專利名稱：具有透皮能力和白細胞介素-10活性的融合蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及融合蛋白及其編碼基因與應用，特別是涉及由具有“轉運肽”和人白細 胞介素-10活性的融合蛋白及其編碼基因，以及該融合蛋白的表達方法和在制備治療自身 免疫性反應特別是銀屑病藥物中的應用。
背景技術：
白細胞介素-10 (Interleukin-10, IL-10)是一種多功能的細胞因子，能夠抑制T 細胞介導的免疫炎癥反應，參與體液免疫調節。研究表明，IL-10在組織特異性自身免疫 性損傷的啟動和發展中起著關鍵性作用，并已應用于包括I型糖尿病、銀屑病、類風濕關節 炎、多發性硬化、丙型肝炎等多種免疫性疾病的臨床實驗研究。其中對銀屑病的治療效果表 現最為明顯，歐美國家均已完成II期臨床觀察。然而細胞因子這樣具有生物活性的藥物，半衰期太短，例如IL-10在體內的半衰 期僅僅2-3h，蛋白很快被清除，無法持續發揮治療作用，因而需要大劑量地頻繁使用才能達 到有效的治療濃度，然而如此頻繁用藥很不方便且很痛苦，以致某些患者無法忍受該藥物 治療。因此，迫切需要療效顯著，半衰期長且毒副作用小的IL-10。同時在II期臨床觀察中也發現，IL-10使用劑量小則治療效果差；而提高劑量則 產生明顯副作用。其原因主要由于注射給藥是目前蛋白質類藥物的唯一給藥途徑，而由于 IL-10屬強天然免疫抑制劑，系統性注射給藥時，可導致全身免疫抑制而出現副作用。TD-I是最新發現的一個含有11個氨基酸的透皮多肽，可幫助生物大分子(如胰島 素、生長激素和熒光素)透過皮膚，進入血液循環，是目前發現的唯一透皮多肽，被認為具 有改變蛋白質藥物給藥途徑的創新性突破。因此，TDl成為了 IL-10改變給藥途徑治療銀屑病的新切入點。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種融合蛋白及其編碼基因。本發明提供的融合蛋白，命名為TDl-ILlO-IgG/Fc-Yl，人工合成，是在人白細胞 介素10-蛋白的羧基末端連接如下任一所述蛋白，且在氨基末端連接轉運肽形成的融合蛋 白1)人IgG Fc- y 1或其突變蛋白；2)人IgG Fc- γ 2或其突變蛋白；所述人白細胞介素-10蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2自氨基末端第12-171 位的氨基酸序列；所述轉運肽(TDl)的氨基酸序列為序列表中序列2自氨基末端第1-11位的氨基 酸序列。所述融合蛋白為如下1)或2)的蛋白
1)序列表中的序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白；2)將序列2的氨基酸序列經過幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有透皮能 力和人白細胞介素-10活性的由1)衍生的蛋白。上述序列表中序列2由403個氨基酸殘基組成，自氨基(N)端第1_11位為TD-I的 氨基酸殘基序列，自氨基端第12-171位為人IL-10的氨基酸殘基序列，自氨基端第172-403 位為人IgG Fc-Yl的氨基酸殘基序列。所述幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加為不超過 10個氨基酸殘基的取代、缺失或添加。編碼上述具有透皮能力和白細胞介素-10活性的融合蛋白的基因 (TDl-IL10-IgG/Fc-y 1)也屬于本發明的保護范圍，是下述1)_4)中任一所述基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5，末端第256-1464位核苷酸所示的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼具有透皮能力和人白 細胞介素-10活性蛋白所示的DNA分子；4)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA分子雜交的且編碼具有透皮能力和人白細 胞介素-10活性蛋白所示的DNA分子。所述嚴格條件為雜交后用含0. 1 X SSPE (或0. 1 X SSC) ,0. 1% SDS的溶液在65°C
下洗膜。上述序列表中的序列1由1464個堿基組成，其編碼序列為序列1自5’末端第 1-1464位堿基，序列1自5’末端第1-255位堿基為具有Kex2單一蛋白酶酶切位點的 α -Factor信號肽片段的編碼序列，序列1自5’末端第256-288位堿基為轉運肽TDl的編 碼序列，序列1自5’末端第289-768位堿基為人IL-10的編碼序列，序列1自5’末端第 769-1464位堿基為人IgG Fc- γ 1的編碼序列。含有所述融合蛋白的編碼基因的重組表達載體、轉基因細胞系、表達盒或重組菌 均屬于本發明的保護范圍。所述重組表達載體為將所述融合蛋白的編碼基因插入pPIC9K的BamH I和EcoR I 的識別位點間，得到重組表達載體pPIC9K-TDl-IL10-Fc- γ 1。