專利名稱：Tt1基因在植物遺傳轉化篩選中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程領域，具體涉及TTl基因作為篩選標記基因在植物遺傳 轉化中的應用。
背景技術：
自1983年第一株轉基因植物誕生以來，全球抗蟲、抗病、抗除草劑和品質改良的 棉花、水稻、大豆、玉米等轉基因植物已達120多種，種植面積9000萬公頃。轉基因技術的 發展能夠將具有優良性狀的目的基因導入生物基因組中，從而使得其遺傳性狀得到改良。目前基因轉移在技術上還存在著一些限制因素，其中之一就是轉化過程中只有少 數細胞能夠吸收外源DNA并整合進基因組中，而大多數細胞仍是未轉化的。因此，目的基因 的引入常常需要篩選標記基因，從而賦予受體生物以特定的選擇性標記，以便于識別和鑒 定轉基因生物?，F在廣泛用于選擇的標記基因主要有2大類一類是抗生素抗性基因，包括 新霉素磷酸轉移酶基因(npt)、潮霉素磷酸轉移酶基因(hpt)、卡那霉素抗性基因(npt II) 等；另一類是除草劑抗性基因，包括草丁膦抗性基因(bar)、草甘膦抗性基因(epsp)等。然而，當獲得一個真正的轉基因植株后，篩選標記基因就失去其功能和意義，這些 標記基因在轉化后仍保留在生物體內，其繼續表達的產物也會帶來一些不良后果，具有許 多潛在的危害第一安全性。篩選標記基因中抗生素抗性標記基因的安全問題，主要是指其抗性 基因轉移所導致的在環境中的傳播。另外，轉基因動、植物中的標記基因是否會通過食物在 腸道中水平轉移至微生物，從而影響抗生素治療的有效性。對除草劑抗性基因的擔憂主要 是因為這類基因可能存在雜草化等生態學風險。盡管風險評估報告對一些篩選標記基因提 供了安全保證，公眾對安全的關心已經大大阻礙了轉基因作物的商品化，而且對其他標記 基因及其產物的風險評估是一個既昂貴又繁瑣的過程。第二影響轉化細胞再生。當細胞被轉化后，需要從非轉化細胞中鑒別并分離出轉 化細胞。篩選標記基因同目的基因共同轉化，然后將轉化后的細胞培養在含有抗生素或除 草劑的培養基上，轉化細胞能夠存活并生長，而非轉化細胞不能生長而最終死亡。非轉化細 胞在逐漸凋亡過程中能夠分泌毒素或生長抑制劑，阻礙營養物質向轉化細胞的運輸，進而 影響轉化細胞的增殖及分化。第三影響多重轉化。通過基因轉移技術將多個外源目的基因導入植物體內，已成 為育種學家們的研究目標。標記基因的使用雖然有助于轉化細胞的篩選，但影響多重轉化。 在細胞第一次轉化中使用了某一特殊的標記基因，在隨后的轉化中就要使用不同的標記基 因。盡管轉基因植物能給人類帶來了巨大的利益，但目前仍有很多人擔心轉基因植物 可能對生態環境構成威脅，轉基因食品也可能對人類健康造成危害。為了尋找新的、安全 的篩選標記代替抗生素基因、抗除草劑基因，以甘露糖(磷酸甘露糖異構酶基因pmi)、木糖 (木糖異構酶基因xylA)為篩選劑的轉化系統應運而生。其原理是因這些糖類不被一般植物細胞吸收而使非轉基因細胞的生長受阻，使轉基因細胞分離出來。雖然這些糖類對生物 細胞無害且易于被微生物分解，避免了抗生素的副作用，但用于遺傳轉化時，不同植物所需 篩選劑濃度差別很大，且pmi本身就存在于一些豆科植物中外，可用其篩選的植物范圍較 小，在絕大多數植物上的效果還有待驗證。因此，為了消除人們的這種擔憂，如何利用安全、有效的篩選標記基因進行外源目 的基因的篩選，已經成為近年來植物轉基因研究中的一個熱點，也是今后基因工程研究的 重要方向之一，目前本領域需要提供新的有效方案。

發明內容
本發明要解決的技術問題是為轉基因植物的篩選提供一種新的有效選擇。本發明解決技術問題的方案是提供了 TTl基因在植物遺傳轉化篩選中的應用。其中，上述TTl基因具有如下核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列或其簡并序列；或O)在⑴限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所 得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。進一步的，上述⑵在⑴限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加1個或幾 個(10個以內)核苷酸衍生所得的核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或 相似的多肽。本發明還提供了一種植物遺傳轉化篩選方法。該方法包括以下步驟a、將TTl基因可操作地連于載體上的表達調控序列后，形成含有所述TTl基因的 重組載體；b、將步驟a中的重組載體轉入目標植物細胞中；C、經使用逆境條件進行篩選獲得轉化細胞。另一方面，該方法還可以包括以下步驟a、將TTl基因可操作地連于載體上的表達調控序列后，形成含有所述TTl基因的 重組載體；b、將步驟a中的重組載體轉入目標植物細胞中；C、然后將目標植物細胞培育成植株或其后代，所述植物的后代包括植物種子及植 物組織，經使用逆境條件進行篩選獲得轉化體。