專利名稱：一種抗黑色素瘤的ctl多表位肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥生物學技術領域，具體涉及用基因工程方法制備抗黑色素瘤的 CTL多表位肽及其疫苗。
背景技術：
黑色素瘤是一種源于皮膚、粘膜、眼和中樞神經系統色素沉著區域的黑素細胞的 惡性腫瘤。該腫瘤轉移發生早，擴散迅速，往往在醫生作出診斷之前，癌細胞已經擴散全身。 一旦被評估為惡性腫瘤后，可在診斷數月后死亡，是目前已知死亡率最高的一種皮膚癌。傳 統上以手術切除為主要治療方法，其手術效果與腫瘤的組織學類型、病變侵襲深度及有無 淋巴結轉移等直接相關。由于患者多數發現較晚，故一般認為術后五年生存率僅在20% 30%之間。因為基底細胞癌對放射治療敏感，如癌體離臉緣較遠和累及范圍較小者，可以單 獨應用放射治療。但是放射治療也可能會帶來一些并發癥，如放射性皮炎、角膜炎及白內障寸。
分子靶向藥物和化療聯合應用是目前提高黑色素瘤術后生存率最有前景的治療 方法。腫瘤疫苗屬于新型分子靶向藥物的一種，它是用腫瘤細胞、腫瘤細胞裂解物或腫瘤抗 原刺激機體免疫系統產生特異性抗腫瘤細胞免疫效應，是一種新型的腫瘤治療方法，也是 一種主動性免疫療法。黑色素瘤細胞大多數具有特異性抗原，針對這些抗原可以設計多種 類型疫苗。
人黑色素瘤抗原MAGE-I (AAN62752)和MAGE-3 (AAA 17446)是一種CT抗原，在多種 腫瘤組織中分布，而在正常組織中除了封閉性的組織如睪丸和卵巢之外沒有表達。因此是 一類理想的可用于主動免疫治療的腫瘤抗原。MAGE-3蛋白的表位肽以及用這些肽刺激的 樹突狀已經被應用于腫瘤動物模型和臨床前期研究，并且已經取得了一定的療效。但其缺 點也十分明顯，如制備的代價、刺激免疫反應的強度和機體個體間的MHC限制性差異等，都 是肽疫苗的應用所必須面臨的問題(宋淑霞，劉貴然等，人黑色素瘤抗原MAGE-3腫瘤疫苗 的構建及其誘導HLA-A*0201轉基因小鼠CTL活性的觀察，腫瘤防治研究2007年第34卷第 10 期:739-742)。
抗腫瘤的核酸疫苗作為近幾年新興的一種疫苗，與其他種類疫苗相比有其獨特的 優點1.抗原合成與遞呈過程與病原的自然感染相似，核酸疫苗在機體內所表達的蛋白將 以天然蛋白形式出現；2.免疫原單一，只有編碼所需抗原基因導入細胞得到表達，載體本 身沒有抗原性；3.能在體內持續表達，持續刺激免疫系統；4.易操作性和穩定性，可以方便 地制備出多價核酸疫苗；5.當在質粒中整合入CKs (cytokines)或共刺激分子基因，或與編 碼這一成分的質粒共注射時，將能加強隨后機體對編碼抗原的反應，或可調節正在起作用 的免疫反應。
HLA-A2. 1/Kb轉基因小鼠表達人的HLA_A*0201分子，是研究HLA-A2. 1限制性T細 胞反應及評價HLA-A2. 1限制性表位疫苗的重要模型。這種嵌合型轉基因小鼠已被用于更 精確地篩選來自乙型肝炎、丙型肝炎及人乳頭瘤病毒的一系列HLA-A2. 1限制性表位。本研究將HLA-A0201基因及攜帶多表位的HBc基因片段同時轉染小鼠B16腫瘤細胞，該細胞可 以在C57BL小鼠體內生長而不會被排斥，這樣即可通過體內實驗來研究疫苗的評價效果及 免疫機制。發明內容
本發明的目的在于提供一種抗黑色素瘤的CTL多表位肽及其在制備核酸疫苗中 的應用。
本發明針對目前抗黑色素瘤肽疫苗成本昂貴、制備困難、刺激免疫強度大等缺陷， 將來自MAGE-1，MAGE-3兩個不同抗原的三個限制性表位以串聯方式構建一種兼具簡易制 備、穩定表達和高特異性的多表位多肽，以及含有該表位多肽的腫瘤核酸疫苗，以達到預防 和治療黑色素瘤的目的。
因此，本發明的首要方面是一種重組多表位黑色素瘤細胞疫苗。該疫苗包括一種 重組蛋白，所述重組蛋白包括與HLA-A*0201限制性的⑶8+ T淋巴細胞的多個候選表位對 應的表位肽。
本發明的第二方面是一種HCC多表位序列及其表達質粒pc-HE，它包括編碼來自 MAGE-I和MAGE-3抗原的多個HLA-A2限制的表位的HBC (l_75aa)-多表位-HBc (75_144aa) 嵌合基因序列，克隆到真核表達質粒pcDNA3. lV5-His B。該表達質粒為長度6. 11Λ的環形 雙鏈。