用于構建所述重組表達載體的出發載體為任意一種可在畢赤酵母中表達外源基 因的重組表達載體,如 pPIC9K、pPIC9、pPIC3、pPICZ α、pHIL_Dl、pA0804、pA0815 或 pPSC3K寸。所述重組菌為將所述的重組表達載體導入宿主菌得到的重組菌，所述宿主菌優選 為畢氏酵母，所述畢氏酵母尤其優選為GS115、KM71或SMD1168。擴增上述融合蛋白編碼基因中任一片段的引物對也在本發明的保護范圍之內。本發明的另一個目的是提供了 一種制備所述融合蛋白的方法。本發明提供的方法包括如下步驟1)誘導培養所述重組菌，離心收集上清液；2)純化步驟1)獲得的上清液，得到融合蛋白；在步驟1)中，所述誘導培養的溫度為30°C，所述誘導所用的培養基為添加有甲醇 的培養基，所述甲醇在所述誘導所用的培養基中的濃度為0. 5% (體積百分含量)，所述誘 導方式為每隔24h補加甲醇至終濃度為0. 5% (體積百分含量)；
在步驟2)中，所述純化的方式為依次進行親和層析和分子篩層析，所述親和層 析的層析柱優選為Mabselect，所述分子篩層析的層析柱優選為S200HR預裝柱；所述親和層析的洗脫液為濃度為50mM、pH為3. 5的醋酸鈉水溶液；所述分子篩層析的洗脫液由17. 55g氯化鈉和IOOOml濃度為20mM、pH為8. 0的 Tris · HCl緩沖液組成。所述的融合蛋白在制備治療自身免疫性疾病藥物中的應用；或所述融合蛋白的編 碼基因在制備治療自身免疫性疾病藥物中的應用；或所述的融合蛋白在制備抑制IFN-Y 產生的抑制劑中的應用；或所述融合蛋白的編碼基因在制備抑制IFN-Y產生的抑制劑中 的應用；上述應用均為本發明保護的范圍。上述應用中，所述自身免疫性疾病為銀屑病。本發明的第三個目的是提供一種治療自身免疫性疾病藥物和一種抑制IFN- Y產 生的抑制劑。本發明提供的治療自身免疫性疾病藥物，其活性成分為所述的融合蛋白、所述融 合蛋白的編碼基因或所述的重組表達載體。本發明提供的抑制IFN-Y產生的抑制劑，其活性成分為所述的融合蛋白、所述融 合蛋白的編碼基因或所述的重組表達載體。需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載 體包括藥學領域常規的稀釋劑、賦形劑、填充劑、吸收促進劑或吸附載體等。本發明的藥物可以制成涂抹膏劑，可以按照藥學領域的常規方法制備。本發明為解決上述IL-10治療銀屑病中的問題，設計了 TDI-ILIO-Fc融合蛋白的 方案，希望利用TD-I透皮的運載能力和緩釋效果，通過局部透皮給藥方式，達到增加局部 藥物濃度、同時避免系統性免疫抑制劑所致副作用的治療效果。希望以此這項研究為模型， 建立蛋白質藥物透皮給藥的新途徑。本發明建立了酵母表達體系，獲得了純化的TDI-ILIO-Fc融合蛋白；體外透皮實 驗證實，TDI-ILIO-Fc具有良好的免疫抑制活性，并可透過皮膚，進入血液。本發明的實驗 證明，利用畢赤酵母發酵表達系統，生產出具有透皮能力和白細胞介素10活性的融合蛋白 TDl-IL10-IgG/Fc融合蛋白，為下一步臨床前研究TDl_IL10-IgG/Fc融合蛋白的治療作用 打好基礎。本發明的實驗證明，本發明提供了的具有透皮能力和白細胞介素-10活性的融合 蛋白，表達量可達10mg/L，易純化，生產周期短，生產規模容易放大，制備成本較低的優點。 基于上述優點，本發明的融合蛋白及其編碼基因在醫學和生物制藥領域，尤其是在治療自 身免疫性反應特別是銀屑病藥物的制備領域具有較大的實際意義和廣闊的應用前景。


圖1為具有透皮能力和白細胞介素-10活性的融合蛋白基因的畢赤酵母表達載體 的部分物理圖譜圖 2 為 pPIC9K-IL10-Fc- γ 1 和 pPIC9K-TDl-IL10_Fc- γ 1 工程菌培養上清在還原 條件下Western Blot檢測結果圖 3 為重組畢赤酵母 pPIC9K-IL10-Fc- γ 1 和 pPIC9K-TDl-IL10_Fc- γ 1 培養上清經Mabselect親和層析及SuperdeX200分子篩兩步純化所得蛋白的SDS-PAGE檢測結果圖4具有透皮能力和白細胞介素-10活性的融合蛋白抑制PHA誘導PBMC產生 IFN-Y的活性圖5為具有透皮能力和白細胞介素-10活性的融合蛋白在大鼠體內的血藥濃度曲 線圖6具有透皮能力和白細胞介素-10活性的融合蛋白的透皮能力檢測
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中的所有弓I物合成和測序工作均由上海生工完成。實施例1、具有透皮能力和白細胞介素-10活性的融合蛋白編碼基因的獲得用PCR法擴增本發明具有透皮能力和白細胞介素-10活性的融合蛋白的編碼基 因，具體過程包括以下步驟一、pPIC9K的α -Factor信號肽片段擴增1)3’端連接具有人IL-10基因序列，具有Kex2單一蛋白酶酶切位點的α -因子 (a-Factor)信號肽片段編碼序列的擴增以 pPIC9K 質粒(購自 invitrogen 公司)為模板，在引物 P3 (5’ -ATGGATCCAAACG ATGAGATTTC-3，)和引物 P4(5，-TGCCCTGGCCTGGGCTTCTTTTCTCGAGAGATACCC-3，)的引導下 PCR擴增具有Kex2單一蛋白酶酶切位點的α-因子信號肽片段的編碼序列，PCR反應條件 為先94°C 2分鐘；然后94°C 30秒，55°C 40秒，72°C 30秒，共32個循環；最后72°C 10分 鐘。反應結束后，對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大小約250bp的 條帶，與預期結果相符。用BBI公司的PCR產物回收試劑盒回收目的條帶，該片段命名為
