專利名稱：豬白細胞介素10重組乳酸菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，確切地說豬白細胞介素10重組乳酸菌及其應用。
背景技術：
畜牧業是現代農業產業體系的重要組成部分，是我國農業和農村經濟結構戰略 性調整中的優勢產業，也是轉變農村經濟增長方式的主要途徑和新農村建設的重要內容 之一。我國是生豬生產大國，豬肉消費大國，豬肉是我國人民主要的肉食品來源，占日 常肉類消費的60%以上。盡管集約化、高密度養殖模式解決了人口密度的增加對豬肉產 品的消費問題，但由于高度集約化養殖條件下，豬免疫力和抗應激能力下降，排放病原 微生物和接觸病原微生物機會增加，導致患病率和死亡率增加，生長速度緩慢，養殖收 入下降以及豬肉產品供應不足等。因此，提高豬的自身免疫水平、增加對病原微生物的 抵御能力對于促進我國養豬業持續健康發展、促進農村經濟增長水平和保障優質豬肉產 品供應具有重要的現實意義。白細胞介素IO(IL-IO)首次發現于小鼠Th2細胞克隆體外培養條件下所產生，是 能夠抑制Thl細胞株的細胞因子mRNA轉錄，成為“細胞因子合成抑制因子”，后命名 為IL-10。研究發現，IL-10是一種多細胞源，多功能的細胞因子，在T細胞、B細胞、 樹突狀細胞、單核/巨噬細胞、角質化細胞、肥大細胞等細胞中均有分泌，可以調節細 胞的生長于分化，參與炎性反應和免疫調節，是目前公認的炎癥與免疫調節因子。IL-10可以上調主要組織相容性復合體II類抗原的表達，刺激抗原特異性B細胞 增殖，并分化為漿細胞，進而分泌多種特異性抗體，如IgG、IgM和IgA等，增強機體的 體液免疫水平。促進非單核細胞依賴性T細胞的增殖、成熟，在IL-3、IL-4存在的條件 下，刺激肥大細胞及其祖細胞的增殖，增強肥大細胞的活力。IL-10可通過抑制嗜酸粒細 胞表達CD40而發揮抗過敏效應，并加速嗜酸粒細胞的凋亡，IL-10還可以阻止T細胞受 體介導的CD4+T細胞的活化。以IL-10處理的T細胞會導致持久的抗原特異性T細胞無 效應。IL-10可以抑制前列腺素E2的產生和抗原呈遞，也可以下調脂多糖信號轉導受體 TLR-4的表達，增強CD14、CD16、CD64和被細菌脂多糖、IFN-Y和TNF下調的清道 夫受體CD163的表達。IL-10還可以抑制巨噬細胞產生氧自由基、氮氧化物、金屬蛋白 酶，增加金屬蛋白酶的組織抑制劑的產生。內源性和外源性IL-10均能在轉錄水平強烈 抑制IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、粒細胞集落刺激因子和粒-巨噬細胞集落刺激因子等 的合成，從而起到抗炎的作用。綜上所述，IL-10不但能夠刺激機體產生針對病原微生物 的特異性抗體，提高體液免疫水平；而且涉及炎癥的各個環節，其抗炎作用極其廣泛。
目前，IL-10在人類醫學應用的研究較為廣泛和深入，已涉及到腫瘤、結腸炎、 類風濕性關節炎、銀屑病、丙型肝炎、過敏性哮喘和器官移植等疾病。IL-10在動物疾病 方面的應用國內外也開展的一些研究。研究發現，豬IL-10基因序列與人、大鼠、和小 鼠的IL-10基因序列進行比較，發現同源性分別為84%、79%和79%，豬與人IL-10基 因序列的同源性很高，這與兩種動物的IL-10具有交叉反應相一致。
在牛分枝桿菌感染小鼠模型中，IL-10伴隨TNF和IL-12而產生，IL_12缺陷小 鼠細胞免疫增強，從而引起強烈的肉芽腫反應，使得細菌清除加快。IL-10不僅直接抑 制巨噬細胞表達TNF-α，同時還上調其它抗炎細胞因子(如IL-IRa和STNF_R1)的表 達，因而IL-10具有抗炎作用，可抑制炎性反應的發生。在促炎細胞因子過量產生的疾 病中，IL-10起重要調節作用。胸膜肺炎放線桿菌引起嚴重的急性胸膜肺炎，伴隨炎性 細胞因子(如IL-1、IL-6、IL-8等)的表達增加，Morrison等(2000年)用重組腺病毒 表達的豬IL-10 (PIL-10)治療細菌性胸膜肺炎取得較好療效，炎性細胞因子水平降低， 感染豬肺部損傷大大減輕。因此，IL-10用于治療免疫功能紊亂的免疫調解劑以及某些 炎性疾病的抗炎防治劑，將具有很大的應用價值。乳酸菌是人類和動物消化道內重要的益生菌，在國際上被認為是“公認安全 (Generally Regarded As Safe, GRAS) ”等級的微生物，可對宿主發揮營養、生物屏障、
