專利名稱：成體大鼠肝臟卵圓細胞系及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種成體大鼠肝臟卵圓細胞系，屬于醫學生物技術領域。
背景技術：
盡管器官移植是目前臨床上治療終末期肝病較為安全、且行之有效的方法，然而供體肝臟短缺導致許多重癥肝衰竭患者在等待肝源的過程中死去，因而細胞移植有望成為替代器官移植治療終末期肝衰竭最值得期待的選擇。由于成熟肝細胞很難在體外大量擴增培養而且在培養過程中其肝臟特異性功能逐漸喪失，嚴重限制了應用成熟肝細胞移植治療肝臟疾病的開展。由于肝臟干/前體細胞(h印atic stem/progenitor cells)不僅具有較強的增殖能力，而且具有分化為具有功能的成熟肝細胞的能力，因此，應用肝干/前體細胞替代肝臟器官移植治療肝臟疾病成為最值得期待的一種選擇。肝臟卵圓細胞在1956 年由 Farber (Cancer Res, 1956,16(2) :142 148.)首次在乙硫氨酸和2-乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene，2-AAF)共同處理的大鼠肝組織中發現并命名，二十世紀八十年代由Thorgeirsson等(Cancer Res, 1987,47(20)力469 M75. Cancer Res，1989，49 (6) :1541 1547.)證明為成體大鼠肝臟前體細胞，既往(Cancer Res, 1988,48(2) :368 378. H印atology，1997，25 O) :3 334.)通常依據不同類型的細胞密度具有差別的原理，采用密度梯度介質通過密度梯度離心的方法獲得該細胞，但不可避免的混有少量細胞密度與之相近的細胞而造成細胞純度不高的問題。

發明內容
本發明要解決的第一個技術問題是提供一種特性穩定、成分均一的成體大鼠肝臟卵圓細胞系rHOC，它能夠表達肝臟前體細胞的標志物；并能在體外條件下連續傳代培養 100代且持續表達肝臟前體細胞的標志物，是良好的肝臟前體細胞研究模型。本發明要解決的第二個技術問題是提供一種成體大鼠肝臟卵圓細胞系的制備方法。本發明要解決的第三個技術問題是提供所述成體大鼠肝臟卵圓細胞系rHOC在體內外定向誘導肝細胞中的應用，以及在制備生物人工肝中的應用。而且該細胞系還可以用于治療肝臟遺傳代謝性疾病、肝纖維化或肝硬化疾病的研究。為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案本發明所述的成體大鼠肝臟卵圓細胞系rHOC經鑒定確定為成體大鼠肝臟卵圓細胞，定名為rHOC，已于2010年7月23日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，并證明存活，其保藏登記編號為CGMCC No. 4057。保存地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼100101。所述成體大鼠肝臟卵圓細胞系rHOC具有以下生物學特性(1)細胞呈典型的上皮細胞形態，連續傳代培養100代仍保持該形態特點； (2)細胞具有較強的增殖能力，但生長存在接觸抑制和密度抑制現象，連續傳代培養100代仍保持該增殖和生長特性；(3)細胞表達肝臟前體細胞標志物肝臟卵圓細胞標志物(h印atic oval eellmarker, 0V-6, Santa Cruz)陽性率 87. 2 Notch 配基 Delta 樣蛋白(delta drosophi lahomolog-1 ike 1，Dlk, Abeam)陽性率 99. 1 %、甲胎蛋白(α -fetoprotein, AFP, R&D)陽性率98 %、白蛋白(albumin，ALB, Bethyl)陽性率96 %、細胞角蛋白 19(cytokeratin 19，CK19，R&D)陽性率92%，連續傳代培養100代細胞仍保持上述免疫表型。為解決上述第二個技術問題，本發明提供一種成體大鼠肝臟卵圓細胞系的制備方法，該方法包括以下步驟(1)用含0. 1 %乙硫氨酸(Sigma-Aldrich)的膽堿缺乏性飼料喂養大鼠6周；(2)麻醉大鼠后無菌條件下行門靜脈插管，并進行原位灌流以去除血細胞；(3)切下肝組織，用含0. 