本發明的第三方面是一種可用大規模制備的共表達質粒pc-HH。所述表達質 粒為長度9. 3kb的環形雙鏈，克隆有HBc (l-75aa)-多表位-HBc (75-144aa)嵌合基因和 HLA-A*0201/Kb融合基因序列。
本發明的表達質粒pc-HE的構建，系將HBc (l-75aa)_多表位-HBc (75_144aa)嵌 合基因用Hind III和Xho I雙酶切，然后與用Hind III和Xho I雙酶切的pcDNA3. 1-V5/ HisB相連。
本發明的表達質粒pc-HH的構建，系將HBc (l-75aa)_多表位-HBc (75_144aa)嵌 合基因和HLA-A*0201/Kb融合基因用Mlu I和Bio I雙酶切，然后然后與用Mlu I和Bio I 雙酶切的PlRES相連。
HBC (l-75aa)-多表位-HBc (75_144aa)嵌合基因的制備方法，其特征在于包括如 下步驟
將編碼HBcAg (aal-75)、HBcAg (aa76_144)和多表位的基因序列經PCR的方法進行 連接，形成一個HBC(l-75aa)_多表位-HBc(75-144aa)嵌合基因。取200g HLA-A2轉基因 小鼠的脾臟組織樣本，抽取總RNA，逆轉錄合成cDNA。再以cDNA為模板，用PCR方法分別擴 增HLA-A*0201與H-2kb基因。然后采用重疊區延伸法連接，得到融合基因HLA_A*0201/Kb。
表達質粒pc-HH，所述表達質粒為長度9. 3Kb的環形雙鏈，克隆有編碼 HBC(l-75aa)-多表位-HBc (75-144aa)嵌合基因和融合基因HLA_A*0201/Kb的基因序列，并 含有T7啟動子。
表達質粒PC-HH的構建方法，系將HBc (l-75aa)-多表位-HBc (75-144aa)嵌合基 因和HLA-A*0201/Kb融合基因用Mlu I和Xho I雙酶切，然后然后與用Mlu I和Xho I雙 酶切的PlRES相連。
工程菌BL21 (pc-HH)，為大腸桿菌 BL21-CP-RIL。
本發明構建的HBc-多表位基因和HLA_A*0201/Kb融合基因的共表達質粒能共表 達HBc-多表位基因與HLA-A*0201/Kb融合基因，表達產物能保留各自的生物學活性，從而 得到一種具有CTL多個抗原表位并能對其抗原遞呈功能方便鑒定的HCC多表位疫苗。
本發明構建的真核表達載體pc-HH可穩定轉染黑色素瘤B16細胞，分別用RT-PCR、 western blot、細胞流式檢測重組表達載體穩定轉染細胞中目的抗原的表達情況，pc-HH重 組子穩定轉染的細胞株可見目的蛋白的表達，而對照空表達載體穩定轉染的細胞株未見目 的蛋白的表達，說明檢測到的信號是特異的。


圖1 重疊延伸PCR法構建質粒pc-HE示意圖
其中圖A為多表位核酸疫苗的構建與鑒定。第M列是核酸分子量marker，第1列是 PCR擴增的HBc (aal-75)序列，第2列是PCR擴增的多表位基因，第3列是HBc (aal-75)和 多表位基因連接產物，第4列是PCR擴增的HBc (aa76-144)序列，第5列是HBc (aal-75)-多 表位基因-HBc (aa76-144)的全場序列；圖B為攜帶有多表位序列的HbcAg基因克隆插入 pcDNA3. 1/V5-His B 表達質粒。
圖2 重疊延伸PCR法構建質粒pc-HH電泳圖
其中圖A是HLA/H_2kb的PCR產物在1. 0%瓊脂糖凝膠中的核酸電泳圖。第1列是 經PCR擴增的HLA_A*0201 α 1, α 2結構域，第2列是PCR擴增的α 3和H_2kb胞漿功能區， 第3列是HLA-A*0201/H-2kb嵌合基因；圖B是pc-HH的電泳鑒定。第1列是XhoI和MluI 酶切消化的pIRES—HLA/H-2kb，第2列是Mc I和Xba I酶切消化的pIRES—HLA/H-2kb，M 列是核酸分子量marker。圖C是HLA-A*0201/H_2kb嵌合基因和HBc/multi印itope的克隆 圖。
圖3 候選肽的HLA_A*0201親和力分析
