過濾獲得原生質體。將重組質粒pSET52-ia在PEG介導下轉入原生質 體，并涂布于R2YE固體培養基，28°C培養24小時后，用含阿泊拉霉素溶液覆蓋培養物，使 阿泊拉霉素在培養基中的終濃度為50微克/毫升，繼續培養7-10天挑取轉化子。獲得含 重組質粒pSET52-ia的螺旋霉素產生菌，即螺旋霉素鏈霉菌，分類命名為str印tomyces spiramyceticus，并于2010年6月25日送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心保藏，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號CGMCC No. 3943，參椐的生物 材料:ffSJ-195-IA0《實施例3》:WSJ-195-IA菌種發酵提取產物鑒定WSJ-195-IA菌種在上述斜面培養基28°C培養7_10天，挖塊接種于種子培養基
5黃豆餅粉 1. 5%，淀粉 3. 0%，NaCl 0. 4%, CaCO3 0. 5%，魚蛋白胨 0. 3%，KH2PO4 0. 05%, 28°C培養48小時，轉入發酵培養基葡萄糖0. 5%，淀粉6. 0%，酵母粉0. 5%，魚粉2. 0%， NH4NO3 0. 6%, NaCl 1. 0%, CaCO3 0. 5%, KH2PO4 0. 05%, MgSO4 0. 1 %，28°C發酵培養 96 小 時。發酵液過濾，調PH至8. 5，用等量乙酸乙酯提取，濃縮乙酸乙酯提取液至干，溶于甲醇。 WSJ-195-IA菌種發酵提取產物經HPLC分析，采用Kromasil C18柱(4. 5_X 150_，5 μ m)； 流動相甲醇磷酸二氫鈉溶液(體積比53 47)；檢測波長23Inm ；流速1. OmL -min"1 ； 柱溫25°C ；進樣量10-20yL。檢測并計算產物中異戊酰螺旋霉素組分I、II、III，以此確 定總異戊酰螺旋霉素的含量(圖2B)，結果表明，WSJ-195-IA菌種發酵產生主組分異戊酰螺 旋霉素總量為42%。《實施例4》調節基因提高菌種發酵產生異戊酰螺旋霉素組分的含量WSJ-195-IA與含ist單基因的WSJ-195 [專利號ZL02148771. 5]菌種對照，按照 實施例3的方法發酵培養，用乙酸乙酯提取產物，進行HPLC分析(圖2A)。比較兩者產生異 戊酰螺旋霉素Ι、Π、ΙΙΙ三組分的情況(表一)。結果表明，調節基因提高菌種產生異戊酰 螺旋霉素總含量213% (按峰面積計算)或232% (按峰高計算)。表一 .WSJ-195與WSJ-195-IA菌種產生異戊酰螺旋霉素組分產量HPLC分析 以上實驗研究結果證明，本發明提供了一株含acyB2調節基因的必特螺旋霉素產 生菌種，所述菌種在一定發酵條件下，比原來只含ist基因的菌種產生主組分異戊酰螺旋 霉素含量提高了 213-232%。
權利要求
一株異戊酰螺旋霉素主組分高含量的基因工程菌，它是一株含異戊酰基轉移酶基因ist與acyB2調節基因重組質粒的螺旋霉素產生菌克隆菌株。
2.構建制備權利要求1所述基因工程菌的方法，其主要步驟包括A)構建含ist_acyB2雙基因重組質粒pSET52_ia；B)將重組質粒pSET52-ia轉入螺旋霉素產生菌，獲得含重組質粒pSET52_ia的螺旋霉 素產生菌，命名為WSJ-195-IA，菌種保藏編號CGMCC No. 3943 ；OWSJ-195-IA菌種發酵培養、提取；D)HPLC定量分析主組分異戊酰螺旋霉素的含量。
全文摘要
本發明涉及利用調節基因構建高含量抗生素主組分的基因工程菌，所述基因工程菌，是將acyB2調節基因與異戊酰基轉移酶基因ist連鎖，在螺旋霉素產生菌中共表達的產物；實驗研究表明，該菌株可以明顯提高主組分異戊酰螺旋霉素比例213-232％，為工業化生產和臨床應用提供了重要保障。
文檔編號C12N1/21GK101914481SQ20101023757
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月23日 優先權日2010年7月23日
發明者倪四陽, 周紅霞, 姜洋, 戴劍漉, 楊生武, 林靈, 武臨專, 王以光, 赫衛清, 郝玉有 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所;沈陽同聯集團有限公司