“ B—factor’，。2)3’端連接具有透皮肽TD-I序列，具有Kex2單一蛋白酶酶切位點的α -因子 (a-Factor)信號肽片段編碼序列的擴增以 PPIC9K 質粒(購自 invitrogen 公司)為模板，在引物 P3 (5‘-ATGGATCCAAACGAT GAGATTTC-3，)和引物 P7 (5，-CAATGCTTAGAAGGACTAGAAGAACAAGCTCTTTTCTCGAGAGATACCC-3，) 的引導下PCR擴增3’端連接具有轉運肽TD-I序列，并具有Kex2單一蛋白酶酶切位點的 α-因子信號肽片段的編碼序列，PCR反應條件為先94°C 2分鐘；然后94°C 30秒，55°C 40 秒，72°C30秒，共32個循環；最后72°C 10分鐘。反應結束后，對PCR擴增產物進行1 %瓊 脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大小約255bp的條帶，與預期結果相符。用BBI PCR產物回收 試劑盒回收目的條帶，該片段命名為“a-factor/TD-Ι ”。二、人IL-10基因的擴增1)3’端連接具有人IgG Fc-Yl基因序列，并連接具有Kex2單一蛋白酶切位點的 a_因子的人IL-10基因的擴增使用TRIzol(購自invitrogen公司，貨號15596-018)并按其說明書抽取離體的 健康人外周血(購自合肥血站)單核細胞的總RNA，在Turbo Reverse Transcriptase (購 自北京原平皓公司，貨號PC108)的作用下，以oligo dT(購自上海生工，貨號B0181)為
7引物合成人cDNA，以合成的cDNA為模板，在正向引物5，-ATGCACAGCTCAGCACTGCTCTG-3， 和反向引物5，-GTTTCGTATCTTCATTGTCATG-3，的引導下進行PCR，將PCR產物插入到載 體pcDNA3. 1/V5-HiS-TOPO(購自Invitrogen公司，貨號K4800-01)TA克隆位點得到質粒 pcDNA3. I-IL-IO0以質粒 pcDNA3. 1-IL-10 為模板，在上游引物 Pl (5，-CTCGAGAAAAGAAGCCCAGGCCAG GGCACCCAGTC-3，)和下游引物 P2 (5，-GTTTTGTCACAAGATTTGGGCTCGTTTCGTATCTTCATTGTCAT G-3，)的引導下PCR擴增人的IL-IO基因，PCR反應條件為先94°C 2分鐘；然后94°C 30 秒，55°C40秒，72°C 1分鐘，共30個循環；最后72°C 10分鐘。反應結束后，對PCR擴增產 物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大小約540bp的條帶，與預期結果相符。用BBI 公司的PCR產物回收試劑盒回收目的條帶，該片段命名為“ IL-IO/ y 1 ”。2)3’端連接具有人IgG Fc-Yl基因序列，并連接具有Kex2單一蛋白酶切位點的 a-因子并含有轉運肽TDl序列的人IL-IO基因的擴增以質粒 pcDNA3. 1-IL10 為模板，在上游引物 P8 (5，-CTTCTAGTCCTTCTAAGCATTGCG GTAGCCCAGGCCAGGGCACCCAG-3，)和下游引物 P9 (5，-CAAGATTTGGGCTCGTTTCGTATCTTCATTGT C-3’ )的引導下PCR擴增人含有TDl的IL-10基因，PCR反應條件為先94°C 2分鐘；然后 940C 30秒，550C 40秒，72°C 1分鐘，共30個循環；最后72°C 10分鐘。反應結束后，對PCR 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大小約540bp的條帶，與預期結果相符。 用BBI公司的PCR產物回收試劑盒回收目的條帶，該片段命名為“TD1-IL10/ γ 1 ”。三、5’端連接α -Factor信號肽片段編碼序列的人白細胞介素10的基因的擴增1)5’端連接具有Kex2單一蛋白酶酶切位點的α-Factor信號肽片段編碼序列的 人白細胞介素10基因的擴增以步驟二獲得的人IL-10編碼基因“IL-10/γ 1”和步驟一獲得的“a-factor”基 因為模板，在引物 P3(5’ -ATGGATCCAAACGATGAGATTTC-3，)和引物 P2(5’ -GTTTTGTCACAAGAT TTGGGCTCGTTTCGTATCTTCATTGTCATG-3，)的引導下 PCR 擴增 5，端連接具有 Kex2 單一蛋白 酶酶切位點的α-Factor信號肽片段編碼序列的人白細胞介素10基因，PCR反應條件為 940C 2分鐘；94°C 45秒，55°C 45秒，72°C 1. 0分鐘，循環32次；最后72°C 10分鐘。反應結 束后，對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大小約為750bp的條帶，與預 期結果相符。用BBI公司的PCR產物回收試劑盒回收目的條帶，命名為“ α -Factor-ILlO/
