專利名稱：一種菊花光周期敏感型基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及菊花光周期敏感型基因FT同源基因(命 名為CmFT)，同時(shí)涉及CmFT基因在調(diào)節(jié)菊花光周期敏感性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)為菊禾斗(Asteraceae)菊屬多年生草 本花卉，是我國(guó)傳統(tǒng)名花，也是世界上重要的觀賞花卉之一，經(jīng)長(zhǎng)期的人工選育和栽培形成 了許多品種。菊花依據(jù)花期可分為夏菊(6-9月開花)、秋菊(10-11月開花)、寒菊(12月-翌 年1月開花)、四季菊(四季開花)等四個(gè)類型。目前栽培的菊花主要是秋菊，其它季節(jié)的 菊花品種相對(duì)較少，存在花期相對(duì)集中、花期短等問題，影響了菊花的周年生產(chǎn)和應(yīng)用范圍 的擴(kuò)大，依靠人工遮光、補(bǔ)光等措施調(diào)控花期易導(dǎo)致花卉品質(zhì)下降，增加生產(chǎn)成本。人們通過(guò)常規(guī)育種方法選育日中性菊花品種，從而解決菊花周年生產(chǎn)等問題，但 仍存在品種單一、性狀遺傳不穩(wěn)定等問題。某些日中性菊花品種開花生理的研究對(duì)選育日 中性菊花品種具有一定的指導(dǎo)意義。通過(guò)分子育種方法結(jié)合常規(guī)育種手段定向選育日中性 菊花品種無(wú)疑更具普遍意義。轉(zhuǎn)入外源基因的菊花改變花期的研究表明通過(guò)分子育種培育 新品種的可行性，然而有關(guān)菊花日中性分子機(jī)理的研究仍未見報(bào)道。近年來(lái)，隨著一些植物光周期不敏感相關(guān)基因的定位、克隆和功能驗(yàn)證，人們對(duì)日 中性的形成機(jī)理有了更深的認(rèn)識(shí)，這無(wú)疑對(duì)菊花日中性的分子機(jī)制研究和新品種選育提供 了契機(jī)。為了滿足菊花適時(shí)、適地開花的要求，可以通過(guò)分離菊花光周期不敏感相關(guān)基因， 研究其分子調(diào)控機(jī)制，并在菊花中導(dǎo)入控制花期的關(guān)鍵基因，以達(dá)到改變花期的目的。光周期是白天與黑夜的周期循環(huán)，是調(diào)控開花的主要環(huán)境因子之一。光周期現(xiàn)象 (Photoperiodism)是生物體適應(yīng)光周期變化而發(fā)生的各種生理反應(yīng)現(xiàn)象。1920年，戈納 (Garner W. W.)與阿拉德(Allard H. A.)首先證實(shí)日照長(zhǎng)度是影響一年生煙草開花的關(guān)鍵 因素，之后在莖的伸長(zhǎng)、休眠、落葉等生理反應(yīng)中觀察到光周期現(xiàn)象。許多植物日長(zhǎng)控制開花時(shí)間的生理研究都支持外部同步模型，這表明日長(zhǎng)響應(yīng)的 分子基礎(chǔ)是外部光信號(hào)和內(nèi)部晝夜生理節(jié)律的相互作用。在植物上主要通過(guò)兩類基因加以 分析擬南芥CONSTANS(CO)或水稻同源基因Heading datel (Hdl)，編碼B_box鋅指蛋白； 擬南芥FLOWERING LOCUS T(FT)或水稻同源基因Heading date 3a (Hd3a)，編碼小分子轉(zhuǎn) 錄輔酶。相關(guān)研究表明，受光周期調(diào)控的CO峰形及表達(dá)量的改變對(duì)FT表達(dá)閾值的變化起 關(guān)鍵性作用，此外其它一些蛋白如擬南芥PHYT0CHR0ME AND FLOWERING TIME 1、水稻Early heading date 1等也分別參與了植物光周期遺傳調(diào)控，且獨(dú)立于CO(Hdl)對(duì)FT(Hd3a)起作 用；植物光敏感性機(jī)制正是通過(guò)一系列分子調(diào)控過(guò)程最終通過(guò)FT影響植物光周期特性。在擬南芥中FT首次被克隆鑒定，被認(rèn)為是一個(gè)轉(zhuǎn)錄輔助因子。自從1996年報(bào)道 CO在莖頂中積累開始，目前主要的關(guān)注點(diǎn)已在光周期信號(hào)下游的過(guò)程。一個(gè)主要進(jìn)展是發(fā) 現(xiàn)FT的表達(dá)量不僅在長(zhǎng)日照下很高，而且呈現(xiàn)生物循環(huán)節(jié)律，在24h循環(huán)周期的后半時(shí)達(dá)最高峰。在短日照下FT表達(dá)量微乎其微，但是從短日照轉(zhuǎn)移到長(zhǎng)日照誘導(dǎo)成花的條件下依 賴CO的FT立即被誘導(dǎo)，再放回短日照下便引起FT表達(dá)量的下降。這些現(xiàn)象說(shuō)明日長(zhǎng)在FT 的積累中起重要作用。與FT相反，CO在長(zhǎng)日照和短日照下均容易被檢測(cè)出來(lái)，CO表達(dá)量循環(huán)振蕩，但與 日長(zhǎng)不相關(guān)。無(wú)論在長(zhǎng)日照或短日照下，在夜間均有一峰值，但在長(zhǎng)日照光照后半段有個(gè)次 峰。CO表達(dá)沒有引發(fā)FT的積累表明CO/FT分子機(jī)制可能是外部一致模型的核心。Yanovsky和Kay研究tocl突變體間接地支持CO/FT分子機(jī)制可能是外部一致模 型的核心。此外，Roden等進(jìn)行了不同日照長(zhǎng)度的處理，證實(shí)了把CO峰值置于光照下促進(jìn) 野生型植物在短日照下開花。高表達(dá)量CO蛋白處于光照條件下FT才受誘導(dǎo)表明CO活性 是在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，GeorgeCoupland研究組闡明遠(yuǎn)紅外和藍(lán)光(分別被 光敏色素A和隱花色素2所感應(yīng))通過(guò)抑制依賴激酶的CO降解來(lái)調(diào)控CO蛋白的穩(wěn)定性。 