免疫激活和改善人體代謝等多種生理作用。乳酸菌可通過激活樹突狀細胞、激活巨噬細 胞、提高細胞因子水平、增加自然殺傷細胞活性和提高免疫球蛋白水平，最終誘導機體 增強免疫反應的強度。

發明內容
本發明的目的是為了解決高密度、集約化養殖條件下，豬免疫力和抗應激能力 下降的問題，以及提高豬對病原微生物產生特異性抗體的能力，而提供能夠通過口服 的、非注射的、具有免疫調節功能的，可穩定表達豬白細胞介素10的重組乳酸菌。豬白細胞介素10重組乳酸菌，它是轉化了重組質粒pW425et-poIL-10的乳酸 菌，其中poIL-10為豬白細胞介素10基因的簡稱，所述的乳酸菌為植物乳酸桿菌、保加 利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、羅伊氏乳桿菌或發酵乳桿菌；所述的乳酸菌優選植物乳酸桿菌；所述的poIL-10，是以豬脾細胞RNA為模板，擴增出的基因序列；所述的poIL-10，其堿基序列如序列表SEQ ID No.l所示。一種重組質粒，pW425et-poIL_10。本發明另一個目的是提供豬白細胞介素10重組乳酸菌的制備方法，它包括1)以豬脾細胞RNA為模板，PCR方法擴增獲得poIL-10基因序列，其上下游分 別含有Kpn I和HindIII酶切位點；2)將poIL-10基因插入大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達載體pW425et中，構建大腸 桿菌_乳酸菌穿梭表達重組質粒pW425et-poIL-10 ；3)將重組質粒pW425et-poIL-10轉化至乳酸菌中。本發明又一個目的是提供一種豬免疫增強劑，它是將豬白細胞介素10重組乳酸 菌，接種于液體MRS培養基中，37°C，靜止厭氧培養至每毫升菌液中含有2X IO11個活 菌。本發明又一個目的是提供一種增強豬免 疫力的飼養方法，它包括仔豬從7日 齡起每日口服用一次所述的4ml/次一種豬免疫增強劑，連續服用7-14天。本發明根據GenBank登錄的poIL-10的基因序列，設計并合成一對引物，上下游 分別含有Kpn I和HindIII酶切位點，提取豬脾細胞中RNA并以之為模板，采用PCR技術獲得poIL-10基因，與克隆載體pMD18T載體連接后轉化至大腸桿菌中進行鑒定。將經鑒定為正確的poIL-ΙΟ基因插入到大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達質粒pW425et中，構建重組 質粒pW425et-pOIL-10，并將其電轉化至乳酸菌中，獲得了可穩定表達豬白細胞介素10 的重組乳酸菌。動物試驗表明，該重組乳酸菌可有效刺激B細胞增殖，提高血清中IgG、 IgM和IgA的水平，從而起到調節豬免疫功能的作用，進而增強豬對病原微生物的抵御能 力。本發明利用乳酸菌作為人類消化道共生菌的優勢，制備了表達豬白細胞介素10 的重組乳酸菌。該重組乳酸菌經過口服可定植于腸道內，并穩定地表達豬白細胞介素 10，有效調節機體的免疫功能，刺激B細胞增殖，提高機體對病原微生物產生特異性抗 體的能力，增強機體對病原的抗病力，保障豬的健康生長(生產)，促進畜牧業持續健康 發展。通過發酵的形式，即可大規模獲得穩定表達豬白細胞介素10的重組乳酸菌，避 免了原有重組白細胞介素10復雜的提純過程；且通過口服該重組乳酸菌即可發揮白細胞 介素10的免疫調節作用，規避注射使用過程中人力、物力消耗的以及交叉感染的風險。 生產工藝相對簡單，使用方便，利于規模化生產。


圖1.豬脾細胞RNA提取結果。其中，M D2000marker ； 1 脾細胞RNA提
