專利名稱：一種用于陸地棉抗黃萎病性狀輔助選擇育種的分子標記的制作方法
技術領域：
本發明屬于棉花遺傳育種技術領域，涉及用于陸地棉抗黃萎病性狀輔助選擇育種 的分子標記，具體涉及陸地棉抗黃萎病性狀的分子標記定位、分子標記輔助選擇效果評價 及育種應用。
背景技術：
利用分子標記技術，篩選不受環境因子影響，并與我國現有的抗黃萎病種質的抗 性基因緊密連鎖的分子標記，就可應用于輔助選擇抗病育種，從而加速抗黃萎病育種的進程。篩選與數量性狀基因相連鎖的分子標記的常用方法是進行QTL定位。QTL定位通 過分子標記進行遺傳連鎖分析，檢測數量性狀基因座并估算其效應大小。由于陸地棉種內 的遺傳基礎比較狹窄，國內外在進行棉花抗黃萎病性狀的QTL定位時，常用陸地棉和海島 棉的種間雜交來構建分離群體(高玉千等，棉花抗黃萎病基因的QTL定位，棉花學報，2003， 15(2) 73 78 ；杜威世等，棉花黃萎病抗性基因SSR標記研究，西北農林科技大學學報， 2004,32(3) :20 24 ;Bolek 等，Mapping of verticillium wilt resistance genes in cotton, Plant Science, 2005,168 :1581 1590 ；甄瑞等，海島棉抗黃萎病基因SSR標記研 究，棉花學報，2006，18 (5) :269 272 ；昝偉等，海島棉抗黃萎病性狀分子標記的研究及QTL 的定位，新疆農業科學，2008，45 (5) :805 808)，這樣得到的抗病QTL常常來自海島棉親 本，獲得的分子標記只適用于海島棉與陸地棉的雜交組合后代進行分子標記輔助選擇(李 志坤等，棉花抗黃萎病基因的分子標記輔助選擇研究。中國科技論文在線，http://www. paper, edu. cn)。而當前棉花生產及育種實踐中大量使用的是陸地棉品種或陸地棉與陸地 棉品種之間配制的雜交組合，因此，如何發掘并有效利用陸地棉品種中與抗性基因相連鎖 的分子標記，是實現分子標記輔助選擇抗病育種的關鍵。對于陸地棉抗黃萎病基因的分子標記研究，目前僅限于找到了抗病標記，并沒有 深入地對這些抗病相關的標記進行抗性方面的研究(蔣鋒等，陸地棉抗黃萎病基因的分子 標記定位。中國科學C輯，2009，39 :849-861)，或者在驗證分子標記的輔助選擇效果時，僅 僅局限于雙親分離群體，而沒有將其應用到整個大田育種群體(王芙蓉等，陸地棉品種抗 黃萎病性狀的分子標記及其輔助選擇效果。棉花學報，2007，19 =424-430) 0為了開發陸地棉抗黃萎病性狀的分子標記，申請人構建了陸地棉種內的分子標記 遺傳連鎖圖譜，利用單因子方差分析及復合區間作圖對抗黃萎病性狀進行QTL定位，選用 進入連鎖群區段的顯著性SSR標記及其與QTLs連鎖的SSR標記對不同的陸地棉株系進行 篩選，最終得到了可用于陸地棉抗黃萎病分子標記輔助選擇育種的標記組合。

發明內容
本發明需要解決的問題是獲得適用于陸地棉抗黃萎病分子標記輔助選擇育種的 分子標記，包括其引物和引物組合，并將其用于陸地棉抗病材料的選育。
為實現上述目的，本發明通過以下技術方案實現適用于陸地棉抗黃萎病分子標記輔助選擇育種的SSR分子標記，按照下列步驟獲 的1.構建抗黃萎病陸地棉品種‘常抗棉’和感黃萎病陸地棉標準系‘ΤΜ-Γ雜交的F2 分離群體，利用SSR、RAPD和SRAP三種分子標記構建陸地棉品種間分子標記遺傳連鎖圖，同 時利用F2 3家系對抗黃萎病性狀進行分子標記定位。結果如圖1所示。2.選擇單因子方差分析中表現顯著性的SSR標記，和復合區間作圖分析中與抗性 QTL緊密連鎖的SSR標記。這些標記在連鎖圖譜上的分布在附圖1中用下劃線標出。3.選擇不同的陸地棉株系，利用病圃對這些陸地棉株系進行抗黃萎病性鑒定，這 些株系的編號及系圃在附圖2所示。4.從田間取步驟3)的陸地棉株系和常抗棉、TM-I植株的嫩綠葉片提取其總DNA。5.用步驟2)的SSR引物擴增步驟4)所示的材料(附圖3)。6.分析圖2所示的陸地棉株系標記基因型，獲得陸地棉抗黃萎病性狀的分子標 記，附圖4。7.利用獲得的抗黃萎病相關的SSR分子標記，對不同陸地棉株系進行分子標記輔 助選擇，最后得到抗黃萎病的株系。本發明的有益效果是1.本發明將陸地棉株系按標記基因型分為“抗病標記基因型”和“感病標記基因 型”，在對株系進行分子標記輔助選擇時，首先淘汰掉大部分“感病標記基因型”株系和“感 病”表現型株系，大大減小了選擇的工作量；同時，要求當選株系在基因型上含有一個以上 的本發明獲得的抗黃萎病相關的分子標記，在表現型上要求“抗病”或“耐病”，保證了表現 型和基因型的一致性，大大提高了選擇的效率和準確性。2.綜合利用本發明的3個標記(附圖4種只標出了兩個)對陸地棉株系進行篩 選，決選到的5個抗黃萎病株系在2008年、2009年的相對病指，最高的為19. 94，最低得為 15. 31，按抗病反應型分級標準全都達到了抗病水平。這說明利用本發明獲得的分子標記還 可以篩選到抗病性表現穩定的陸地棉株系，提高抗病育種中選擇的效率和選擇的準確性。