因此，Burming所指出生物節(jié)律產(chǎn)生的光感應(yīng)開花調(diào)控因子確實(shí)存在，即CO蛋白。在夜間， CO可能通過(guò)SPA蛋白結(jié)合激酶，該激酶反過(guò)來(lái)與E3泛素連接酶COPl互相作用在菊花中分離和鑒定FT同源基因，并對(duì)其結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行分析，探討菊花中CO/ FT分子機(jī)理，有利于從分子水平上了解菊花光周期控制花發(fā)育的機(jī)制。然而，到目前為止， 還沒有有關(guān)菊花光周期敏感型基因的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種菊花光周期敏感型基因，其為FT同源基因(命名為 CmFT)，屬于FT亞家族成員。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述光敏感基因CmFT在培育日中性菊花新品種中 的應(yīng)用。本發(fā)明采用同源基因克隆法結(jié)合RACE技術(shù)，從菊花中分離了 FT同源基因CmFT，其 核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，開放閱讀框?yàn)?25bp，編碼174個(gè)氨基酸，該氨基酸序列如 序列表SEQ ID No. 2所示，其包含F(xiàn)T類蛋白保守基序和兩個(gè)關(guān)鍵性氨基酸殘基，進(jìn)化樹分 析表明CmFT屬于FT亞家族成員。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列，在不影響其活性的 前提下，取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。因此，本發(fā)明 蛋白還包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，具有 同等活性的由所述蛋白衍生得到的蛋白質(zhì)。本發(fā)明基因包括編碼所述蛋白的核酸序列。此外，應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。本發(fā)明的基因和蛋白質(zhì)可以從地被菊中克隆或分離得到，或者通過(guò)DNA或肽合成 的方法得到?？蓪⒈景l(fā)明基因與表達(dá)載體可操作地連接，得到能夠表達(dá)本發(fā)明蛋白的重組表達(dá) 載體，進(jìn)而可以通過(guò)諸如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管通道法等轉(zhuǎn)基因方法，將所述表 達(dá)載體導(dǎo)入宿主，得到轉(zhuǎn)CmFT基因的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明通過(guò)對(duì)CmFT的克隆、鑒定及表達(dá)分析，表明CmFT與菊花光周期敏感性密切 相關(guān)，在光周期促進(jìn)開花中發(fā)揮一定的作用。本發(fā)明采用基因超表達(dá)或反義技術(shù)轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥和菊花，驗(yàn)證CmFT的功能，結(jié)果表明，同野生型植株相比，花期均提前，在短日 照條件下可提前7d開花，在長(zhǎng)日照條件下提前8d開花，擬南芥蓮座葉的葉片數(shù)相應(yīng)地減 少。


圖1.CmFT基因的基因組結(jié)構(gòu)圖。
圖2.不同雙子葉植物FT/TFL1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹。
圖3.植物正義表達(dá)載體PBI-CmFTf的構(gòu)建。
圖4.植物反義表達(dá)載體PBI-CmFTr的構(gòu)建。
圖5.擬南芥Kan抗性植株的篩選。
圖6.轉(zhuǎn)CmFT擬南芥花結(jié)構(gòu)表型，其中，A中左盆為長(zhǎng)日照處理30d時(shí)野生型擬南
芥，右盆植株為轉(zhuǎn)正義CmFT擬南芥；B為A圖的直立拍照?qǐng)D；C、D、E為轉(zhuǎn)CmFT擬南芥在短 日照處理45d、50d、60d的花結(jié)構(gòu)表型。圖7.菊花G418抗性植株的篩選。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1. CmFT基因的分離和鑒定方法1.材料選擇試驗(yàn)材料葉片及花蕾混合物取自地被菊品種‘七月桃花’，于-80°C超低溫冰箱中 保存?zhèn)溆谩?.設(shè)計(jì)引物除RACE試驗(yàn)中通用引物為試劑盒附帶以外(3’RACE通用引物序列如3’Full RACE Core Set Ver. 2. 0說(shuō)明書、5，RACE通用引物序列如SMARTTM RACE cDNAAmplification Kit
說(shuō)明書)，其余各基因引物序列見下表。
3.總RNA、DNA的提取及電泳分析A.總RNA的提取(采用液氮研磨法)1)取500 μ L裂解液RLT，轉(zhuǎn)入1. 5mL離心管中，加入5 μ L β -巰基乙醇至終濃度 為1 %，再加入50 μ L PLANTaid混勻備用。2)液氮中研磨適量植物組織(葉片及花蕾混合物)成細(xì)粉后，取約為50mg細(xì)粉轉(zhuǎn) 入上述裝有裂解液的離心管，立即用手劇烈振蕩20s，充分裂解，再用電動(dòng)振蕩機(jī)勻漿30s， 以剪切DNA，降低粘稠度和提高產(chǎn)量。3)將裂解物室溫下13，000r/m離心Smin (溫度條件下同)，沉淀不能裂解的碎片 和結(jié)合有多糖多酚的PLANTaid，將所有裂解物上清轉(zhuǎn)到一個(gè)新離心管(避免接觸沉淀物)， 加入0. 5體積的無(wú)水乙醇，立即吹打混勻，不要離心。4)將混合物加入一個(gè)吸附柱RA中，13，000r/m離心60s，去掉廢液。5)向吸附柱RA中加入350 μ L去蛋白液RW1，12，000r/m離心30 60s，棄廢液， 將吸附柱放回收集管中。6)取 61 uL RNase free ddH20,依次力口 入 8ul IOXReaction BufferU ulRecombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor^10 ul RNase-Free DNaseI 于RNasefree 離心管中，輕柔混勻配制成DNase I工作液，向吸附柱RA中央加入80 μ L的DNase I工作 液，室溫放置15min。7)向吸附柱RA中加入350 μ L去蛋白液RW1，12，000r/m離心60s，棄廢液，將吸附
