專利名稱：檢測多種對蝦病原的基因芯片及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因芯片的海洋生物的病原檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測多種對 蝦病原的基因芯片及其檢測方法。
背景技術(shù)：
近年來，運用核酸技術(shù)對海水養(yǎng)殖動物病原微生物進行檢測的方法發(fā)展非常迅 速，除了傳統(tǒng)的聚合酶鏈式反應之外，還有聚合酶鏈式反應與分子雜交聯(lián)用技術(shù)、聚合酶鏈 式反應與免疫學聯(lián)用技術(shù)、限制性酶切技術(shù)及環(huán)介導的等溫擴增等方法。但由于養(yǎng)殖動物 種類多、病原種類繁雜，針對單一病原的檢測和診斷不能全面反映病害發(fā)生的原因和狀況， 不利于確定有效的防治措施。現(xiàn)有的病原檢測技術(shù)局限性大、效率低、系統(tǒng)性差，因此急需 海水養(yǎng)殖動物疾病檢測手段在高通量分析能力上取得突破，打破技術(shù)瓶頸。新近發(fā)展起來的基因芯片技術(shù)為這一需求提供了強有力的技術(shù)平臺。這一技術(shù)達 到在同一個支持物上對多種病原同時進行檢測和鑒定的目的，不但大大縮短了檢測時間， 而且能夠提高靈敏度和準確率，彌補了其它分子生物學檢測手段的不足。國內(nèi)在基因芯片 技術(shù)應用于水產(chǎn)動物疾病檢測上也進行了嘗試，但目前尚未見應用該技術(shù)同時對對蝦病毒 類、真菌類、原生動物類和對蝦立克次氏體等病原進行檢測的相關(guān)基因芯片應用的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測多種對蝦病原的基因芯片及其檢測方法，用于檢測 白斑綜合癥病毒、傳染性皮下和造血器官壞死病毒、肝胰腺細小病毒、斑節(jié)對蝦桿狀病毒、 桃拉病毒、黃頭病毒、對蝦桿狀病毒、產(chǎn)卵蝦死亡病毒、傳染性肌肉壞死病毒、LSNV、毛利病 毒、對蝦諾達病毒、NHP、鐮刀菌、殺魚絲囊霉菌、變形藻絲囊菌、擬阿腦蟲和對蝦立克次氏體 共18類對蝦病原，以解決現(xiàn)有技術(shù)不能高通量檢測，以及靈敏度低和準確率差的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案包括一、基因芯片的構(gòu)建1、基因芯片上的探針選擇本發(fā)明共提供了兩大類探針1、提供了質(zhì)控體系的探針，包括表面化學質(zhì)控的探 針、陰性對照質(zhì)控的探針以及雜交陽性外對照質(zhì)控和整個流程監(jiān)控的陽性內(nèi)對照質(zhì)控的探 針，同時提供了和各探針對應的正向引物及反向引物引物；2、提供了白斑綜合癥病毒、傳染 性皮下和造血器官壞死病毒、肝胰腺細小病毒、斑節(jié)對蝦桿狀病毒、桃拉病毒、黃頭病毒、對 蝦桿狀病毒、產(chǎn)卵蝦死亡病毒、傳染性肌肉壞死病毒、LSNV、毛利病毒、對蝦諾達病毒、NHP、 鐮刀菌、殺魚絲囊霉菌、變形藻絲囊菌、擬阿腦蟲和對蝦立克次氏體共18類對蝦病原微生 物特征基因的探針，同時提供各探針對應的正向引物及反向引物。質(zhì)控體系包括表面化學質(zhì)控QC1、雜交陽性外對照質(zhì)控QC2、整個流程監(jiān)控的陽性 內(nèi)對照質(zhì)控QC3、陰性對照質(zhì)控QC4和空白對照QC5五部分。質(zhì)控體系中各個成員的特征基 因及其序列在表1中的分布如下
整個流程監(jiān)控的陽性內(nèi)對照質(zhì)控QC3特征基因1探針序列P1、正向引物序列Fl和 反向引物序列Al分別對應于表1中序號1、2和3 ；整個流程監(jiān)控的陽性內(nèi)對照質(zhì)控QC3特 征基因2探針序列P2、正向引物序列F2和反向引物序列A2分別對應于表1中序號4、5和 6 ；表面化學質(zhì)控QCl探針序列P、正向引物序列F和反向引物序列A分別對應于表1中序 號7、8和9 ；陰性對照質(zhì)控QC4探針序列P對應于表1中序號10 ；雜交陽性外對照質(zhì)控QC2 探針序列P、正向引物序列F和反向引物序列A對應于表1中序號11、12和13。表1 質(zhì)控體系的探針及引物序列信息