取結果。圖2.poIL-10PCR擴增結果。其中，M: D2000marker ； 1: poIL-lOPCR 結果。圖3.pMD18T-poIL-10 質粒提取結果。其中，Μ: λ DNA/Hind III digested marker ； 1: pMD18T-poIL_10 質粒提取結果。圖 4.pMD18T-poIL_10 酶切結果。 其中，M: D2000marker ； 1: .pMD18T-poIL_10 酶切結果。圖5.poIL-10基因的同源性分析結果。圖 6.pW425et 質粒提取結果。其中，Μ: λ DNA/Hind III digested marker ； 1: pW425et質粒提取結果。圖7.大腸桿菌DH5a中pW425et-poIL_10質粒提取結果。其中，M: ADNA/ Hind III digestedmarker ； 1 大腸桿菌中 pW425et-poIL_10 質粒提取結果。圖 8.大腸桿菌 DH5 α 中 pW425et-poIL_10 酶切結果。其中 M1 λ DNA/Hind III digestedmarker ； M2 D2000marker ； 1-6 大腸桿菌 DH5 α 中 pW425et-poIL_10 酶切結果。圖9.乳酸桿菌中pW425et-poIL_10質粒提取結果。其中，Μ: λ DNA/Hind III digestedmarker ； 1 乳酸桿菌中 pW425et-poIL-10 質粒提取結果。其中，M1: ADNA/ Hind III digestedmarker ； M2: D2000Markerl, 2 乳酸桿菌中 pW425et-poIL_10 質粒酶切結果。圖10.乳酸桿菌中pW425et-poIL_10質粒酶切結果。其中，M1: λ DNA/Hind III digestedmarker ； M2: D2000Marker ； 1, 2 乳酸桿菌中 pW425et-poIL_10 質粒酶切結果。
圖ll.poIL-10在乳酸菌中表達結果。其中，M:蛋白質Marker ； A，1: poIL-10在乳酸菌中表達的SDS-PAGE結果；2 空載體陰性對照SDS-PAGE結果；B，
1 poIL-10在乳酸菌中表達的Western-blot結果；2 空載體陰性對照Western-blot結果圖12.豬白細胞介素10重組乳酸菌對豬血清中IgG水平的影響。圖13.豬白細胞介素10重組乳酸菌對豬血清中IgM水平的影響。圖14.豬白細胞介素10重組乳酸菌對豬血清中IgA水平的影響。圖15.豬白細胞介素10重組乳酸菌對豬脾細胞中CD19+B細胞增殖的影響。圖16.豬白細胞介素10重組乳酸菌對豬IFN- Y、INF表達水平的影響。
具體實施例方式實施例1豬白細胞介素10(pOIL-10)基因的獲得取豬脾臟，制成脾細胞懸液，采用Trizol提取脾細胞的RNA，取Iyl進行0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖1所示。DpoIL-IO基因的擴增根據GenBank登錄的poIL-10基因序列設計引物，上 游弓I 物5 ‘ TTTGGTACCATGCCCAGCTCAG, 下游弓I 物 CCCAAGCTTTCAGTTCTTCCTCATC,分別含有Kpn I和HindIII酶切位點，送往上海生 工合成。以脾細胞RNA為模板，采用RT-PCR技術擴增poIL-10基因。反應體系上游引物(P1，10μ mol/L) 1.0 μ L下游引物(Ρ2，10μ mol/L) 1.0 μ LdNTP (2.5mmol/L)4.0 μ LIOxBuffer5.0 μ L轉錄酶-TapDNA聚合酶 1.0 μ L模板RNA1.0 μ LddH2037.0 μ L_Total V50.0 μ L反應條件45°C反轉錄30min，70°C滅活IOmin ； 94°C預變性5min ； 94°C變性 Imin, 57°C退火30s，72°C延伸lmin，共30個循環；72°C總延伸lOmin。