用10mg/ml的DMSO溶解合成肽，并用PBS稀釋至終濃度lmg/ml。在T2 cells (1 X 106/200 μ 1)中以10 μ g/ml的量加入合成肽，并在37°C孵育2小時。細胞被FITC 染色標記抗HLA-A2. 1單克隆抗體(BB7. 2)。FACScan為熒光亮度參照。
圖4 :pc-HH重組子穩定轉染細胞中目的抗原的表達
其中圖A 是 RT-PCR 檢測 HLA-A*0201/H_2kb 在 HBc/multi印itope 細胞中的表達。 第1列是HLA-A*0201/H-2kb在pIRES表達質粒中轉染B16細胞后的擴增表達，第2列是 HLA-A*0201/H-2kb在pc_HH中轉染B16細胞后的擴增表達，第3列是HBc/multi印itope在 PIRES中轉染B16細胞后的擴增表達，第4列是HBc/multi印itope在pc_HH中轉染B16細 胞后的擴增表達；圖B是western blot檢測pc_HH轉染B16細胞后HBc/multi印itope蛋 白的表達。第1列是PlRES轉染B16細胞，第2列是pc-HH轉染B16細胞；圖C是FASC檢 測分析pc-HH轉染B16細胞后HBc/multi印itope蛋白的表達。
圖5 免疫小鼠脾細胞對B16-pC-HH黑色素瘤細胞的特異性CTL活性測定將6 只A2轉基因小鼠的脾臟淋巴細胞，使用電穿孔的方式加入對照質粒并分別加入AFP542， MAGE-I278,MAGE-3271三種多表位肽和OVA257體外刺激培養7天。被注入空質?；騊BS的免疫 小鼠，以及用OVA257刺激的脾細胞相對于三種多表位沒能誘導產生足夠明顯反應。用pc-HE接種疫苗和單獨使用三種多表位肽其中的一種，只能檢測到低水平的CTL反應。
圖6 =ELIspot檢測分泌IFN- γ的CD8+T細胞數
其中圖A是7天免疫后小鼠，分別經過HLA2. 1/Kb和HBc/ multiepitope(B16-pc-HH)或者野生B16黑色素瘤細胞刺激后，ELISPOT檢測；圖B是7天 免疫后小鼠脾細胞分別經AFP542，MAGE-I278，MAGE_3271，OVA257或空白對照體外刺激48小時 后，ELISPOT檢測。
圖7 免疫小鼠對B16-HLA-MAGE-3移植腫瘤的生長抑制作用
將空質粒和PBS注射到老鼠體內當做陰性對照。在每只七天持續免疫小鼠身體左 側接種IO6 B16-PC-HH細胞。腫瘤生長描述P<0.01，在分別接種14天，17天，20天后，相 比PBS對照組腫瘤生長差異開始有統計學意義。其中圖A中每個點代表六只小鼠接種不同 天數后腫瘤大小的平均數。圖B點代表每組小鼠接種25天后的單體腫瘤大小。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例對本發明作詳細描述，但本發明的實施例僅用于說明本發 明而不用于限制本發明的保護范圍。
本發明中所用的菌株和基因工程載體為大腸桿菌DH5 α、ToplO ；pcDNA3. lV5_His B載體(購自Invitrogen Life Science) ；pIRES載體(購自Clontech)。所用腫瘤細胞 株為表達HLA-A*0201分子的人TAP-缺陷型細胞株T2，起源于C57BL小鼠的B16 (H_2b)，兩 種細胞株均購自ATCC (Manassas，VA, USA)。CTL多表位DNA疫苗的編碼基因序列委托上海 捷倍思公司進行全基因合成?？乖嚯挠缮虾２ㄌ┥锛夹g有限公司采用標準的F-moc固 相法合成，多肽的純化采用逆相HPLC，多肽純度> 95%。所用轉基因小鼠為6 8周雄性 HLA-A*0201/kb 轉基因小鼠，購自 Jackson 實驗室(Bar Harbor, ME, USA)，表達人的 MHC I 類分子的α 和0 2功能區和小鼠!1-2妒的α 3功能區。由中國人民解放軍第二軍醫大學 實驗動物中心按清潔級動物培養法培養。
實施例1 :CTL多表位肽的設計和構建
所購建的CTL多表位肽共包括3個CTL表位、一個Th通用表位和5個連接子。3 個表位均為在HCC上高表達的MHC I類分子限制的CTL表位，分別是
MAGE-3(271_279)FLffGPRALV (SEQ ID NO 1),