1 %膠原酶(Sigma-Adlrich)溶液循環灌注以離散肝組織；(4)將步驟(3)灌流后的肝組織置于120目銅網上剪碎組織并研磨以獲得單細胞懸液；(5)收集步驟⑷的單細胞懸液并于4°C條件下1500rpm離心5分鐘以得到細胞沉淀；(6)將步驟(5)的細胞沉淀重懸于蛋白酶E(Sigma-Adlrich)溶液中37°C孵育60 分鐘以去除肝細胞；(7)加入等體積的含10%胎牛血清(Gibco)的DMEM/F12培養基(Gibco)，混合均勻后經孔徑20 μ m尼龍膜過濾；(8)將濾液上樣至1. 35g/ml和1. 70g/ml Percoll (Pharmacia)不連續密度梯度介質上，4°C條件下2000rpm離心20分鐘；(9)收集兩層密度梯度介質間的細胞，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基洗3 次，于4°C條件下1，500rpm離心5分鐘，棄去上清液；(10)將步驟(9)的細胞沉淀重懸于完全培養基[含10%胎牛血清、0. 5U/ml胰島素(Sigma-Adlrich)、lng/ml 表皮細胞生長因子(Epithelial growth factor, EGF, PeProiTech)、0· 5ng/ml 干細胞生長因子(Stem cell factor, SCF, PeProTech)、100U/ml 青霉素、lOOyg/ml鏈霉素的DMEM/F 12培養基]中，按2. 5 X 104/cm2接種細胞懸液于膠原包被的組織培養皿中，置于37°C，5% CO2培養箱中培養；(11)每隔2天更換新鮮的完全培養基一次；(12)待細胞形成克隆后(約7 14天)，應用克隆環挑取上皮細胞克隆置于新的培養瓶中繼續培養，即得成體大鼠肝臟卵圓細胞；(13)待細胞長至90%匯合時應用胰蛋白酶溶液消化，常規傳代培養。本發明的優點是本發明聯合應用密度梯度離心和克隆環純化的方法獲得了純度較高的肝臟卵圓細胞，該細胞呈典型上皮細胞形態，具有較強的增殖能力，但生長仍具有接觸抑制與密度抑制現象，表達的肝臟前體細胞標志物肝臟卵圓細胞標志物(0V-6)、Notch 配基Delta樣蛋白(Dlk)、甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)和細胞角蛋白19(CK19)；細胞連續傳代培養48個月已傳至100代，仍然保持上述形態特點、生長和增殖特性以及免疫表型，不同于培養的成熟肝細胞既難于體外大量擴增且細胞功能逐漸喪失的特點，因此，該細胞是一種特性穩定、成分均一的成體大鼠肝臟前體細胞，是良好的肝臟前體細胞研究模型。


下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細的說明圖1為相差顯微鏡下成體大鼠肝臟卵圓細胞的形態；圖2為成體大鼠肝臟卵圓細胞流式細胞檢測鑒定結果；圖3為成體大鼠肝臟卵圓細胞熒光顯微鏡檢測鑒定結果；圖4為成體大鼠肝臟卵圓細胞生長曲線；圖5為成體大鼠肝臟卵圓細胞染色體倍體分析結果；圖6為誘導分化后成體大鼠肝臟卵圓細胞糖原染色結果，A 對照，B:丁酸鈉;圖7為誘導分化后成體大鼠肝臟卵圓細胞白蛋白分泌結果；圖8為誘導分化后成體大鼠肝臟卵圓細胞氨代謝結果。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。實施例1 成體大鼠肝臟卵圓細胞分離、原代培養一、實驗材料和試劑1.實驗動物:150g SD大鼠；實驗動物飼料含0. 乙硫氨酸(Sigma-Aldrich) 的膽堿缺乏性大鼠飼料由北京實驗動物中心制備。2.灌流緩沖液含20mM HEPES的D_Hank，s平衡鹽溶液。3.循環緩沖液含0. 膠原酶(Sigma-Adlrich)的Hank’ s平衡鹽溶液。4.酶緩沖液含0. 膠原酶(Sigma-Adlricti)、0. 1 %蛋白酶E(Sigma-Adlricti)、 0. 025%胰蛋白酶(Sigma-Adlrich)、0· 02% EDTA、0. 004% DNase I (Sigma-Adlrich)的PBS 溶液。