反應結束后取 1 μ 1進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示成功擴增出poIL-10基因，如圖2所示。2)poIL-10基因與pMD18T的連接、轉化采用Axygen公司DNA凝膠回收試劑盒，按照說明書操作，對擴增目的基因進行回收，回收片段與克隆載體pMD18T進行連接。連接體系Solution I 5.0 μ L回收目的基因 3.5 μ LpMD18T0.5 μ LT4DNA 連接酶 1.0 μ L
_Total V 10.0 μ L連接條件16°C連接過夜，次日轉化大腸桿菌DH5 α (E.coli DH5 α )感受態細
胞。 取連接產物10 μ L，加入100 μ L E.coli DH5 α感受態中，混勻后冰浴30min ； 42°C熱激90s，立即冰浴5min;加800 μ L新鮮液體LB培養基，37°C，160r/min搖床培 養2-3h;分別取50 μ L、100 μ L、150 μ L、200 μ L菌液涂布于準備好的含有氨芐青霉素 (100 μ g/mL)LB瓊脂平板上，37°C培養8_16h，篩選重組陽性克隆子。3)pMD8T-poIL-10的鑒定及序列分析按試劑盒說明書操作提取篩選疑似陽性克隆子質粒，并取1 μ L進行0.8%瓊脂糖 凝膠電泳，如圖3所示。采用Kpn I和HindIII限制性內切酶對所提取的質粒載體進行酶 切鑒定，酶切體系如下IOXLBuffer 1.0 μ L重組質粒 7.0 μ LHindIII 1.0 μ LKpnI 1.0 μ L_Total V 10.0 μ L反應條件37°C水浴2h。結束后，取5μ L進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結 果顯示成功獲得了重組表達載體pMD8T-poIL-10，如圖4所示。將經過雙酶切鑒定后的重組質粒送往上海生工進行測序，測序結果經Blast比對 分析表明，所擴增的poIL-10基因與GenBank登錄的序列同源性達100%，如圖5所示。實施例2重組表達載體pW25et-poIL_10的構建1)質粒pW425et的制備制備含有pW425et的大腸桿菌菌液，按照質粒DNA提取試劑盒說明書操作，提 取質粒，取2μ L進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果顯示成功獲得了質粒pW425et， 如圖6所示。2)目的基因的回收、連接和轉化目的基因的回收采用Kpn I和HindIII限制性內切酶分別對pMD8T_poIL-10和pW425et進行雙酶 切，以獲得poIL-10基因和pW425et大片段；雙酶切體系如下IOXLBuffer 2.0 μ L重組質粒(或載體)16.0 μ LHindIII 1.0 μ LKpnI1.0 μ L_Total V 20.0 μ L反應條件37°C水浴3h。結束后，按DNA凝膠回收試劑盒說明書操作，對目 的基因片段進行回收。
poIL-10基因和載體大片段的連接對回收的目的基因片段進行連接，連接體系如下10 X Ligation Buffer 1.0 μ LpoIL-10基因回收產物 7.0 μ LpW425et 回收產物 1.0 μ LT4DNA 連接酶 1.0 μ L_Total V10.0 μ L反應條件21°C連接5h，4°C過夜；次日轉化E.coliDH5a感受態。重組表達載體轉化E.coli DH5 α感受態取IOyL上述連接混合物加入100yLE.coliDH5a感受態中，混勻后冰浴 30min ； 42°C熱激90s,立即冰浴5min ；加800 μ L新鮮液體LB培養基，37°C，160r/min 搖床培養2-3h;分別取50 μ L、100 μ L、150 μ L、200 μ L菌液涂布于準備好的含有紅霉 素(200 μ g/mL)LB瓊脂平板上，37°C培養8_16h，篩選重組陽性克隆子。