AFP(542_550)GVALQTMKL (SEQ ID NO 2)
MAGE-I(278_286)KVLEYVIKV (SEQ ID NO :3)。
然后根據計算機輔助設計優化確定各表位、接頭序列以串珠狀聚合排列序列，原 則保障是各表位之間用合適的接頭序列間隔以維持各表位的空間構象不相互干擾。
最后確定的CTL多表位肽的氨基酸序列，5’到3’的順序是
GAA-FLffGPRALV-NAAA-KVLEYVIKV-KAA-PADRE-GAAA
GVALQTMKL-GAA
其中FLWGPRALV、KVLEYVIKV、GVALQTMKL 為三個不同的 CTL 表位；GA、KAA、GAAA, NAAA為Linker ；Th表位PADRE由13個氨基酸組成的通用T表位(AKFVAAWTLKAAA)。
根據以上步驟選擇的最佳排列順序，確定相應的偏愛密碼子組成的編碼基因序列 如下，委托上海捷倍思公司進行全基因合成。
GGCGCGGCGTTTCTGTGGGGCCCGCGCGCGCTGGTGAACGCGGCGGCGAAAGTGCT
GGAATATGTGATTAAAGTGAAAGCGGCGGCCAAGTTCGTGGCTGCCTGGACCCTGAA
GGCTGCCGCTGGCGCGGCGGCGGGCGTGGCGCTGCAGACCATGAAACTGGGCGCGG
CG (SEQ ID NO 4)
實施例2 候選肽的HLA_A*0201親和力分析
分別合成MAGE-3 (271_279) FLffGPRALV，AFP (542_550) GVALQTMKL 和 MAGE-1 (278_286) KVLEYVIKV 3個表位多肽，應用免疫熒光法檢測多肽與HLA-A*0201分子的結合情況。以熒光系數(FI) 作為親和力的檢測指標，發現多肽HCC的三個抗原表位肽與HLA-A*0201分子均具有較高親 和力，見圖3。
實施例3 =HBc (l-75aa)-多表位-HBc (75-144aa)嵌合基因序列的獲得
首先分別以全基因合成的本發明的表位多肽的DNA序列和HBV(adr亞型)基 因組DNA為模板，用下表給出的引物分別擴增多表位及HBc(l-75aa) (SEQ ID NO 6)和 HBc(75-144aa) (SEQ ID NO :7)的基因片斷，然后將這3個片斷經PCR的方法進行連接，形 成一個HBC (l-75aa)-多表位-HBc (75-144aa)嵌合基因。具體步驟如下
(1)用引物P5和引物P6擴增多表位序列的全部編碼基因。其中引物P5為5' -C GGGGCGCCTTTATGAACAAATTTATTTATG-3‘，該引物與多表位編碼序列的5'端一致，同時引入 Bbe I 限制性內切酶位點。引物 P6:5' -GCGGAGCTCCGCCGCGCCCACCAG-3 ’，引入 Sac I 限 制性內切酶位點。采用高保真Pfu DNA聚合酶進行PCR反應，其中dNTP濃度為20 μ Μ,Mg2+ 濃度為1. 5mM，變性、退火、延伸的溫度分別為94°C、55°C、72°C，時間分別為45秒、4秒和1 分鐘，共進行30個循環。
(2)用引物P7和P8擴增HBcAg(aal_75)的編碼序列片段。引物P7為 5' -GCTCTAGAATG GAC ATT GAC CCG TAT AAA GAAT-3‘，該引物引入 Xba I 限制性內切酶 位點。引物 P8 為5 ‘ CGGGGCGCCATTACTTCCCACCCAGGTGG-3 ‘，該引物引入 Bbe I 限制性內 切酶位點。PCR反應程序同(1)，共進行30個循環。
(3)用引物P9和PlO擴增HBcAg(aa76_144)的編碼序列片段。引物P9為5' -G CGGAGCTCGGTGCCGCGTTGGAAGACCCAGC-3‘，該引物引入Sac I限制性內切酶位點。引物PlO 為5' ACGCGTCGACTCAGGCACCCGGAAGTGTTGATAAG-3'，該引物引入 Sac II 限制性內切酶位 點。PCR反應程序同(1)，共進行30個循環。