柱放回收集管中。8)加0. 5mL漂洗液RW(請(qǐng)先檢查是否已加入乙醇)，12，000r/m離心30s，棄廢液， 加入0. 5mL漂洗液RW，重復(fù)一遍。9)將吸附柱RA放回空收集管中，13，000r/m離心2min，盡量除去漂洗液，以免漂洗 液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。10)取出吸附柱RA，放入一個(gè)RNase free離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜 的中間部位加30 50 μ L RNase free ddH20(事先在65 70°C水浴中加熱效果更好)， 室溫放置2min，12，000r/m離心Imin收集總RNA。B.總DNA的提取
1)取新鮮葉片幼嫩組織IOOmg于研缽中，加入液氮充分研磨，加入400 μ L緩沖液 LPl和6μ L RNase A(10mg/mL)混合液，漩渦振蕩lmin，室溫放置lOmin，加入130 μ L緩沖 液LP2，充分混勻，漩渦振蕩lmin。2)常溫下12，OOOr/m離心5min(溫度條件下同)，將上清移至新離心管中。3)加入1. 5體積的緩沖液LP3，立即充分振蕩混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。4)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中，12，000r/m離心30s， 去掉廢液，吸附柱放回收集管中。5)向吸附柱中加入700 μ L漂洗液PW(已加入無(wú)水乙醇)，12，000r/m離心30s，棄
廢液，將吸附柱放回收集管中。6)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液PW，12，000r/m離心30s，棄廢液。7)將吸附柱放回收集管中，12，000r/m離心2min，棄廢液，將吸附柱置于室溫下 lOmin，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。8)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加80 μ L 洗脫緩沖液ΤΕ，室溫放置2 5min，12，000r/m離心2min，收集溶解物。C.電泳分析取5 μ L總RNA或總DNA放置于含Gel rad染料的1. 0%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔上，在 電泳緩沖液為ι χ TAE，電壓為5V/cm條件下電泳30min，后在凝膠成像儀上觀察樣品的完整 性、電泳條帶的清晰度，并進(jìn)行拍照。4.總RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)1)在冰浴的 PCR管中依次加入 Iyg 總 RNA、ly L olig(dT) 18 primer (0. 5 μ g/ μ L)、RNase-free ddH20 加至 12 μ L,混勻后離心；2) 65°C溫浴5min，冰上冷卻；3)依次加入 4 μ L5 X Reaction BufferU μ L RiboLock RNase Inhibitor (20U/ μ L)>2μ L dNTP Mix(IOmM)，1 μ L RevertAid M-MuLV ReverseTranscriptase(200U/ μ L)，混勻后離心；4) 42°C溫浴60min，而后70°C溫浴5min，冰上冷卻，置_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?. CmFT基因全長(zhǎng)的克隆A. CmFT基因保守區(qū)序列的獲得根據(jù)設(shè)計(jì)好的引物列表中FT同源基因的序列設(shè) 計(jì)引物FT-F和FT-R，以已經(jīng)合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；B. CmFT基因 3，端 RACE序列的獲得使用 Takara 3'-Full RACE Core SetVer. 2. 0 試劑盒擴(kuò)增CmFT基因3’端序列，其中CmFT基因3’端的擴(kuò)增引物為引物設(shè)計(jì)列表中的一 對(duì)正向引物CmFT3' -Fl和CmFT3' _F2，按照試劑盒使用說(shuō)明書分別進(jìn)行3’ RACE巢式擴(kuò) 增；C. CmFT 基因 5，端 RACE 序列的獲得采用 SMART RACE cDNAAmplification Kit(Clontech)擴(kuò)增CmFT基因5’端序列，其中CmFT基因5’端的擴(kuò)增引物為引物設(shè)計(jì)列表 中的一對(duì)反向引物CmFT5 ‘ -Rl和CmFT5 ‘ -R2，進(jìn)行5，RACE擴(kuò)增；D. CmFT基因全長(zhǎng)的獲得與序列分析根據(jù)CmFT基因保守區(qū)、3’端和5’端RACE序 列拼接結(jié)果設(shè)計(jì)一對(duì)跨越ORF框的特異引物CmFT-F和CmFT-R，以已經(jīng)合成的cDNA為模板 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收特異片段，并進(jìn)行T-A克隆與測(cè)序。