重組表達載體pW25et-poIL-10的酶切鑒定按試劑盒說明書操作提取篩選疑似陽性克隆子質粒，并取1 μ L進行0.8%瓊脂糖 凝膠電泳，如圖7所示。采用Kpn I和HindIII限制性內切酶對所提取的質粒載體進行酶 切鑒定，酶切體系如下IOXLBuffer 1.0 μ L重組質粒(或載體)7.0 μ LHindIII1.0 μ LKpnI1.0 μ L_Total V 10.0 μ L反應條件37°C水浴2h。結束后，取2μ L進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結 果顯示成功構建了重組表達載體pW25et-pOIL-10，如圖8所示。實施例3表達豬白細胞介素10重組乳酸菌的制備1)乳酸桿菌感受態細胞制備及轉化將_70°C超低溫凍存的植物乳酸桿菌、保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿 菌、干酪乳桿菌、羅伊氏乳桿菌或發酵乳桿菌，37°C孵育至解凍，涂布于MRS平板(含 胸苷酸100 μ g/mL)，37°C厭氧靜止培養過夜。次日，挑取菌落接種于新鮮的IOmL MRS 液體培養基中(含甘氨酸)，37°C厭氧靜止培養至菌體OD6tltl值為0.6-0.8。取菌體培 養液，按劑量接種于新鮮MRS液體培養基中(含甘氨酸)，37°C厭氧靜止培 養，待菌體OD_值為0.2-0.3時，收集備用；將以上收集的菌體培養物冰浴lOmin，4°C, 6000r/min,離心5min。沉淀用冰 冷的清洗緩沖液清洗兩次；4°C，6000r/min,離心5min收集沉淀，最后重懸于電擊緩沖 液中，冰浴5min;取上述處理的乳酸桿菌感受態200 μ L，加入20 μ L重組表達載體 pW25et-poIL-10,輕輕混合后轉置冰冷的電極杯中(Φ20ιηιη)，冰浴5min后進行高壓電轉化，條件為電壓2.5kv，時間3.0ms;高壓電擊后，將電極杯冰浴5min，將杯中內容物轉置800 μ L新鮮的液體MRS 培養基中，37°C厭氧靜止復蘇4-5h，涂布含有紅霉素(400 μ g/mL)的MRS平板，37°C厭 氧靜止培養16_20h，篩選陽性克隆子。2)乳酸菌中重組表達載體pW25et-poIL-10的鑒定試劑盒提取疑似陽性重組乳 酸桿菌的質粒DNA，并取1 μ L進行0.8%瓊脂糖凝 膠電泳，如圖9所示；采用Kpn I和HindIII限制性內切酶對所提取的質粒載體進行酶切 鑒定，酶切體系如下IOXLBuffer 1.0 μ L重組質粒 7.0 μ LHindIII 1.0 μ LKpnI 1.0 μ L_Total V 10.0 μ L反應條件37°C水浴2h。結束后，取2μ L進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如 圖10所示，證實成功了制備了重組乳酸菌LAB/pW25et-pOIL-10。實施例4重組乳酸菌Lb.planturm/pW25et-poIL-10表達產物的檢測挑取MRS平板上(含紅霉素400 μ g/mL)重組乳酸菌LAB/pW25et-poIL_10單 個菌落，接種至5ml液體MRS培養基中(含紅霉素400 μ g/mL)，37°C，靜止厭氧培養 過夜；次日取培養的菌液按1 100的比例接種至IOOml液體MRS培養基中(含紅霉素 400 μ g/mL), 37°C，靜止厭氧培養至菌液OD_值為0.6時，開始收集菌液，每小時收集 一次，每次2ml;空載體重組乳酸菌Lb.planturm/pW25et也做同樣處理。連續收集6小時 后，將菌液12000r/min，離心Imin，棄上清，向沉淀中加入二硫蘇糖醇5 μ 1，2Χ上樣緩 沖液45 μ 1，蒸餾水50 μ 1，混勻后至沸水中lOmin。進行SDS-PAGE電泳和Western-blot 檢測，如圖11所示。結果證實了 poIL-10在乳酸菌中獲得了表達，成功制備可穩定表達 豬白細胞介素10的重組乳酸菌Lb.planturm/pW25et-poIL-10。實施例5表達豬白細胞介素10重組乳酸菌免疫調節功能的檢測將重組乳酸桿菌Lb.planturm/pW25et-poIL-10接種于液體MRS培養基中， 37°C，靜止厭氧培養至每毫升菌液中含有2 X IO11個活菌。15只7日齡健康仔豬，隨機分成3組，每組5只，分別為PBS組(4ml/次)， Lb.planturm 組(有效菌落數 8 X IO11/ 次)和重組乳酸菌 Lb.planturm/pW25et-poIL-10 組