(3)利用Me I, Xba I、Bbe I對上述PCR產物進行雙酶切，反應采用高鹽(H)緩 沖體系，37°C酶切3小時。然后經1.0%瓊脂糖電泳分離后，作凝膠回收。酶切片段和載體 按照5 1的摩爾比混合，加入相應的連接緩沖溶液和T4連接酶，16°C連接12小時，即可 得到HBc (l-75aa)-多表位-HBc (75_144aa)嵌合基因。Primer sequencesNamesequences(sence/antisence primer)MultiepitopeP5:5' CGGGGCGCC TTTATGAACAAATTTATTTATG-3' Bbe IP6: 5'-GCGGAGCTCCGCCGCGCCCACCAG-3' Sac I
HBcAg(aal-75) P7: 5’-GCTCTAGAATGGACATT GACCCG TAT AAA GAAT 3'Xba IP8: 5，-CGGGGCGCCATTACTTCCCACCCAGGTGG -3' Bbe I HBcAg(aa76-144) P9:5-GCGGAGCTCGGTGCCGCGTTGGAAGACCCAGC Sac IP10: 3'-ACGCGTCGACTCAGGCACCCGGAAGTGTTGATAAG Sal I
實施例4 表達質粒pc-HE的構建
利用引物P5和PlO對上述方法擴增得到的HBc (l-75aa)-多表位-HBc (75-144aa) 嵌合基因進行測序，測序反應由上?；倒就瓿伞＝洔y序正確后，用Hindlll、XbaI雙酶 切，與用Hindlll、XbaI雙酶切的載體pcDNA3. lV5_His B連接。酶切和連接反應的限制性 內切酶和T4連接酶均購自TaKaRa公司，反應采用酶說明書所推薦的體系進行。本發明所 利用的表達載體pcDNA3. lV5-His B全長5. 5Kb (千堿基對)，含有噬菌體T7啟動子、質粒復 制起點(ori)和氨芐抗性基因(Amp)。具體反應過程如下
利用HindIIlJbaI對上述PCR產物及載體進行雙酶切，反應采用高鹽(H)緩沖體 系，37°C酶切3小時。然后經1.0%瓊脂糖電泳分離后，作凝膠回收。酶切片段和載體按照 5 1的摩爾比混合，加入相應的連接緩沖溶液和T4連接酶，16°C連接12小時。
實施例5 :HLA-A*0201/Kb嵌合基因的制備
取200g HLA-A2轉基因小鼠的脾臟組織樣本，抽取總RNA，逆轉錄合成cDNA。再以 cDNA 為模板，用 PCR 方法分別擴增 HLA-A*0201 (SEQ ID NO 8)與 H_2kb 基因(SEQ ID NO 9)。然后采用重疊區延伸法連接，得到融合基因HLA-A*0201/Kb。具體步驟如下
(1)用引物Pl和引物P2擴增HLA_A*0201基因的全部編碼基因。其中引物Pl為 5' -CCGCTCGAG ATGGCCGTCATGGCGCCCCG-3 ‘，該引物與 HLA_A*0201 編碼序列的 5 ‘端一 致，同時引入XhoI限制性內切酶位點。引物B 5' -TCATGCACCATGCACTCTTGTCCTCCGCTACTGC CACCTGCAGGGCCGATGAGTTTCAAGCA-3 ‘。采用高保真 pfu DNA 聚合酶進行 PCR 反應，其中 dNTP 濃度為20 μ M，Mg2+濃度為1. 5mM,變性、退火、延伸的溫度分別為94°C、55°C、72°C，時間分別 為45秒、4秒和1分鐘，共進行30個循環。
(2)用弓丨物P3和P4擴增H_2kb的編碼序列片段。引物P3為 5 ‘ -GGCGCCATTCCCCAAAGGCCCATG-3 ‘。引物 P4 為5 ‘ -CGACGCGTCTGTCTTCACGCTAGAGAATG -3'，該引物引入Mlu I限制性內切酶位點。PCR反應程序同(1)，共進行30個循環。
(3)利用重疊區延伸法獲得編碼HLA_A*0201和H_2kb的融合基因。上述兩步PCR反 應得到的產物分別利用1.0%瓊脂糖電泳分離，然后作凝膠回收?；厥蘸蟮漠a物94°C變性5 分鐘，將兩次PCR的產物混合后于50°C退火。因為引物B和C具有重疊的部分，因而退火后 可以使HLA-A*0201基因的單鏈和H-2kb的單鏈配對。添加DNA聚合酶、MgCl2、10XPCR緩沖 液、dNTP后，進行PCR擴增。利用這種方法，使兩個基因連接成一個融合基因HLA-A*0201/ Kb。為保證高保真的擴增，整個PCR程序均采用TaKaRa公司的pfu DNA聚合酶，50 μ 1反應 體系，變性、退火、延伸的溫度分別為94°C、50°C、72°C，時間分別為45秒、45秒和1分鐘，共 進行20個循環(具體方法參見《靶向新基因的分子克隆策略一理論與方法》，軍事醫學科學出版社，1999出版)。