PCR反應(yīng)體系
__體積W
5 χ Green Buffer5.0
MgCl2(25 mM)2.0
Taq(5U/pL) Total
0.15 252) PCR擴(kuò)增程序如下PCR反應(yīng)條件 6. CmFT基因組內(nèi)含子的擴(kuò)增根據(jù)已報(bào)道的FT同源基因外顯子及內(nèi)含子特征，設(shè)計(jì)跨越可能存在的三個(gè)內(nèi)含 子區(qū)域的引物，分別為 CmFT-Fl 與 CmFT-Rl、CmFT-F2 與 CmFT_R2、CmFT_F3 與 CmFT_R3，進(jìn)行 CmFT基因內(nèi)含子的擴(kuò)增。7.回收PCR產(chǎn)物特異片段，并進(jìn)行T-A克隆與測(cè)序A. PCR產(chǎn)物的回收采用Tiangen離心柱型普通凝膠回收試劑盒，按照產(chǎn)品說(shuō)明書方法略加修改，室 溫條件下操作，具體步驟如下1)離心柱預(yù)平衡向吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)加入500 μ L平衡液 BL，12000r/m離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。2)將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下，放入無(wú)菌離心管中，稱取重量。3)向膠塊加入3倍提交溶膠液PN:當(dāng)回收的目的片段< 150bp時(shí)使用6倍體積溶 膠液PN(如凝膠重為0. Ig,其體積可視為100 μ L，依次類推)。50°C水浴放置lOmin，其間 不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。如果還有未溶膠塊，可再補(bǔ)加一些溶膠 液或繼續(xù)放置幾分鐘，直至膠塊完全溶解，室溫下冷卻。
4)將上一步所得溶液加入一個(gè)預(yù)平衡吸附柱CA2中，室溫放置2min，12000r/m離 心60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。5)向吸附柱CA2中加入600 μ L漂洗液PW(已加入無(wú)水乙醇)，12000r/m離心30s， 倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中，重復(fù)漂洗一次。注如果回收的DNA是 用于平末端連接實(shí)驗(yàn)或直接測(cè)序，在加入PW時(shí)選擇靜置5min后再離心。6)將吸附柱CA2放回收集管中，12000r/m離心2min，盡量除盡漂洗液。將吸附柱 CA2置于室溫放置5 lOmin，徹底地晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的實(shí)驗(yàn)。7)將吸附柱CA2放到一個(gè)干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩 沖液EB，室溫放置2 5min，12000r/m離心2min收集DNA溶液。B. PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定1)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備a)-80°C保存的Escherichia coli T0P10接種于LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)16 20h。b)挑取固體培養(yǎng)基平板上新活化的單菌落接種于IOmL LB液體培養(yǎng)基中，37°C振 蕩培養(yǎng)10 12h。c)取ImL新鮮菌液轉(zhuǎn)接于IOOmL的LB液體培養(yǎng)基中，37°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2. 5 3. 0h，使 OD6tltl 在 0.6 0.9。d)將新鮮培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入預(yù)冷的50mL離心管中，置冰上20min，4°C，5000r/m離心 IOmin0e)棄上清，加預(yù)冷的0. IM CaCl220mL，輕輕吹打，冰上放置30min，4°C下5000r/m 離心IOmin0f)棄上清，加入2. 5mL預(yù)冷的含20 25%甘油的0. IM CaCl2溶液，輕輕吹打混 勻，按每管100 μ L分裝，-80°c保存?zhèn)溆谩?) PCR產(chǎn)物與T載體的連接與轉(zhuǎn)化a)在冰浴的PCR管中配制下列反應(yīng)溶液，總體積為10. 0 μ L，混勻，16°C連接反應(yīng) 過(guò)夜。 取5μ L加入至50μ L Ε. coli Τ0Ρ10感受態(tài)細(xì)胞，冰中靜置30min。b)42°C溫浴90s，取出立即置于冰中靜置3min。c)加入400yL 37°C預(yù)熱的無(wú)抗生素LB液體培養(yǎng)基，37°C，150r/m振蕩培養(yǎng)45min。d)取 100 μ L 菌液加入預(yù)先涂有 16 μ L 的 5% IPTG、40 μ L 的 2% X-gal 的 LBApr 固 體瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)13h或過(guò)夜，形成藍(lán)白斑單菌落。3)重組子篩選及插入片段的菌液PCR檢測(cè)挑取白斑單菌落，接菌于LB-液體培養(yǎng)基中，37°C，150r/m，振蕩培養(yǎng)8h或過(guò)夜。 菌液PCR反應(yīng)液體系及反應(yīng)條件同以cDNA或DNA為模板的PCR反應(yīng)液體系及反應(yīng)條件相 同。