Yl”。2)5'端連接具有Kex2單一蛋白酶酶切位點的α -Factor信號肽片段編碼序列和 透皮肽TDl編碼序列的人白細胞介素10基因的擴增以步驟二獲得的人IL-10編碼基因“TD1-IL10/γ 1”和步驟一獲得的“a-factor/ TD-1”基因為模板，在引物 P3(5，-ATGGATCCAAACGATGAGATTTC-3，)和引物 P2(5，-GTTTTGT CACAAGATTTGGGCTCGTTTCGTATCTTCATTGTCATG-3，)的引導下 PCR 擴增 5，端連接具有 Kex2 單一蛋白酶酶切位點的α-Factor信號肽片段編碼序列的人白細胞介素10基因，PCR反 應條件為94°C 2分鐘；94 °C 45秒，55 °C 45秒，72 °C 1. 0分鐘，循環32次；最后72 °C 10 分鐘。反應結束后，對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大小約為 750bp的條帶，與預期結果相符。用BBI公司的PCR產物回收試劑盒回收目的條帶，命名為 “ α -Factor-TDl-ILlO/γ 1”。
四、5，端連接具有人IL-10基因序列人IgG Fc-y 1的擴增。以含有人IgG Fc-γ 1基因的質粒pEF6/V5-His-T0P0-IGH7為模板，在引物P5 (5， -GACAATGAAGATACGAAACGAGCCCAAATCTTG-3，)和 P6 (5，-CTGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGA GG-3，)的引導下進行PCR擴增。PCR反應條件為先94°C 2分鐘；然后94°C 30秒，55°C 40 秒，72°C 1分鐘，共32個循環；最后72°C 10分鐘。反應結束后，對PCR擴增產物進行1 %瓊 脂糖凝膠電泳檢測，結果得到一條大小約700bp的條帶，與預期結果相符，用BBI PCR產物 回收試劑盒回收目的條帶，該片段命名為“-IgG Fc- y 1 ”。五、具有透皮能力和白細胞介素10活性的融合蛋白編碼基因的獲得1)3’端連接具有IgG Fc-Yl序列，5’端連接具有Kex2單一蛋白酶切位點的a_因 子的人IL-10基因的擴增以步驟四擴增的“-IgG Fc-γ 1”基因和步驟三擴增的“ α -Factor-ILIO/γ 1 ”基 因為模板，在引物 P3 (5，-ATGGATCCAAACGATGAGATTTC-3，)和引物 P6(5，-CTGAATTCTCATTT ACCCGGAGACAGGGAGAGG-3’ )的引導下進行PCR擴增。PCR反應條件為先94°C 2分鐘；然 后94°C 30秒，55°C 40秒，72°C 2分鐘，共30個循環；最后72°C 10分鐘。反應結束后，對 PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果得到一條大小約1200bp的條帶，與預期 結果相符。用BBI PCR產物回收試劑盒回收目的條帶，經過測序，該PCR產物具有序列3 的核苷酸，將該PCR產物的基因命名為“α-Factor-ILlO-Fc-Yl”，該基因的蛋白命名為 α -Factor-ILlO-Fc-γ 1，該蛋白的氨基酸為序列表中的序列4。序列表中的序列3由1431個堿基組成，其編碼序列為序列3自5’末端第1-1431 位堿基，序列3自5’末端第256-735位堿基為人IL-10的編碼序列，序列3自5’末端第 736-1431位堿基為人IgG Fc-γ 1的編碼序列，序列3自5’末端第1-255位堿基為具有 Kex2單一蛋白酶酶切位點的α -Factor信號肽片段的編碼序列。序列表中序列4由392個氨基酸殘基組成，自氨基(N)端第1_160位為人IL-10 的氨基酸殘基序列，自氨基端第161-392位為人IgG Fc-Yl的氨基酸殘基序列。 2)3'端連接具有IgG Fc- Y 1序列，5 ’端連接具有Kex2單一蛋白酶切位點的a_因 子并含有轉運肽TDl序列的人IL-10基因的擴增以步驟四擴增的“-IgG Fc-γ 1”基因和步驟三擴增的“ α -Factor-TDl-IL-IO/ Y 1”基因為模板，在引物 P3(5，-ATGGATCCAAACGATGAGATTTC-3，)和引物 P6(5，-CTGAATTC TCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG-3，)的引導下進行PCR擴增。PCR反應條件為先94°C 2分 鐘；然后94°C 30秒，55°C 40秒，72°C 2分鐘，共30個循環；最后72°C 10分鐘。反應結束 后，對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果得到一條大小約1200bp的條帶，與 預期結果相符。用BBI PCR產物回收試劑盒回收目的條帶，經過測序，該PCR產物具有序列 1的核苷酸，將該PCR產物的基因命名為“ α-Factor-TDl-ILlO-Fc-Yl”，該基因的蛋白命 名為a -Factor-TDl-ILlO-Fc-γ 1，該蛋白的氨基酸為序列表中的序列2。序列表中的序列1由1464個堿基組成，其編碼序列為序列1自5’末端第1-1464 位堿基，序列1自5’末端第1-255位堿基為具有Kex2單一蛋白酶酶切位點的α-Factor 信號肽片段的編碼序列，序列1自5’末端第256-288位堿基為轉運肽TDl的編碼序列，序 列1自5，末端第289-768位堿基為人IL-10的編碼序列，序列1自5，末端第769-1464位 堿基為人IgG Fc-Yl的編碼序列。