實施例6 表達質粒pc-HH的構建
利用引物P3和P4對上述方法擴增得到的HLA_A*0201/Kb融合基因進行測序，測 序反應由上?；倒就瓿?。經測序正確后，用)(hoI、Mlu I雙酶切，與用)(hoI、Mlu I雙酶 切的載體PlRES連接。酶切和連接反應的限制性內切酶和T4連接酶均購自TaKaRa公司， 反應采用酶說明書所推薦的體系進行。本發明所利用的表達載體PlRES全長6. 1Kb (千堿 基對)，含有菌體T7啟動子、質粒復制起點(ori)和氨芐抗性基因(Amp)。具體反應過程如 下
利用B10I、Mlu I對上述PCR產物及載體進行雙酶切，反應采用高鹽(H)緩沖體 系，37°C酶切3小時。然后經1.0%瓊脂糖電泳分離后，作凝膠回收。酶切片段和載體按照 5 1的摩爾比混合，加入相應的連接緩沖溶液和T4連接酶，16°C連接12小時。
實施例7:工程菌的制備
將上述連接后的產物轉化大腸桿菌菌株BL21-CP-RIL，得到工程菌BL21 (pc-HH)。 具體步驟為先將宿主菌BL21-CP-RIL于50ml LB培養基(含1 %的胰蛋白腺，0. 5 %酵母 提取物和氯化鈉，ρΗ7· 0)中，37 °C振蕩培養至OD600為0. 4時，在4 °C下，以4000rpm的 轉速離心，收集宿主菌；去除上清液后，用l_2ml冰預冷的lOOmmol/L的氯化鈣溶液重懸， 即得感受態細菌。將IOOng上述構建的質粒與感受態細菌于冰浴中冷卻30分鐘，42°C熱休 克90秒，然后再于冰浴中冷卻10分鐘。加入0. 8ml的LB，于37°C培養1小時后，取0. 2ml 轉化產物涂布于含有相應抗生素的LB瓊脂平板上，37°C培養12-15小時后，即獲得單克隆 的含有重組質粒的宿主菌。抽提宿主菌質粒，用Ndel、XhoI雙酶切能夠切出一條2. 3Kb的 條帶，該宿主菌即為陽性重組子。含有質粒pc-HH的大腸桿菌菌株BL21-CP-RIL為工程菌 BL2I-CP-RIL(pc-HH)
實施例8 真核表達載體pc-HH穩定轉染黑色素瘤B16細胞及目的抗原的表達
將B16黑色素瘤細胞培養在含10% NCS的DMEM培養基的6孔板中，當細胞密度達 90%，換成無抗生素、無血清的DMEM，繼續培養2 4h。然后，用脂質體lipof ectamin2000 的方法(INVIT0RGEN公司)將共表達質粒pc_HH轉染到B16黑色素瘤細胞中。轉染后Mi 換成完全培養基，24h后用終濃度1000mg/ml的G418篩選，并每隔4 換液一次，一般7 IOd出現陽性克隆。當陽性克隆長到1/4視野，在顯微鏡下將陽性細胞轉移到96孔板，繼續 在含G418的培養液中培養，當細胞數增加到一定程度后，將細胞轉移到6孔板。待細胞長 滿孔后，收集細胞抽提總RNA和總蛋白，用RT-PCR和Wfestern blot分析HLA-A*0201/H_2kb 嵌合基因及HBc/多表位基因片段的表達。同時，MTT法比較未轉染、轉染空載體及轉染共 表達載體pc-HH的B16細胞的增殖能力。
分別用RT-PCR、western blot、細胞流式檢測重組表達載體穩定轉染細胞中目的 抗原的表達情況，結果見圖4。pc-HH重組子穩定轉染的細胞株可見目的蛋白的表達，而對 照空表達載體穩定轉染的細胞株未見目的蛋白的表達，說明檢測到的信號是特異的。
實施例9 小鼠分組及免疫方法