圖1 是本發明實施例1所構建的棉花分子標記遺傳連鎖圖譜(常抗棉和TM-I的 F2代的遺傳連鎖圖譜)及其QTL定位信息，其中帶下畫線的標記為本發明實施例1所選擇 的SSR標記，含SSR標記39個，RAPD標記2個，SRAP標記7個，圖距由Kosombi函數轉化而 來，最大圖距46. IcM圖2 是本發明實施的棉花株系編號及其系譜來源。圖3 是本發明的引物對棉花株系的擴增圖(SSR引物在陸地棉后代選系中的基因 型)，M為Marker ；UMarker ；2、TM-I ；3、常抗棉；其它泳道為陸地棉后代選系。圖4 是本發明獲得的陸地棉抗黃萎病性狀的分子標記序列。
具體實施例方式實施例11.取96個陸地棉株系(如圖2所示)，分別以常抗棉、TM-I作為對照，將所述的材料種于黃萎病病圃，單行區，兩次重復；2.于播種前接種中等致病力的安陽菌系黃萎病菌，于6月、7月、8月黃萎病發病高 峰期以感病對照病株率達80%或病指達50左右時，調查各供試材料的發病情況，采用5級 制進行棉花黃萎病分級(表1)，并計算病情指數和相對病情指數，最后按材料計算其平均 數作為平均病指。病情指數和相對病情指數的計算公式如下病情指數DI =(一級病株數X 1+ 二級病株數X 2+三級病株數X 3+四級病株 數X 4) + (調查總株數X 4)X 100相對病情指數RDI =校正系數KX鑒定材料病指校正系數K = 50/感病對照的實際病指，50為規定感病對照的標準病指表1
權利要求
1.一種用于陸地棉抗黃萎病性狀輔助選擇育種的分子標記，其特征在于，按照下列步 驟獲得1)利用抗黃萎病陸地棉品種“常抗棉”和感黃萎病陸地棉標準系“TM-1”雜交的F2分 離群體，對抗黃萎病性狀進行分子標記定位。2)依據SSR標記，對田間育種群體進行分組。3)分析每組的相對病指與標記基因型的有效性符合情況。4)標記基因型組間的相對病指差異顯著或極顯著的標記，被確定為陸地棉抗黃萎病輔 助選擇育種的SSR分子標記。
2.根據權利要求1所述的對抗黃萎病性狀進行標記定位，其特征在于用SSR、RAPD和 SRAP三種標記構建遺傳連鎖圖，再用F2 3家系對抗黃萎病性狀進行標記定位。
3.根據權利要求1所述的依據SSR標記，對田間育種群體進行分組，其特征在于依據 表現顯著性的SSR標記和復合區間作圖中與抗性QTL緊密連鎖的SSR標記的基因型，對群 體進行+_標記記錄分組。
4.根據權利要求1所述的分析每組的相對病指與標記基因型的有效性符合情況，其特 征在于計算每組的平均相對病指，每組的相對病指數值大小按無標記純合基因型(一)、 雜合基因型(+_)、有標記純合基因型(++)的排列順序依次遞減，則確定該標記在輔助選擇 上具有有效性。
5.根據權利要求1所述的標記基因型組間的相對病指差異顯著或極顯著的標記，其特 征在于對初步確定的有效性標記，對其每組的平均相對病指數值進行差異顯著性分析，達 到顯著或極顯著水平差異的標記。
6.根據權利要求1所述的被確定為陸地棉抗黃萎病輔助選擇育種的SSR分子標記，其 特征在于SSR標記有三個，標記名稱分別為BNL1721、BNL2733、BNL3452。
7.根據權利要求6所述的三個SSR標記，其特征在于每個SSR標記相應地需用三對 上、下游引物進行擴增。
8.根據權利要求7所述的SSR標記相應地上、下游引物，其特征在于標記 BNL1721 的上游引物(5 ‘ -3 ‘)為 TGTCGGAATCTTAAGACCGG、下游引物(5 ‘ -3 ‘)為 GCGCAGATCCTCTTACCAAA，標記 BNL2733 的上游引物(5' -3')為 TCGAGGGTTTAGGGTTCCTG、 下游引物(5‘ -3')為 AATTGTGCAACACCTCCCTC，標記 BNU452 的上游引物(5' -3')為 TGTAACTGAGCAGCCGTACG、下游引物(5' -3')為 GCCAAAGCAGAGTGAGATCC。
全文摘要
本發明涉及一種用于陸地棉抗黃萎病性狀輔助選擇育種的分子標記，屬于棉花遺傳育種技術領域。通過構建陸地棉種內的分子標記遺傳連鎖圖譜，對抗黃萎病性狀進行QTL定位，選用進入連鎖群區段的顯著性SSR標記及其與抗病QTLs連鎖的SSR標記對不同的陸地棉株系進行篩選，最終得到了可用于陸地棉抗黃萎病分子標記輔助選擇育種的三個SSR標記。這三個標記包括其引物和引物組合，適用于陸地棉抗黃萎病分子標記輔助選擇育種。利用獲得的分子標記，對不同陸地棉株系進行抗黃萎病分子標記輔助選擇，最后得到抗黃萎病的株系。
文檔編號C12Q1/68GK102080080SQ20101029445
公開日2011年6月1日 申請日期2010年9月28日 優先權日2010年9月28日
發明者李運海, 桑曉慧, 王紅梅, 趙云雷, 陳偉, 龔海燕 申請人:中國農業科學院棉花研究所