5. DMEM/F12液體培養基、胎牛血清均為Gibco公司產品6. Percoll 為 Pharmacia 公司產品7.完全培養基含10%胎牛血清、0. 5U/ml胰島素(Sigma-Adlrich)、lng/ml表皮細胞生長因子(Epithelial growth factor，EGF，PeProiTech)、0. 5ng/ml 干細胞生長因子 (Stem cell factor，SCF，PeProTecti)、lOOU/ml 青霉素、100 μ g/ml 鏈霉素的 DMEM/F12 培養基。二、實驗方法1.喂養動物應用含0. 1 %乙硫氨酸的膽堿缺乏性大鼠飼料喂養大鼠6周。2.應用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，無菌條件下打開腹腔暴露門靜脈，門靜脈插管， 用灌流緩沖液進行原位灌流，20ml/min灌流至肝臟蒼白。3.將肝組織切下，用50ml循環緩沖液循環灌流15分鐘。4.將肝組織放入120目銅網中，用剪刀將組織剪成小塊，研磨組織并用循環緩沖液沖洗，收集濾液，4°C條件下1500rpm離心5分鐘。
5.棄上清液，將細胞重懸于酶緩沖液中，37°C孵育60分鐘。6.加入等體積的含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，混合均勻后經孔徑20 μ m 尼龍膜過濾。7.將濾液上樣至1. 35g/ml和1. 70g/ml Percoll不連續密度梯度介質上，4°C條件下2000rpm離心20分鐘。8.收集兩層密度梯度介質間的細胞，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基洗3 次，每次用5ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基重懸細胞，于4°C條件下1，500rpm離心 5分鐘，棄去上清液。9.取0. 2ml細胞懸液加入0. 4ml臺盼藍染液混勻，分別計數活細胞數和死細胞數， 并計算活細胞占總細胞的比例。10.將細胞重懸于完全培養基中，按2. 5 X IOVcm2接種細胞懸液于膠原包被的組織培養皿中，置于37°C，5% CO2培養箱中培養。11.每隔2天更換新鮮的完全培養基一次。12.待細胞形成克隆后(約7 14天)，應用克隆環挑取上皮細胞克隆置于新的培養瓶中繼續培養，即得成體大鼠肝臟卵圓細胞。三、實驗結果如圖1所示相差顯微鏡下，成體大鼠肝臟卵圓細胞呈鋪路石樣，為典型的上皮細胞形態。實施例2 成體大鼠肝臟卵圓細胞的傳代培養與凍存保種一、試劑1.胰蛋白酶溶液含 0. 25%胰蛋白酶(Sigma-Adlrich)、0· 02% EDTA 的 PBS.2.凍存液含10% DMS0、40%胎牛血清的DMEM/F12培養基。二、實驗方法1.待細胞生長至90%匯合時，棄去舊培養基，加入aiil PBS輕旋培養瓶浸洗細胞。2.棄去PBS，再加入anlPBS洗細胞一次。3.棄去PBS，加入胰蛋白酶溶液使其剛好覆蓋細胞，倒置相差顯微鏡下觀察消化情況，待細胞突起回縮時迅速棄去消化液。4.加入完全培養基anl，以終止胰蛋白酶的作用，吸取瓶內培養基反復輕柔吹打細胞。5.收集吹下的細胞置于15ml離心管中，混勻后取10 μ 1細胞懸液計數。6.其余細胞懸液于4°C條件下1，OOOrpm離心5分鐘，棄去上清液。7.將細胞沉淀打散，按計數結果用胚胎肝臟細胞完全培養基制備成1 X 107ml細胞懸液，部分細胞按1. O X IOVcm2接種于培養瓶中繼續培養，部分細胞凍存保種。8.用于凍存保種細胞于4°C條件下1，OOOrpm離心5分鐘，棄去上清液，應用凍存液重懸細胞制備成2 XlO6Ail細胞懸液，按每管Iml分裝至1. 8ml凍存管中，于凍存管上注明細胞名稱、細胞數和凍存日期。獲得的大鼠肝臟卵圓細胞rHOC已于2010年7月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏登記編號為CGMCC No. 4057，建議分類命名為成體大鼠肝臟卵圓細胞。