將雄性HLA-A2轉基因小鼠分為3組。在第0和第21d分別采用電穿孔法(BTX ECM830)給第1組小鼠肌肉注射pcDNA3. l_V5/His B空質粒(100 μ g/100 μ 1/鼠)；給第2 和第3組小鼠注射相同的但表達HBc-多表位的重組表達質粒。電穿孔的參數如下=Voltage100L(Mode :Low voltage) ；Pulse Length 50ms ；Pulses 5 ；Interval lpulse/s.在第 2 次 免疫后的14d，給第2組的小鼠皮下注射4種CTL抗原表位肽的混合物(50yg/mOUSe)；給 第3組小鼠皮下注射4種CTL抗原表位肽的混合物(50 μ g/mouse)及HBV核心抗原肽(HBV Core 128-140 ρ印tide (TPPAYRPPNAPIL，140 μ g/mouse))。肽的總體積為 50 μ 1，注射時加 入等量體積的福氏完全佐劑(IFA)，注射部位為背部頸部皮下，注射空質粒組用PBS攻擊。
實施例10 免疫小鼠脾細胞對B16-pC-HH黑色素瘤細胞的特異性CTL活性測定
取免疫小鼠脾臟淋巴細胞O XlO6Ail)，分別加入三種抗原表位肽，同時加入終濃 度為lOng/ml的IL-2，培養7天后，收集效應細胞，進行特異性殺傷活性分析。
靶細胞選為負載表位多肽的T2、SW480細胞及未加負載的T2和SW480細胞，以及 穩定轉染、表達目的抗原的pc-HH和野生型B16細胞。
效應細胞對靶細胞的殺傷活性的檢測采用4小時LDH釋放實驗。分別用負載的T2、 SW480細胞及未加負載的T2、SW480細胞或表達目的抗原的黑色素瘤細胞pc_HH作、野生型 B16為靶細胞。將刺激后的脾臟T淋巴細胞和靶細胞按不同的比例(100 1,50 1、25 1 及12.5 1)加入到96孔培養板中，效靶細胞各100μ1，均設3復孔，同時設靶細胞最大釋 放量(100 μ 1靶細胞+100 μ 12% TritonX-100)、自發釋放量(100 μ 1靶細胞+100 μ 1無酚 紅培養基)、自然背底Ο00 μ 1無酚紅培養基)、效應細胞(100 μ 1效應細胞+100 μ 1無酚紅 培養基)釋放量。250g離心5min，于37°C含飽和水氣、5%的C02的培養箱中培養4h，250g 離心5min，吸取100 μ 1上清至另一 96孔板中，加入檢測LDH含量的反應液，18°C 25°C避 光反應30min，測492nm波長的吸光值，按下面的公式計算CTL對靶細胞的殺傷活性
實驗組釋放量一自發釋放量 -χ 100%最大釋放量一自發釋放量
實驗結果可見，免疫小鼠脾細胞在體外用腫瘤抗原或抗原肽刺激后，可有效殺傷 B16-pc-HH黑色素瘤細胞，在效靶比例為100 1時，殺傷率高達47% ；而對B16_pIRES腫 瘤細胞的殺傷率只有8 %，二者有顯著性差異，見圖5。
實施例10 =ELIspot檢測分泌IFN- γ的CD8+T細胞數
為了進一步明確B16-pC-HH黑色素瘤細胞株可以遞呈3種抗原表位，并能被抗原 特異性CD+T細胞識別，用ELISpot的方法檢測用該細胞與免疫小鼠脾臟淋巴細胞共孵育 后，⑶8+Τ細胞被活化的情況。
向ELISpot板的每孔中加入50 μ 1抗小鼠IFN- γ的單克隆抗體和50 μ 1 PBS,封 好板于4°C包被過夜，傾掉包被液，用PBST洗10次；向孔中加入封阻液(包含1 % BSA的 PBS)200y 1，4°C封閉過夜。傾倒液體(不洗孔)。向孔中加入IXlO5效應細胞與IXlO5 刺激細胞，蓋上板蓋，于37°C 5% C02的細胞培養箱中孵育16h ；用力傾倒孔中的液體，加入 200 μ 1冰冷的去離子水，冰上放置lOmin，用PBST洗板10次；加入100 μ 1生物素化的檢測 抗體，37°C放置Ih或4°C過夜；然后傾倒板中的液體，PBST洗10次；加入50μ1φ標記的抗 生物素的抗體(GABA)，37°C孵育lh，X 100%去除孔中的液體，用PBST洗10次，把孔中的液 體在草紙上拍干；最后向孔中加入30 μ 1 activator溶液，室溫放在暗處孵育15 30min， 在光鏡下觀察點的形成情況，一旦點形成后，及時用無菌去離子水終止反應。
在用3種抗原肽再次刺激免疫小鼠脾臟淋巴細胞后，可檢測到分泌IFN-Y的 CD8+T細胞，表明在免疫小鼠脾臟中存在抗原特異性的CD8+T細胞。進一步用表達目的抗原 的B16-pC-HH黑色素瘤細胞刺激免疫小鼠脾臟淋巴細胞，也觀察到分泌IFN- γ的⑶8+Τ細 胞，而且與抗原肽刺激的程度相當。見圖6。
實施例11 免疫小鼠對B16-HLA-MAGE-3移植腫瘤的生長抑制作用