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序列表中序列2由403個氨基酸殘基組成，自氨基(N)端第1_11位為轉運肽TDl 的氨基酸殘基序列，自氨基(N)端第12-171位為人IL-10的氨基酸殘基序列，自氨基端第 172-403位為人IgG Fc- γ 1的氨基酸殘基序列。實施例2、具有透皮能力和白細胞介素10活性的融合蛋白基因在畢赤酵母中的表 達及表達產物的純化一、具有白細胞介素-10活性融合蛋白基因的畢赤酵母表達載體的構建構建具有白細胞介素-10活性的融合蛋白基因的畢赤酵母表達載體的具體方法 為用限制性內切酶BamHI (購自Promega，貨號R6021)和EcoRI (購自Promega，貨號R6011) 對由實施例 1 獲得的PCR產物“ α -Factor-ILlO-Fc-γ 1”和“ α -Factor-TDl-ILlO-Fc- y 1" 分別進行雙酶切，再將酶切片段分別與經相同酶雙酶切的質粒PPIC9K用T4DNA連接酶(購 自上海生工，貨號EL0015)進行連接，將連接產物分別轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，分 別篩選陽性重組子，分別提質粒，測序，結果為一種質粒為將序列1插入PPIC9K的BamHI和 EcoR I的識別位點間構成的重組載體，將質粒命名為pPIC9K-TDl-IL10-Fc-γ 1(圖1為載 體的部分結構示意圖。)，另一種為將序列3插入pPIC9K的BamHI和EcoR I的識別位點間 構成的重組載體，將質粒命名為pPIC9K-IL10-Fc-γ 1。二、具有透皮能力和白細胞介素-10活性融合蛋白基因在畢赤酵母中的表達1、電轉化畢赤酵母GSl 15菌株用限制性內切酶SalI (購自Promega，貨號R6051)分別對步驟一獲得的 pPIC9K-IL10-Fc- γ 1和pPIC9K-TDl-IL10_Fc- γ 1進行單酶切使其線性化，再按每IOOul畢 赤酵母GSl 15感受態細胞(購自invitrogen公司，貨號C18100)分別各加入20ul兩種線 性化質粒(約IOug)的比例，用0.2cm電轉化杯(購自invitrogen，貨號650031)進行電 轉化(參數設定電壓1500V、電容25uF、電阻200歐姆、放電時間4-5ms)，用MD平板(培 養基配方參見invi trogen公司的產品說明書-A Manual of Methods forExpression of Recombinant Proteins in Pichia pastoris,以下簡稱“ invitrogen 公司的產品說明書”) 和含lmg/L G418(購自Amresco，貨號E859-1G)的Y PD平板(培養基配方參見invitrogen 公司的產品說明書)篩選陽性克隆，分別得到兩種轉化子，將兩種轉化子分別提取質粒，測 序驗證，結果為一種質粒為pPIC9K-IL10-Fc-γ 1，將含有該質粒的陽性克隆命名為GS115/ pPIC9K-IL10-Fc-y 1 ；另一種質粒為pPIC9K-TDl-IL10_Fc-γ 1，將含有該質粒的陽性克隆 命名為 GS115/pPIC9K-TDl-IL10-Fc- γ 1。采用同樣的方法將空載體pPIC9K轉染畢赤酵母GS115菌株，獲得重組菌GS115/ PPIC9K，將重組菌提取質粒測序驗證，結果為既不含有α -Factor-ILlO-Fc- γ 1的序列(序 列 3)，也不含有 α -Factor-TDl-ILlO-Fc- y 1 (序列 1)。2、具有白細胞介素-10活性的融合蛋白的誘導表達分別挑取步驟1 獲得的 GS115/pPIC9K-IL10_Fc-γ 1 和 GS115/ pPIC9K-TDl-IL10-Fc- γ 1，將分別接種于MGY液體培養基(培養基配方參見invitrogen公 司的產品說明書)中，以GSl 15/pPIC9K為對照，在30°C、250rpm下培養至0D600約為2_6，分 別離心收集細胞，用含體積百分濃度0. 5%甲醇的BMMY(培養基配方參見invitrogen公司 的產品說明書)進行誘導，每隔24h補加0.5%甲醇(體積百分含量，甲醇占初始發酵培養 基體積的百分含量。)，第4天停止誘導，將離心收集的菌體細胞加入含體積百分濃度0. 5%