實施例3 成體大鼠肝臟卵圓細胞的鑒定一、試劑1.多聚甲醛固定液含4%多聚甲醛的PBS2.皂素破膜劑含0. 1 %皂素的PBS3. Triton X-100 破膜劑含 0. 3% Triton X-100 的 PBS4.小鼠抗大鼠卵圓細胞標志物(hepatic oval cell marker, 0V-6)抗體為美國 Santa Cruz ^15]/^! 5. ^,ifiA^M Notch KS Delta S (delta drosophila homolog—like 1， Dlk)抗體為美國Abeam公司產品6.小鼠抗人甲胎蛋白(α -fetoprotein, AFP)抗體為美國R&D公司產品7.兔抗大鼠白蛋白(albumin，ALB)抗體為美國Bethyl公司產品8.小鼠抗人細胞角蛋白19(cytokeratinl9，CK19)抗體為美國R&D公司產品9. Alexa Fluro488標記雞抗兔IgG和Alexa Fluro594標記羊抗小鼠IgG為美國 Molecular Probe 公司產品二、實驗方法1.間接免疫熒光結合流式細胞儀測定細胞內抗原的表達(1).取對數生長期成體大鼠肝臟卵圓細胞制備成單細胞懸液，按5X IO5/管分裝細胞于流式細胞儀專用管中。(2).用PBS洗滌細胞三次，每次:3ml。(3).棄盡上清液后，加入500 μ 1多聚甲醛固定液混勻后室溫固定20分鐘。(4).用PBS洗滌細胞三次，每次3ml。(5).棄盡上清液后，加入500 μ 1皂素破膜劑混勻后室溫孵育15分鐘。(6). 1，OOOrpm離心5分鐘，棄盡上清液后，加入500 μ 1封閉用正常小鼠或兔血清
混勻后室溫孵育20分鐘。(7). 1，OOOrpm離心5分鐘，棄盡上清液后，加入10 μ 1抗體(小鼠抗大鼠0V-6抗體或兔抗人Dlk抗體)混勻；對照細胞加入10 μ 1 PBS，室溫孵育1小時。(8).用皂素破膜劑洗滌細胞3次，每次:3ml。(9). 1，OOOrpm離心5分鐘，棄盡上清液后，加入5 μ 1 Alexa Fluro594標記羊抗小鼠IgG或Alexa Fluro488標記雞抗兔IgG混勻，室溫避光孵育30分鐘。(10).用皂素破膜劑洗滌細胞3次，每次:3ml。(11).棄盡上清液后，加入500 μ 1 PBS混勻。(12).經400目銅網過濾后于BD FACSCalibur流式細胞儀測定分析陽性細胞比例。2.間接免疫熒光結合熒光顯微鏡觀察細胞內抗原的表達(1).取對數生長期成體大鼠肝臟卵圓細胞，按2. 5 X IOVcm2接種于M孔板中，于 37°C,5% CO2培養箱中培養48小時。(2).棄去上清液，用PBS浸洗細胞三次。(3).棄盡上清液，加入500 μ 1多聚甲醛固定液，室溫固定20分鐘。(4).棄去上清液用PBS浸洗細胞三次，每次500 μ 1 PBS浸洗5分鐘。
(5).棄盡上清液，加入500 μ 1 Triton X-IOO破膜劑，室溫孵育5分鐘。(6).棄去上清液用PBS浸洗細胞三次，每次500 μ 1 PBS浸洗5分鐘。(7).棄盡上清液，加入200 μ 1封閉用正常小鼠血清室溫孵育20分鐘，ALB染色用明膠進行封閉。(8).棄去封閉液，加入200 μ 1抗體[小鼠抗人AFP抗體(1 400倍稀釋)、兔抗大鼠ALB抗體(1 400倍稀釋)、小鼠抗人CK19抗體(1 400倍稀釋)]，于4°C孵育過
夜。 (9).棄盡抗體，用PBS浸洗細胞三次，每次500 μ 1 PBS浸洗5分鐘。(10).棄盡上清液，加入200 μ 1熒光素標記的相應二抗(Alexa Fluro488標記雞抗兔IgG或Alexa Fluro594標記羊抗小鼠IgG，均為1 200倍稀釋)，室溫避光孵育30 分鐘。(11).棄去抗體，用PBS浸洗細胞三次，每次500 μ 1 PBS浸洗5分鐘。(12).于熒光顯微鏡下觀察并拍照。三、實驗結果免疫熒光結合流式細胞儀分析顯示(圖幻，成體大鼠肝臟卵圓細胞肝臟前體細胞標志物0V6的陽性率87.2%，Dlk的陽性率99. 1 % ；免疫熒光結合熒光顯微鏡分析顯示(圖 3)，成體大鼠肝臟卵圓細胞肝臟前體細胞標志物AFP的陽性率98%、ALB的陽性率96%、 CK19的陽性率92%。實施例4 成體大鼠肝臟卵圓細胞的生長曲線一、實驗方法1.