8. CmFT基因生物信息學(xué)分析分析CmFT基因全長(zhǎng)序列所翻譯的氨基酸序列，并與擬南芥FT/TFL1家族和部分雙 子葉植物的同源序列進(jìn)行比對(duì)。使用MEGA 4.0軟件按鄰接法構(gòu)建雙子葉植物FT類似蛋白 系統(tǒng)進(jìn)化樹。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.菊花CmFT基因cDNA全長(zhǎng)的獲得本發(fā)明根據(jù)GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)和 EST 庫(kù)(http //www, ncbi. nlm. nih. gov/ Genbank/)中檢索FT同源基因序列，用在線Blast軟件分析它們的同源性。依據(jù)FT同源 基因的保守區(qū)域，通過(guò)Oligo 6、Primer Premier 5軟件分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物FT-F和FT-R， 預(yù)計(jì)擴(kuò)增出FT cDNA保守區(qū)片段的大小為180bp與900bp左右。將PCR產(chǎn)物回收、純化后 進(jìn)行T-A克隆，菌液PCR檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序，獲得了大小分別為183bp和890bp的保守區(qū)序 列。根據(jù)已知FT同源基因保守區(qū)序列分別設(shè)計(jì)了正向特異引物CmFT3' -Fl和巢式引物 CmFT3 ‘ -F2，分別與 Takara 3，-Full RACE Core Set Ver. 2· 0 試劑盒接頭引物 3，RACE Outer Primer,3' RACE Inner Primer進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，分別獲得了菊花FT同源基因3’ 端序列大小為386bp和307bp。根據(jù)已知FT同源基因保守區(qū)序列分別設(shè)計(jì)了反向特異引物 CmFT5 ‘ -Rl 和巢式引物CmFT5' -R2，分別與 Clontech SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒接頭引物UPM、NUP進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)特異產(chǎn)物進(jìn)行T-A克隆并測(cè)序，獲得了目的 大小分別為370bp和403bp的5，端序列。根據(jù)所獲得的菊花FT同源基因保守區(qū)、3，RACE 和5，RACE序列拼接結(jié)果設(shè)計(jì)一對(duì)特異弓I物CmFT-F和CmFT-R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)特異條帶進(jìn) 行回收純化、T-A克隆后進(jìn)行測(cè)序，獲得了大小為623bp的全長(zhǎng)序列(其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示)，進(jìn)一步驗(yàn)證了 3’與5’端擴(kuò)增序列同屬一個(gè)基因來(lái)源(命名為CmFT)。2.菊花FT基因結(jié)構(gòu)分析根據(jù)已報(bào)道的FT同源基因外顯子及內(nèi)含子特征，分別在所獲得的菊花FTcDNA全 長(zhǎng)序列內(nèi)設(shè)計(jì)三對(duì)引物，以菊花基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。為了對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的序列 進(jìn)行拼接，三對(duì)引物跨過(guò)的cDNA序列均有部分重疊區(qū)域。三對(duì)引物擴(kuò)增出三條長(zhǎng)度分別為 310bp、1600bp、700bp左右的條帶。根據(jù)得到的序列與已知cDNA序列進(jìn)行拼接顯示菊花 FT基因組轉(zhuǎn)錄區(qū)全長(zhǎng)為2812bp，由3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子構(gòu)成。內(nèi)含子一長(zhǎng)為116bp，內(nèi) 含子二長(zhǎng)為1545bp，內(nèi)含子三長(zhǎng)為626bp，剪切位點(diǎn)符合“GT-AG”法則；3. CmFT生物信息學(xué)分析根據(jù)所獲得CmFT全長(zhǎng)序列的測(cè)序結(jié)果，通過(guò)DNAman軟件分析表明該基因包含一 個(gè)開放閱讀框525bp，編碼174個(gè)氨基酸和一個(gè)終止子。BLAST (http://blast, ncbi. nlm. nih.gov/Blast.cgi)比對(duì)分析表明，該基因與楊屬(Populus)、葡萄(Vitis vinifera)等大多數(shù)雙子葉植物FT同源基因的同源性可達(dá)75%以上。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)CmFT中 包含區(qū)分FT和TFLl蛋白亞家族的關(guān)鍵氨基酸殘基酪氨酸(Y)、谷氨酰胺(Q)和14個(gè)保守 氨基酸基序(LGRQTVYAPGffRQN)和LYN/IYN三聯(lián)體蛋白序列(Ahn et al.，2006)。實(shí)施例2. CmFT因的遺傳轉(zhuǎn)化利用植物表達(dá)載體pBI121為基本骨架，構(gòu)建了 CmFT正反義表達(dá)載體，分別命名 為pBI-CmFTf和pBI-CmFTr。正義表達(dá)載體pBI-CmFTf在目的基因兩端引入特異性酶切位 點(diǎn)Xba I與Sma I，反義表達(dá)載體pBI_CmFTr在目的基因兩端引入反向酶切位點(diǎn)Sma I與 Xba I，通過(guò)RT-PCR對(duì)目的基因CmFT進(jìn)行高保真擴(kuò)增，連接到pGM_T中間載體，分別雙酶切 PBI121和中間載體，回收載體大片段和目的片段，然后進(jìn)行定向粘端_平末端的連接及酶 切鑒定。