(有效菌落數8XlO11/次)，各組每日灌服一次至21日齡斷乳，每次均為4ml。仔豬22 日齡記為試驗0天，分別于第0天、7天和14天取血，采用ELISA法測定外周血中IgG、 IgM和IgA含量，結果如圖12，13，14所示。并于第14天宰殺仔豬，流式細胞術測定 脾細胞中CD19+B細胞數量，結果如圖15所示；同時取腸系膜淋巴結用流式細胞術測定 促炎癥因子IFN- Y、TNF的表達情況，結果如圖16所示。試驗結果表明，Lb.planturm/pW25et-poIL-10提高了脾細胞中CD19+B細胞數量 和外周血中免疫球蛋白IgG、IgM和IgA的含量，下調了促炎癥因子IFN-Y、TNF的表 達，有效調節仔豬的免疫機能。
權利要求
1.豬白細胞介素10重組乳酸菌，它是轉化了重組質粒pW425et-pOIL-10的乳酸菌， 其中poIL-10為豬白細胞介素10基因的簡稱，所述的乳酸菌為植物乳酸桿菌、保加利亞 乳桿菌、瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、羅伊氏乳桿菌或發酵乳桿菌。
2.根據權利要求1所述的豬白細胞介素10重組乳酸菌，其特征在于所述的乳酸菌 為植物乳酸桿菌。
3.根據權利要求2所述的豬白細胞介素10重組乳酸菌，其特征在于所述的 poIL-10,是以豬脾細胞RNA為模板，擴增出的基因序列；
4.根據權利要求3所述的豬白細胞介素10重組乳酸菌，其特征在于所述的 poIL-10,其堿基序列如序列表SEQ ID No.l所示。
5.—種重組質粒，pW425et-poIL_10。
6.豬白細胞介素10重組乳酸菌的制備方法，它包括1)以豬脾細胞RNA為模板，PCR方法擴增獲得poIL-10基因序列，其上下游分別含 有Kpn I和HindIII酶切位點；2)將poIL-10基因插入大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達載體pW425et中，構建大腸桿 菌_乳酸菌穿梭表達重組質粒pW425et-poIL-10 ；3)將重組質粒pW425et-poIL_10轉化至乳酸菌中。
7.—種豬免疫增強劑，它是將豬白細胞介素10重組乳酸菌，接種于液體MRS培養基 中，37°C靜止厭氧培養至每毫升菌液中含有2 X IO11個活菌。
8.—種增強豬免疫力的飼養方法，它包括仔豬從7日齡起每日口服用一次所述的 4ml/次一種豬免疫增強劑，連續服用7-14天。
全文摘要
本發明以豬脾細胞中RNA為模板，采用RT-PCR技術獲得poIL-10基因，與克隆載體pMD18T載體連接后轉化至大腸桿菌中，將poIL-10基因插入到大腸桿菌-乳酸菌穿梭表達質粒pW425et中，構建重組質粒pW425et-poIL-10，并將其電轉化至乳酸菌中，獲得了可穩定表達豬白細胞介素10的重組乳酸菌；該重組乳酸菌經過口服可定植于腸道內，并穩定地表達豬白細胞介素10，有效調節機體的免疫功能，刺激B細胞增殖，提高了血清中IgG、IgM和IgA的水平，增強了機體對病原微生物產生特異性抗體的能力，保障豬的健康生長，促進畜牧業持續健康發展。
文檔編號C12N15/24GK102010849SQ20101054872
公開日2011年4月13日 申請日期2010年11月18日 優先權日2010年11月18日
發明者彭永鶴, 楊文濤, 楊桂連, 王春鳳, 石海寧, 郝鳳奇 申請人:廣東天浩生物工程股份有限公司