10甲醇的BMMY的當天記作第0天。將發酵容器中所有物質記作培養物。培養結束后，IOOOOg離心10分鐘，分別收集上清液，分別得到融合蛋白，命名為 IL10-IgG/Fc- y 1和TDl-ILlO-IgG/Fc- γ 1。將發酵容器中的所有產物記作培養物。采用同樣的方法對重組菌GS115/pPIC9K進行誘導表達、收集上清液得到對照蛋白。3、陽性克隆表達產物的鑒定1)用ELISA法測定培養上清中融合蛋白的表達量采用Bender公司的人IL-10ELISA試劑盒(購自Bender公司，貨號BSM215/ MST)并參照試劑盒說明書對步驟2得到的融合蛋白ILlO-IgG/Fc-γ 1和TDl-ILlO-IgG/ Fc-Yl進行篩選，并對融合蛋白的分泌量進行檢測。以上述對照蛋白為對照。結果融合蛋 白IL10-IgG/Fc-y 1和TDl-IL10-IgG/Fc-y 1的檢測結果呈陽性，表明融合蛋白均得到了 正確表達，且融合蛋白表達量均為10mg/L以上清液。2) Western Blot 鑒定將步驟2得到的融合蛋白IL10-IgG/Fc- γ 1和TDl-ILlO-IgG/Fc- Y 1先進行 還原SDS-PAGE電泳，再進行Western blot檢測，Western blot檢測時所用的一抗為 anti_IL_10mAb (購自 Santa Cruz,貨號:sc8438)、anti-TD-I VX R HRP-conjugatedgoat anti HuIgG(H+L)抗體(購自廣州中杉，貨號 ZB2304) 二抗為 anti-mouselgG-HRP (購自 Bio Legend，貨號 405306)、anti-rabbit IgG-HRP (購自 santa cruz，貨號 sc-2004)。檢測結果 如圖2所示，從圖中可以看出，融合蛋白IL10-IgG/Fc- y 1 (ILlO-Fc- γ 1)和TDl-ILlO-IgG/ Fc-y l(TDl-IL10-Fc-y 1)均得到了正確的表達。 三、融合蛋白的濃縮及純化1、用Mabselect對表達本發明融合蛋白表達上清進行濃縮和純化先用Mabselect (購自GE，貨號17-5199_01)對步驟2得到的融合蛋白 pPIC9K-IL10-Fc-y 1和pPIC9K-TDl-IL10_Fc-γ 1分別進行濃縮和純化，包括以下步驟1)分別取300mL上述步驟二中的2獲得的培養物，IOOOOg離心lOmin，離心上清再 過0. 45um濾膜(上海半島)，并用50Kd超濾管(購自millipore，貨號UFC905096)對其 經行超濾濃縮至30ml ；2)濃縮液再經0.45um濾膜(上海半島)過濾后，通過經Binding buffer (由 17. 55gNaCl 和 1000ml 濃度為 20mM、pH 為 8. 0 的 Tris · HCl 組成)平衡后的 Mabselect 層 析柱；經過5-10個柱體積的Binding buffer沖洗之后，與Mabselect結合的融合蛋白經醋 酸鈉緩沖液(NaAc 50mM, pH 3. 5)洗脫。然后加入中和 buffer (1. 5M Tris · HCl, pH 8. 0) 調節PH至中性，分別獲得Mabselect純化的融合蛋白IL10-IgG/Fc-γ 1和TDl-ILlO-IgG/ Fc- γ I。3)融合蛋白的純度可以用SDS-PAGE檢測將上述2)獲得的Mab-select純化的融合蛋白融合蛋白ILlO-IgG/ Fc-y KILlO-Fc-Y 1)和 TDl-IL10-IgG/Fc- y 1 (TDI-ILIO-Fc- γ 1)分別使用非還原凝膠 電泳(Non-reduced)，如圖3A所示，目的產物在IlOKd附件，比理論值(約90kd)偏大，可能 由于酵母具有一定程度的糖基化所致。經過Mabselect —步純化，使目的蛋白得到進一步 富集，獲得Mabselect純化的融合蛋白IL10-IgG/Fc-γ 1和TDl-ILlO-IgG/Fc-γ 1，并且純度均達到70%。2、S200分子篩層析純化將經步驟1 獲得 Mabselect 純化的融合蛋白 ILlO-IgG/Fc- γ 1 和 TDl-ILlO-IgG/ Fc-Y 1分別用S200預裝柱(購自GE，貨號17121104)做進一步純化，用洗脫液(由17. 55g NaCl和IOOOml濃度為20mM、pH為8. 0的Tris · HCl組成)進行洗脫，分別收集洗脫液得 到S200HR分子篩層析純化的融合蛋白IL10-IgG/Fc- γ 1和TDl-ILlO-IgG/Fc- γ 1。對S200HR 分子篩層析純化的融合蛋白 IL10-IgG/Fc-γ 1 和 TDl-IL10-IgG/Fc-γ 1 分別進行非還原凝膠電泳(Non-reduced)和還原凝膠電泳(reduced)，結果如圖3B所示，從 圖中看出，經過S200分子篩純化后，獲得純度為95%的S200分子篩層析純化的融合蛋白 IL10-IgG/Fc-y 1和95%的S200分子篩層析純化的融合蛋白TDl-ILlO-IgG/Fc-γ 1。實施例3、融合蛋白的IL-10活性檢測外周血淋巴細胞(PBMC)的培養基RPMI-1640(購自HyClone，貨號SH30809. 01B)；取一個單位的健康人外周血(購自合肥血站)，使用Ficoll (購自天津灝洋生物 制品科技有限公司，貨號LTS1077)并按照其使用說明分離外周血淋巴細胞(PBMC)。