將體外培養至對數生長期的B16-pC-HH和B16_pIRES分別移植到免疫過的HLA轉 基因小鼠(106/只)。腫瘤移植后的第5d，陰性對照組可觸及到腫瘤塊生長。從荷瘤的第 5d，每天用游標卡尺測量瘤塊大小，按公式(長徑X短徑2)/2計算腫瘤塊的體積(mm3)，得 到腫瘤生長曲線圖(圖7A)。從圖可見，B16-pC-HH移植小鼠，從荷瘤第10d，除實驗組有 一只小鼠腫瘤停止生長外，實驗組小鼠腫瘤生長明顯緩慢，與陰性對照組比有顯著性差異 (均為P <0.01)；在小鼠荷瘤的第25d，將小鼠全部處死，測量腫瘤大小(圖7B)，可知實驗 組的6只小鼠腫瘤塊均小于對照組。
統計方法均采用Student，s t test。
權利要求
1.一種抗黑色素瘤的CTL多表位肽，其特征在于所述的多表位肽具有SEQ ID N0:5所 示的氨基酸序列
2.一種編碼權利要求1所述的CTL多表位肽的核苷酸序列。
3.根據權利要求2所述的編碼CTL多表位肽的核苷酸序列，其特征在于該核苷酸序列 如 SEQ ID NO 4 所示。
4.含有權利要求3所述核苷酸序列的質粒。
5.根據權利要求4所述的質粒，其特征在于該質粒是pc-HH。
6.含有權利要求5所述質粒的細胞。
7.根據權利要求6所述的細胞，該細胞是大腸桿菌BL21-CP-RIL。
8.權利要求1所述的抗黑色素瘤的CTL多表位在制備預防和治療黑色素瘤藥物中的應用。
9.根據權利要求8所述的抗黑色素瘤的CTL多表位在制備預防和治療黑色素瘤藥物中 的應用，其特征在于該藥物是一種嵌合表位疫苗，它的活性成份是編碼HBc (l-75aa)-權利 要求1所述的CTL多表位肽-HBc (75-144aa)基因和HLA_A*0201與H_2kb基因。
10.根據權利要求9所述的抗黑色素瘤的CTL多表位在制備預防和治療黑色素瘤藥物 中的應用，其特征在于該嵌合表位疫苗的活性成份的制備包括如下步驟A、將編碼HBcAg(aal-75) ,HBcAg (aa76-144)和多表位的基因序列經PCR的方法進行連 接，形成一個HBC(l-75aa)-權利要求1所述的CTL多表位肽-HBc (75_144aa)嵌合基因；B、取200gHLA-A2轉基因小鼠的脾臟組織樣本，抽取總RNA，逆轉錄合成cDNA，再以 cDNA為模板，用PCR方法分別擴增HLA-A*0201與H_2kb基因，然后采用重疊區延伸法連接， 得到融合基因HLA-A*0201/Kb ；C、表達質粒pc-HH，所述表達質粒為長度9.3Kb的環形雙鏈，克隆有編碼 HBC(l-75aa)-權利要求1所述的CTL多表位肽-HBc (75_144aa)嵌合基因和融合基因 HLA-A*0201/Kb的基因序列，并含有T7啟動子；D、表達質粒pc-HH的構建方法，系將HBc(l-75aa)-權利要求1所述的CTL多表位 肽-HBc (75-144aa)嵌合基因和HLA_A*0201/Kb融合基因用Mlu I和Bio I雙酶切，然后然 后與用Mlu I和Xho I雙酶切的pIRES相連；E、工程菌BL21 (pc-HH)，為大腸桿菌 BL21-CP-RIL。
全文摘要
本發明涉及醫藥生物學技術領域。本發明提供一種抗黑色素瘤的CTL多表位DNA疫苗，其編碼基因包括3個CTL表位一個Th通用表位和5個連接子，所表達的氨基酸序列如SEQ ID NO5所示。這種多表位編碼基因與HBc(1-75aa)和HBc(75-144aa)相經PCR方法進行連接，組成嵌合基因，再與HLA-A*0201/Kb融合基因分別克隆到真核表達載體pIRES的多克隆位點A和B，構建成共表達載體，所述融合基因的誘導性表達質粒pc-HH，長度為9.3kb的環形雙鏈。本發明所提供的抗黑色素瘤CTL多表位疫苗具有腫瘤細胞特異性、能在體內穩定表達、制備簡單，制備成本低廉等特點。
文檔編號C12N15/63GK102030829SQ20101053413
公開日2011年4月27日 申請日期2010年11月5日 優先權日2010年11月5日
發明者劉音, 單石, 孫樹漢, 王越, 章意亮, 郭瀛軍 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學