取對數生長期細胞經胰蛋白酶消化、計數后，按1 X IO4/孔接種于M孔板中，置于37°C，5% CO2培養箱中培養，每2天換液一次。2.連續8天每天消化3孔細胞進行計數，以各孔細胞數的平均值士標準差來表示細胞數。3.以橫坐標為培養天數，縱坐標為細胞數，繪制細胞的生長曲線。二、實驗結果體外培養的成體大鼠肝臟卵圓細胞生長存在接觸抑制與密度抑制現象，圖4為成體大鼠肝臟卵圓細胞的生長曲線，在接種后2 6天為增殖活躍的對數生長期。實施例5 成體大鼠肝臟卵圓細胞的染色體倍體分析一、試劑1. 0. 檸檬酸緩沖液含0. 檸檬酸的H2O2.碘化丙啶染液含0. 2mg/ml碘化丙啶的0. 1 %檸檬酸緩沖液3. RNaseA 溶液含 0. 2mg/mlRNaseA 的 0. 1 %檸檬酸緩沖液二、實驗方法1.取對數生長期成體大鼠肝臟卵圓細胞一瓶，用胰蛋白酶溶液消化細胞制成單細胞懸液。2.取5X IO5細胞，用PBS洗滌細胞三次，每次用:3ml PBS重懸細胞，1，OOOrpm離心5分鐘，棄去上清液。3.將250 μ 1 RNase A溶液和250 μ 1碘化丙啶染液混勻后加入細胞沉淀中混勻。
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4.室溫避光孵育30分鐘。5.經400目銅網過濾后用BD FACSCalibur流式細胞儀測定，用BDCellQuest細胞獲取分析軟件收集IX IO4細胞，用BD ModFit LT細胞周期分析軟件分析染色體倍體。三、實驗結果體外培養的成體大鼠肝臟卵圓細胞經碘化丙啶染色后應用流式細胞儀分析其染色體倍數和細胞周期。成體大鼠肝臟卵圓細胞流式細胞分析結果如圖5所示，成體大鼠肝臟卵圓細胞呈正常二倍體圖形，未見異常倍體出現；細胞周期分析結果顯示GO-Gl期細胞占79. 92%，G2-M期細胞占4. 91%，S期細胞占15. 17%,G2/G1期細胞占1.88%。實施例6 誘導成體大鼠肝臟卵圓細胞分化為肝細胞一、試劑1.誘導分化培養基含0. 75mM 丁酸鈉的完全培養基2.無血清培養基含100U/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素的DMEM/F12培養基。3.卡諾固定液酒精氯仿冰醋酸=6:3:14.過碘酸溶液含0. 5%過碘酸的H2O5. Schiff 試劑6.氨代謝檢測用培養基含20mM氯化銨的完全培養基二、實驗方法1.誘導分化(1).取對數生長期的成體大鼠肝臟卵圓細胞制備成單細胞懸液，按2. 5X IOVcm2 接種于直徑6cm培養皿中，于37 °C，5 % CO2培養箱中培養過夜。(2).棄去舊培養基，PBS洗細胞一次，加入誘導分化培養基，繼續培養3天，以完全培養基培養細胞為對照。2.白蛋白分泌測定(1).取誘導分化細胞和對照細胞，棄去舊培養基，PBS洗細胞三次，加入無血清培養基，于37°C，5% CO2培養箱中培養M小時。(2).收集培養上清液于01ympUsAU640全自動生物化學分析儀上檢測上清液中白蛋白含量。
3. $害原合成能力測定
(1).取誘導分化細胞和對照細胞，棄去舊培養基，PBS洗細胞三次。
(2).用卡諾固定液固定10分鐘。
(3).蒸餾水洗三次。
⑷·加入過碘酸溶液作用15分鐘。
(5).加入khiff試劑中30分鐘至切片稍微變紅。
(6).自來水淋洗小蓋片2分鐘至切片變紅。
(7).用蒸餾水淋洗晾干，顯微鏡下觀察并照相。
4.細胞氨代謝能力的測定
(1).取誘導分化細胞和對照細胞，棄去舊培養基，PBS洗細胞三次。
(2).加入氨代謝檢測用培養基，于37°C，5% CO2培養箱中繼續培養M小時。
(3).收集培養上清液于01ympUsAU640全自動生物化學分析儀上檢測上清液中尿素濃度。三、實驗結果糖原染色結果顯示，對照細胞(圖6A)內僅有呈淡粉色，而丁酸鈉誘導后細胞內可見大量紫紅色顆粒(圖6B)。成熟肝細胞能夠向細胞外分泌白蛋白，如圖7所示，丁酸鈉誘導后成體大鼠肝臟卵圓細胞分泌白蛋白能力增強。成熟肝細胞能夠攝取血液中的NH4+將其代謝為尿素，如圖8所示，丁酸鈉誘導后成體大鼠肝臟卵圓細胞獲得了代謝NH4+合成尿素的功能。顯然，本發明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而并非是對本發明的實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無法對所有的實施方式予以窮舉。凡是屬于本發明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發明的保護范圍之列。