于 96孔板中加入0. Iml人PBMC (2 X 105細胞)，分別加入不同稀釋濃度的由實施例2得到 的S200分子篩層析純化的融合蛋白ILlO-IgG/Fc-γΙ、S200分子篩層析純化的融合蛋 白 TDl-IL10-IgG/Fc-y 1 以及商品化的 rhIL-10 (購自 Rochy Hill 公司，貨號:200_10)， 每個稀釋度設置三個復孔，于37°C 5 %的C02培養24h后，再加入終濃度為0. lug/ml的 PHA-P(購自sigma，貨號L8754)，空白對照孔(加的是等體積的培養基)不加PHA-P。以 實施例2獲得的純化的對照蛋白作為陰性對照。于37°C 5%的CO2繼續培養24h后，收集每 孔上清，使用人IFN- y ELISA試劑盒(購自Bender Medsystems公司，貨號BSM228TEN)并 參照試劑盒說明書對各樣品中人IFN- γ表達水平，實驗重復三次，結果取平均值。實驗結果如圖4所示，TDl-IL10-IgG/Fc-γ I(TDI-ILIO-Fc)在 0.05,0. 1,0. 2,0. 5、1、10、20ng/ml 濃度 下，產生 IFN-Y 的量分別為 39. 76,26. 54、19. 74、15. 85、15. 26,7. 91,7. 12pg/ml ；IL10-IgG/Fc- y 1 (ILlO-Fc)在 0. 05,0. 1、0· 2、0· 5、1、10、20ng/ml 濃度下，產生 IFN-y 的量分別為 60. 68,23. 54,23. 80、18. 11、17. 41、10. 06、18. 70pg/ml ；rhIL-10 (IL-10)在 0. 05,0. 1,0. 2,0. 5、1、10、20ng/ml 濃度下，產生 IFN-γ 的量分 別為 74. 68,38. 97,37. 53,28. 01,23. 70,20. 33,17. 26pg/ml ；從圖中看出，融合蛋白TDl-IL10-IgG/Fc-γ I(TDI-ILIO-Fc)與作對照的商品 ^rhIL-IO(IL-IO)相比，具有更高的IL-10抑制活性，與另一對照融合蛋白ILlO-IgG/ Fc-y I(ILlO-Fc)相比，活性相當，均能夠顯著的抑制人PBMC細胞在PHA-P的誘導下產生 IFN-Y。空白對照孔和陰性對照均無活性。實施例4、具有透皮能力和白細胞介素10活性的融合蛋白在大鼠體內的半衰期測 定通過尾靜脈注射，將商品化的rhIL-10 (購自Rochy Hill公司，貨號200_10)和由 實施例2獲得的S200分子篩層析純化的融合蛋白IL-10-IgG/Fc- γ 1和S200分子篩層析 純化的融合蛋白TDl-ILlO-IgG/Fc- γ 1分別注入平均體重約200g的SD大鼠(注射劑量 200ng/Kg 體重)。注射后，在不同時間點(0、1、2、4、6、8、12、24、36、48、60、72、96 小時)通過剪尾取血法收集血樣(每個時間點用4只大鼠)，肝素鈉抗凝，將采集的血樣12000g離心 5min，收集血清，-70°C冷凍保藏。將血樣用人IL-10ELISA試劑盒(購自Bender Medsystem 公司，貨號BSM215/MST)并參照說明書檢測血清中本發明具有白細胞介素-10活性的融合 蛋白的含量，并根據結果繪制出反映蛋白含量變化的曲線圖。實驗重復三次，結果取平均 值，如圖5所示。從圖中看出，融合蛋白TDl-IL10-IgG/Fc-Yl(TDl-IL10-Fc)消除半衰期約為24 小時，而用作對照的商品化rhIL-10 (IL-10)經尾靜脈注射后，消除半衰期不到4小時，表明 融合蛋白TDl-ILlO-IgG/Fc-γΙ的半衰期較之rhIL_10對照品具有很大程度的提高，與另 一對照融合蛋白ILlO-IgG/Fc-γ I(ILlO-Fc)消除半衰期相近。實施例5、具有透皮能力和白細胞介素10活性的融合蛋白在大鼠體內透皮能力的 測定將實施例2得到獲得的S200分子篩層析純化的融合蛋白IL-10-IgG/Fc-γ 1和 S200分子篩層析純化的融合蛋白TDl-ILlO-IgG/Fc-γ 1分別取200ul (0. lug/ul)涂抹到 平均體重約200g的SD大鼠腹部皮膚上，每個樣品涂抹3只大鼠。5小時后心臟取血收集 血樣，肝素鈉抗凝，將采集的血樣12000g離心5min，收集血清，-70°C冷凍保藏。將血樣用 人IL-10ELISA試劑盒(購自Bender Medsystem公司，貨號BSM215/MST)并參照說明書檢 測血清中本發明具有透皮能力和白細胞介素10活性的融合蛋白的含量，并根據結果繪制 出反映蛋白含量變化的柱狀圖。以實施例2獲得的純化的對照蛋白作為陰性對照。結果見圖6所示，融合蛋白TDl-IL10-IgG/Fc- y 1 (TDI-ILIO-Fc)進入血液的量為 8. 3pg/ml ；融合蛋白IL10-IgG/Fc- y 1 (ILlO-Fc)進入血液的量為 1. 5pg/ml ；可以看出，融合蛋白TDl-ILlO-IgG/Fc-γ 1進入血液的量要明顯高于對照融合蛋 白 ILlO-IgG/Fc-γ 1，顯示 TDl-ILlO-IgG/Fc-γ 1 具有一定的透皮能力。
1權利要求