1.目的片段的擴(kuò)增根據(jù)CmFT基因序列，設(shè)計(jì)合成跨越CmFT ORF的正義和反義兩對(duì)分別含Xba I與 Sma I酶切位點(diǎn)的引物。正義引物對(duì)跨度622個(gè)核苷酸，反義引物對(duì)跨度624個(gè)核苷酸。引 物序列如下正義引物對(duì)primer1 :5' -CGTCTAGAGCCCGTTTTTACATAATGCC-3 ‘primer 2:5' ~AACCCGGGTATGATGTGCGTGCTTTC~3‘反義引物對(duì)primer3 :5' -TTCCCGGGTCTCGTTTTTACATAATGCC-3 ‘primer 4:5' ~ATTCTAGACCTATGATGTGCGTGCTTTC~3‘粗體劃線部分表示在引物5’端引入酶切位點(diǎn)。1)反應(yīng)體系如下PCR反應(yīng)體系

2) PCR擴(kuò)增程序如下PCR反應(yīng)條件 2. PCR回收產(chǎn)物與pGM-T的連接與轉(zhuǎn)化a) PCR離心管中配制反應(yīng)溶液(表5_1)，混勻離心，16°C連接反應(yīng)過(guò)夜。b)取 5 μ L 連接產(chǎn)物 pGM-CmFTf 或 pGM-CmFTr 加至 50 μ L Ε. coliTOPIO 感受態(tài)細(xì) 胞中，冰中靜置30min。c)42°C溫浴90s，取出立即置于冰中靜置3min。d)加入400 μ L無(wú)抗生素LB液體培養(yǎng)基，37°C，150r/m振蕩培養(yǎng)45min。 e)取 100 μ L 菌液加入預(yù)先涂有 16 μ L 5% IPTG、40 uL 2% X-gal 的 LBApr 固體瓊 脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)12h或過(guò)夜，形成藍(lán)白斑單菌落。3.質(zhì)粒 DNA 的提取(TIAN prep Mini 試劑盒)a)柱平衡步驟向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500 μ L的平衡液 BL，12，000r/m離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。b)取1 5mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺(tái)式離心機(jī)，12，OOOr/ m離心lmin，盡量吸除上清(菌液較多時(shí)可以通過(guò)多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管 中)。c)向留有菌體沉淀的離心管中加入250 μ L溶液Pl (請(qǐng)先檢查是否已加入 RNaseA)，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀。注意如果有未徹底混勻的菌塊，會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。d)向離心管中加入250 μ L溶液Ρ2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6_8次使菌體充分裂解。注 意溫和地混合，不要?jiǎng)×艺鹗帲悦獯驍嗷蚪MDNA，造成提取的質(zhì)粒中混有基因組DNA片 斷。此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，所用時(shí)間不應(yīng)超過(guò)5min，以免質(zhì)粒受到破壞。如果未變得清 亮，可能由于菌體過(guò)多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。e)向離心管中加入350 μ L溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí) 將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12，000r/m離心lOmin，此時(shí)在離心管底部形成沉淀。注意P3加入 后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。f)將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管 中)，注意盡量不要吸出沉淀。12，OOOr/m離心30 60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。g)向吸附柱CP3中加入50(^1^去蛋白液卩0，12，00017/111離心30 608，倒掉收集 管中的廢液，將吸附柱CP3重新放回收集管中。h)向吸附柱CP3中加入600 μ L漂洗液PW，12，000r/m離心30 60s，倒掉收集管
中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。i)向吸附柱CP3中加入600 μ L漂洗液PW，12，000r/m離心30 60s，倒掉收集管
中的廢液。j)將吸附柱CP3放入收集管中，12，000r/m離心2min，目的是將吸附柱中殘余的漂
洗液去除。k)將吸附柱CP3置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50 100 μ L洗脫緩沖液ΕΒ，室溫放置2min，12，000r/m離心Imin將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。4.質(zhì)粒的酶切提取質(zhì)粒DNA 并用 Sma I 和 Xba I 分別單酶切 pGM-CmFTf、pGM-CmFTr 和 pBI121 質(zhì)粒DNA。取200 μ LPCR離心管，依次加入以下試劑 25°C條件下先用Sma I酶切3 4h，然后在原體系中加Xba I于37°C下繼續(xù)酶切 3 4h。5.酶切產(chǎn)物的回收及檢測(cè)6.酶切產(chǎn)物的連接與轉(zhuǎn)化a)在PCR離心管中配制下列反應(yīng)溶液，混勻離心，在22°C連接反應(yīng)2h，繼而在4°C 連接反應(yīng)48h。