權利要求
1.一種成體大鼠肝臟卵圓細胞系rHOC，于2010年7月23日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC No. 4057。
2.權利要求1所述的成體大鼠肝臟卵圓細胞系rHOC，其特征在于所述細胞具有以下生物學特性(1)細胞呈典型的上皮細胞形態，連續傳代培養100代仍保持該形態特點；(2)細胞具有較強的增殖能力，但生長存在接觸抑制和密度抑制現象，連續傳代培養 100代仍保持該增殖和生長特性；(3)細胞表達肝臟前體細胞標志物肝臟卵圓細胞標志物、Notch配基Delta樣蛋白、甲胎蛋白、白蛋白、細胞角蛋白19，連續傳代培養100代細胞仍保持上述免疫表型。
3.權利要求1所述的成體大鼠肝臟卵圓細胞系rHOC的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)用含0.乙硫氨酸的膽堿缺乏性飼料喂養大鼠6周；(2)麻醉大鼠后無菌條件下行門靜脈插管，并進行原位灌流以去除血細胞；(3)切下肝組織，用含0.膠原酶溶液循環灌注以離散肝組織；(4)將步驟C3)灌流后的肝組織置于120目銅網上剪碎組織并研磨以獲得單細胞懸液；(5)收集步驟(4)的單細胞懸液并于4°C條件下1500rpm離心5分鐘以得到細胞沉淀；(6)將步驟(5)的細胞沉淀重懸于蛋白酶E溶液中37°C孵育60分鐘以去除肝細胞；(7)加入等體積的含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，混合均勻后經孔徑20μπι尼龍膜過濾；(8)將濾液上樣至1.35g/ml和1. 70g/ml Percoll不連續密度梯度介質上，4°C條件下 2000rpm離心20分鐘；(9)收集兩層密度梯度介質間的細胞，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基洗3次， 于4°C條件下1，500rpm離心5分鐘，棄去上清液；(10)將步驟(9)的細胞沉淀重懸于完全培養基中，按2.5 X IOVcm2接種細胞懸液于膠原包被的組織培養皿中，置于37°C，5% CO2培養箱中培養；(11)每隔2天更換新鮮的完全培養基一次；(12)待細胞形成克隆后，應用克隆環挑取上皮細胞克隆置于新的培養瓶中繼續培養， 即得成體大鼠肝臟卵圓細胞。
4.權利要求1所述的成體大鼠肝臟卵圓細胞系rHOC在體內外定向誘導肝細胞中的應用。
5.權利要求1所述的成體大鼠肝臟卵圓細胞系rHOC在制備生物人工肝中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種成體大鼠肝臟卵圓細胞系rHOC，該細胞系已于2010年7月23日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，其保藏登記編號為CGMCC No.4057。所述細胞具有以下生物學特性細胞呈典型上皮細胞形態，具有較強的增殖能力但生長仍具有接觸抑制與密度抑制現象，表達的肝臟前體細胞標志物肝臟卵圓細胞標志物(OV-6)、Notch配基Delta樣蛋白(Dlk)、甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)和細胞角蛋白19(CK19)；細胞連續傳代培養48個月已傳至100代，仍然保持上述形態特點、生長和增殖特性以及免疫表型，其特性穩定、成分均一，是良好的肝臟前體細胞研究模型。
文檔編號C12N5/071GK102344903SQ20101024010
公開日2012年2月8日 申請日期2010年7月29日 優先權日2010年7月29日
發明者叢敏, 劉天會, 唐淑珍, 尤紅, 王萍, 賈繼東, 馬紅 申請人:首都醫科大學附屬北京友誼醫院