一種融合蛋白，是在人白細胞介素10蛋白的羧基末端連接如下任一所述蛋白，且在氨基末端連接轉運肽形成的融合蛋白1)人IgG Fc γ1或其突變蛋白；2)人IgG Fc γ2或其突變蛋白；所述人白細胞介素10蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2自氨基末端第12 171位的氨基酸序列；所述轉運肽的氨基酸序列為序列表中序列2自氨基末端第1 11位的氨基酸序列。
2.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白為如下1)或2)的蛋白1)序列表中的序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白；2)將序列2的氨基酸序列經過幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有透皮能力和 人白細胞介素10活性的由1)衍生的蛋白。
3.權利要求1或2所述融合蛋白的編碼基因。
4.根據權利要求3所述融合蛋白的編碼基因，其特征在于所述融合蛋白的編碼基因 是下述1)_4)中任一所述基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5，末端第256-1464位核苷酸所示的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼具有透皮能力和人白細胞 介素-10活性蛋白所示的DNA分子；4)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA分子雜交的且編碼具有透皮能力和人白細胞介 素-10活性蛋白所示的DNA分子。
5.含有權利要求3或4所述融合蛋白的編碼基因的重組表達載體、轉基因細胞系、表達 盒或重組菌。
6.根據權利要求5所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為將權利要求3或4所述融合蛋白的編碼基因插入如下任一出發載 體的多克隆位點得到的載體pPIC9K、pPIC9、pPIC3、pPICZ α、pHIL-Dl、pA0804、pA0815 或 pPSC3K。
7.根據權利要求5所述的重組菌，其特征在于所述重組菌為將權利要求5或6所述 的重組表達載體導入宿主菌得到的重組菌，所述宿主菌優選為畢氏酵母，所述畢氏酵母尤 其優選為 GS115、KM71 或 SMD1168。
8.一種制備權利要求1或2所述融合蛋白的方法，包括如下步驟1)誘導培養權利要求5或7所述重組菌，離心收集上清液；2)純化步驟1)獲得的上清液，得到融合蛋白；在步驟1)中，所述誘導培養的溫度為30°C，所述誘導所用的培養基為添加有甲醇的培 養基，所述甲醇在所述誘導所用的培養基中的濃度為0. 5% (體積百分含量)，所述誘導方 式為每隔24h補加甲醇至終濃度為0. 5% (體積百分含量)；在步驟2)中，所述純化的方式為依次進行親和層析和分子篩層析，所述親和層析的 層析柱優選為Mabselect，所述分子篩層析的層析柱優選為S200HR預裝柱；所述親和層析的洗脫液為濃度為50mM、pH為3. 5的醋酸鈉水溶液；所述分子篩層析的洗脫液由17. 55g氯化鈉和IOOOml濃度為20mM、pH為8. 0的 Tris · HCl緩沖液組成。
9.權利要求1或2所述的融合蛋白在制備治療自身免疫性疾病藥物中的應用；或權利 要求3或4所述融合蛋白的編碼基因在制備治療自身免疫性疾病藥物中的應用；或權利要 求1或2所述的融合蛋白在制備抑制IFN-Y產生的抑制劑中的應用；或權利要求3或4所 述融合蛋白的編碼基因在制備抑制IFN-Y產生的抑制劑中的應用；所述自身免疫性疾病優選為銀屑病。
10.一種治療自身免疫性疾病藥物，其活性成分為權利要求1或2所述的融合蛋白、權 利要求3或4所述融合蛋白的編碼基因或權利要求5或6所述的重組表達載體；一種抑制IFN-Y產生的抑制劑，其活性成分為權利要求1或2所述的融合蛋白、權利 要求3或4所述融合蛋白的編碼基因或權利要求5或6所述的重組表達載體。
全文摘要
本發明公開了具有透皮能力和白細胞介素-10活性的融合蛋白及其編碼基因與應用。本發明提供了一種融合蛋白，是在人白細胞介素10蛋白的羧基末端連接如下任一所述蛋白，且在氨基末端連接轉運肽形成的融合蛋白1)人IgG Fc-γ1或其突變蛋白；2)人IgG Fc-γ2或其突變蛋白；所述人白細胞介素10蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2自氨基末端第12-171位的氨基酸序列；所述轉運肽的氨基酸序列為序列表中序列2自氨基末端第1-11位的氨基酸序列。本發明的實驗證明，本發明提供了一種同時具有透皮能力和白細胞介素10活性的融合蛋白，在治療自身免疫性反應特別是銀屑病藥物的制備領域具有較大的實際意義和廣闊的應用前景。
文檔編號C12N1/15GK101962413SQ20101029008
公開日2011年2月2日 申請日期2010年9月21日 優先權日2010年9月21日
發明者康文瑤, 張力, 李光偉, 溫龍平, 滿娜, 肖衛華, 郭雨剛 申請人:中國科學技術大學