質(zhì)粒DNA IOx NEB Buffer 4 Sma I 或 Xba I
BSA CldH2O (雙蒸水) Total
20 5 2
0.5 22.5 50
組分
體積OiL)
目的片段 IOx Ligation Buffer pBI121酶切回收產(chǎn)物 T4 DNA Ligase(3U L) Totalb)取_80°C保存的50 μ L Ε. coli Τ0Ρ10感受態(tài)細(xì)胞，冰上融化。c)加入5μ L連接產(chǎn)物，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30min。d)42°C熱擊 90s，迅速冰浴 3min。
e)加入400 μ 1不含抗生素的液體LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)45min。f)取150 200 μ 1培養(yǎng)液涂布于固體LB培養(yǎng)基上(含100 μ g/mL Kan)，37°C培 養(yǎng)16 24h。7.重組質(zhì)粒的篩選與鑒定無(wú)菌條件下，隨機(jī)挑取含100 μ g/mL Kan的LB平板上的單菌落，接種于IOmL含 100 μ g/mL Kan的液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)10 12h。通過(guò)PCR初步確定為陽(yáng)性克 隆，再繼續(xù)做酶切鑒定，并把含陽(yáng)性克隆的菌液加甘油(終濃度25%)于-80°C保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)正義引物對(duì)(primer 1和primer 2)，反義引物對(duì)(primer 3和primer 4)分 別對(duì)正義表達(dá)載體ρΒΙ-CmFTf和反義表達(dá)載體pBI-CmFTr進(jìn)行PCR鑒定a) PCR反應(yīng)體系 注*視不同引物略有改動(dòng)。8.重組植物表達(dá)載體導(dǎo)入受體農(nóng)桿菌A.農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備1)從平板中挑取農(nóng)桿菌LBA4404單菌落接種于含100 μ g/mL利福平的IOmL LB液 體培養(yǎng)基中，28°C，200r/m震蕩培養(yǎng)約20h。2)把上述培養(yǎng)過(guò)夜的培養(yǎng)物按1 100轉(zhuǎn)接入液體LB培養(yǎng)基中，28°C，200r/m繼 續(xù)震蕩培養(yǎng)約4 6h，使農(nóng)桿菌OD6tltl值約為0. 3 0. 5。3)將菌液倒入預(yù)冷的無(wú)菌離心管中，冰浴20 30min，4°C，5000r/m離心lOmin，
棄上清。4)加入 20mL 預(yù)冷的 0. IM CaCl2 和 0. 05M MgSO4 液，懸浮菌體，冰浴 30min。4°C，
145000r/m離心lOmin，棄上清。5)加入預(yù)冷的ImL含20 25%甘油的0. IM CaCl2和0. 05M MgSO4溶液，懸浮菌 體。按每管150 μ 1分裝于離心管中，液氮速凍1 2min，于-80°c保存?zhèn)溆?。B.液氮凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌取_70°C保存的農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞置于冰上融化，分別加pBI-CmFTf、 pBI-CmFTr質(zhì)粒DNA5 μ 1于感受態(tài)細(xì)胞中，旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30min，液氮中速凍lmin，37°C 熱擊5min，迅速放置冰上2min，然后加入800 1000 μ 1液體LB培養(yǎng)基(不含抗生素)， 280C 140 160r/m振蕩培養(yǎng)4 5h使農(nóng)桿菌復(fù)蘇。取300 μ 1培養(yǎng)液均勻涂布于含IOOyg/ mL利福平和100 μ g/mL Kan的平板上，待菌液被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，28°C暗培養(yǎng)2d 左右ο9.陽(yáng)性克隆的篩選和鑒定當(dāng)單菌落長(zhǎng)出后，隨機(jī)挑取單菌落接種于含100 μ g/mL利福平和100 μ g/mLKan的 液體LB培養(yǎng)基中，于28°C，200r/m振蕩培養(yǎng)1 2d，做PCR和酶切鑒定。實(shí)施例3.對(duì)光敏感基因CmFT的應(yīng)用1. CmFT導(dǎo)入擬南芥進(jìn)行功能驗(yàn)證采用哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(A. thaliana ecotype Columbia)作為轉(zhuǎn)化群體，栽 植于泥炭與蛭石(體積比為1 1)的混合生長(zhǎng)介質(zhì)中，置于培養(yǎng)溫度為22 24°C，濕度 為60 70%，光照周期為16h/8h (光/暗)，光照強(qiáng)度為30001UX的光照培養(yǎng)箱中。把已 構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pBI-CmFTf的農(nóng)桿菌株LBA4404采用花器浸泡法轉(zhuǎn)化模式植物擬南 芥，篩選抗性植株，并進(jìn)行分子鑒定和表型分析。