權(quán)利要求
一種檢測多種對蝦病原的基因芯片，其特征在于將用于檢測白斑綜合癥病毒、傳染性皮下和造血器官壞死病毒、肝胰腺細小病毒、斑節(jié)對蝦桿狀病毒、桃拉病毒、黃頭病毒、對蝦桿狀病毒、產(chǎn)卵死亡病毒、傳染性肌肉壞死病毒、LSNV、毛利病毒、對蝦諾達病毒和NHP病毒的探針；用于檢測鐮刀菌、殺魚絲囊霉菌和變形藻絲囊菌的探針；用于檢測擬阿腦蟲和對蝦立克次氏體的探針點制在基因芯片載體上，探針的序列信息如下
2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測多種對蝦病原的基因芯片，其特征在于上述的基因芯 片載體上還點制有整個流程監(jiān)控的陽性內(nèi)對照質(zhì)控QC3的探針；探針的序列信息如下
3.如權(quán)利要求2所述的一種檢測多種對蝦病原的基因芯片，其特征在于上述的整個流 程監(jiān)控的陽性內(nèi)對照質(zhì)控QC3的探針有替補探針，替補探針序列信息如下
4.如權(quán)利要求1或2所述的一種檢測多種魚類病原的基因芯片，其特征在于上述的基 因芯片載體為固相載體尼龍膜。
5.權(quán)利要求書1或2所述一種檢測多種對蝦病原的基因芯片及其檢測方法，包括以下 步驟(1)待檢樣品準備、⑵地高辛標記的PCR擴增、(3)預雜交和雜交、⑷加入堿性磷 酸酶標記的地高辛抗體、(5)顯色、(6)結(jié)果判讀步驟，其特征在于步驟(2)中的地高辛標記 的 PCR 擴增體系是無菌去離子水 17. 25 μ L, IOXreaction buffer 2. 5μ L,20mM 的 MgCl2·1.5yL, PCR地高辛標記混合物0.5 μ L，10 μ M的正向引物和10 μ M的反向引物各1 μ L， 5unit/ μ L的rTaq DNA聚合酶0. 25 μ L，待檢樣品DNA 1 μ L，該反應體系總體積25 μ L。PCR 擴增程序94°C 4min ；94°C 30s, 55. 5°C 30s, 72°C 40s，35 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin，4°C保 溫，其中各正向引物和反向引物的序列信息如下
6.如權(quán)利要求5所述的一種檢測多種對蝦病原的基因芯片及其檢測方法，其特征在于 上述鐮刀菌的探針對應的引物存在替補引物，替補引物的序列信息如下
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測多種對蝦病原的基因芯片及其檢測方法?；蛐酒臉?gòu)建是將質(zhì)控系統(tǒng)的探針和18種對蝦病原的探針點在同一固相載體尼龍膜上制成。18種對蝦病原的探針包括用于檢測15種病毒的探針，用于檢測鐮刀菌、殺魚絲囊霉菌、變形藻絲囊菌的探針以及檢測擬阿腦蟲和對蝦立克次氏體的探針。本發(fā)明的基因芯片的檢測是應用地高辛雜交顯色方法，根據(jù)雜交點是否出現(xiàn)藍色或藍紫色來進行信號判斷。本發(fā)明基因芯片上質(zhì)控體系的構(gòu)建保證了檢測的特異性和靈敏性，并且可在同一尼龍膜上對多種對蝦病原微生物進行同時檢測，具有高通量的特點，可以替代之前的對蝦病原微生物相關(guān)檢測方法，是現(xiàn)有對蝦病原微生物鑒定技術(shù)的突破。
文檔編號C12Q1/70GK101942527SQ201010243399
公開日2011年1月12日 申請日期2010年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月3日
發(fā)明者劉莉, 史成銀, 宋曉玲, 張寶存, 張慶利, 楊冰, 王秀華, 荊曉艷, 閆麗, 黃倢 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所