1)分別以擬南芥總DNA、陰性對(duì)照野生型擬南芥總DNA、陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒DNA為模板， 在 CmFT 和 GUS 內(nèi)部設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物 CmFT-⑶Sl CAGCGACAACAGGAGCACAG 和 CmFT-⑶S2 ACCGCATCGAAACGCAGCAC 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。按 Promega GoTaq Flexi DNAPolymerase 使用 說(shuō)明，建立反應(yīng)體系，進(jìn)行電泳分析，結(jié)果顯示陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶，陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒能擴(kuò)增 出605bp的條帶，在所檢測(cè)的14個(gè)抗性植株中，有12株能擴(kuò)增出與陽(yáng)性對(duì)照大小相符的條 帶，為PCR陽(yáng)性植株，但有2株存在假陽(yáng)性，初步表明CmFT已經(jīng)轉(zhuǎn)入擬南芥基因組中，獲得 了轉(zhuǎn)基因植株；2)將轉(zhuǎn)基因子代Tl和對(duì)照野生型擬南芥種子播種于泥炭與蛭石(體積比為 1 1)的混合生長(zhǎng)介質(zhì)中，于長(zhǎng)日照16h/8h(光/暗)和短日照8h/16h(光/暗)條件下 培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22 24°C，濕度為60 70%，光照強(qiáng)度為30001ux。通過(guò)觀察和比較發(fā) 現(xiàn)，無(wú)論在長(zhǎng)日照(LD)或短日照(SD)條件下，擬南芥轉(zhuǎn)化植株Tl代種子播種苗的花期與 野生型擬南芥相比，其花期均提前，在短日照條件下可提前7d開花，在長(zhǎng)日照條件下提前 8d開花，擬南芥蓮座葉的葉片數(shù)相應(yīng)地減少，在SD和LD下轉(zhuǎn)化植株均少于野生型擬南芥， 然而，轉(zhuǎn)CmFT擬南芥花序及花結(jié)構(gòu)表型與野生型擬南芥未觀察到有明顯變化。2. CmFT轉(zhuǎn)化菊花的應(yīng)用選取地被菊品種‘玉人面’和‘美矮粉’(種植于北京林業(yè)大學(xué)胖龍溫室)，取腳芽 嫩枝上部莖段，用自來(lái)水沖洗10 15min，75%乙醇消毒30s，0. 1 %升汞消毒6min，無(wú)菌水 洗滌3 4次，接種于MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)莖段腋芽萌發(fā)，20d后接種無(wú)菌莖段于生根培養(yǎng)基獲 得無(wú)菌苗作為轉(zhuǎn)化群體。建立了短日照菊品種‘美矮粉’的高效再生體系及選擇壓臨界濃度，利用已構(gòu)建好的正反義表達(dá)載體pBI121-CmFTf和pBI121_CmFTr通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn) 化菊花植株，利用抗生素篩選抗性植株并進(jìn)行分子的初步鑒定。結(jié)果分別獲得了 8和10株 轉(zhuǎn)基因植物，與野生型相比，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的開花期顯著提前，而抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株 的開花期顯著延遲。
權(quán)利要求
菊花光周期敏感蛋白CmFT，其為1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列組成的蛋白；或2)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的菊花光周期敏感基因CmFT。
3.如權(quán)利要求1所述的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權(quán)利要求4所述載體的宿主細(xì)胞。
6.權(quán)利要求2或3所述基因在菊花品種選育中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求2或3所述基因在調(diào)節(jié)擬南芥或菊花開花周期中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及菊花光周期敏感型基因CmFT，同時(shí)涉及CmFT基因在菊花光周期敏感性中的應(yīng)用。本發(fā)明采用同源基因克隆法結(jié)合RACE技術(shù)，從菊花中分離了FT同源基因CmFT，該基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，CmFT屬于FT亞家族成員。CmFT與菊花光敏感性相關(guān)，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化，將基因轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥和普通菊花品種，結(jié)果表明，該基因能夠調(diào)節(jié)菊花的光周期，促進(jìn)開花。
文檔編號(hào)C12N5/10GK101921322SQ201010255730
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月18日
發(fā)明者張啟翔, 潘才博, 石少川, 蔡明 , 高亦珂 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)