上述的逆境篩選是指在目標植物的野生型不能承受而轉入TTl基因的轉基因型 能夠承受的高溫、低溫或高鹽的至少一種逆境下進行篩選，能承受逆境并存活的表明為轉 化體，即轉基因陽性。本發明還提供了一種基因工程用載體。該基因工程用載體使用TTl基因作為篩選 標記基因。本發明的上述逆境篩選可以在愈傷組織培養階段進行，也可以在待篩選植物的種 子萌發階段進行。在愈傷組織分化、生根階段或分化生根后的進行篩選時，將轉化后的愈傷組織放 入培養基中在逆境條件下篩選，篩選壓力應按照由低到高的原則，隨著篩選次數的增加，篩 選壓力的強度也逐漸增加；如第一次篩選效果較差時(轉基因與非轉基因不能區分，都生長良好)，第二次篩選可適當提高篩選壓力濃度。篩選數天后可見有的愈傷組織逐漸分化 出葉苗或根系，或逐漸長大，表明此類愈傷組織轉入重組載體，即為轉基因陽性；而有的愈 傷組織逐漸褐化或透明，或停止生長，則表明此類愈傷組織耐逆境能力較低，未轉入重組載 體，即為轉基因陰性。比如高鹽(NaCl)逆境條件進行篩選時，以在愈傷組織分化、生根階段或分化生根 后的篩選階段，將轉化后的愈傷組織放入含有5 40mg/L NaCl的培養基(培養基種類以具 體的待篩選物種確定)中篩選，篩選濃度應按照由低到高的原則，隨著篩選次數的增加，篩 選濃度也逐漸增加；第一次篩選效果較差時(轉基因與非轉基因不能區分，都生長良好)， 第二次篩選可適當提高NaCl濃度。篩選數天后可見有的愈傷組織逐漸分化出葉苗或根系， 或逐漸長大，表明此類愈傷組織轉入重組載體，即為轉基因陽性；而有的愈傷組織逐漸褐化 或透明，或停止生長，則表明此類愈傷組織耐鹽性較低，未轉入重組載體，即為轉基因陰性。 生長良好的愈傷組織可轉入不含NaCl的培養基中恢復生長，待葉片及根系發育完全后移 栽，獲得轉基因植株。在種子萌發階段進行篩選時將待篩選植物的種子放入逆境條件中，可見有些種 子逐漸發芽，并開始生長，表明此類種子為轉基因陽性；而有些種子不能發芽，或即使發芽 也不能生長，則表明此類種子為轉基因陰性。發芽并能繼續生長的種子可移入正常環境中 生長，獲得轉基因植株。比如高鹽(NaCl)逆境條件進行篩選時，將轉基因植物的種子放入含0. 5 2g/L NaCl的水或培養基中，在常規種子生長的光照、溫度、濕度條件下生長5 10天，可見有些 種子逐漸發芽，并開始生長，表明此類種子為轉基因陽性；而有些種子不能發芽，或即使發 芽也不能生長，則表明此類種子為轉基因陰性。發芽并能繼續生長的種子可移入正常環境 中生長，獲得轉基因植株。本發明中所述的TTl基因，其基本核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所示，該 基因來源于十字花科(Brassicaceae，也名Cruciferae)中芥屬(Brassica)的植物油菜 (Brassicanapus)。在本發明中，“在SEQ ID NO. 1中的核苷酸序列經過取代、缺失或添加至少一個核 苷酸衍生序列”的TTl基因序列一般是指編碼具有SEQ ID NO. 1所編碼的蛋白活性的多肽 的核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指所述序列中有一個或多個密碼子被編碼相同 氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO. 1同 源性低至約89%的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO. 1所編碼的多肽的序列。另外，“在SEQ ID NO. 1中的核苷酸序列經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生序列”的含義還包括能 在中度嚴謹條件下，更佳的在高度嚴謹條件下與SEQ ID NO. 1核苷酸序列雜交的核苷酸序 列。該術語還包括與SEQ ID NO. 1中的核苷酸序列的同源性至少80%，較佳地至少89%， 更佳地至少90 %，最佳地至少95 %的核苷酸序列。在本發明中的相同功能是指提高植物的 抗逆性能。該術語還包括能編碼具有與天然的SEQ ID NO. 1所編碼的相同功能的蛋白的SEQ ID NO. 1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常 為1 90個，較佳地1 60個，更佳地1 20個，最佳地1 10個)核苷酸的缺失、插入 和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。比如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列，其 編碼的多肽也能提高植物的抗逆性能。本發明所述重組載體，是將TTl基因插入到載體中獲得，上述載體可選用本領域 已知的各種載體，尤其是真核表達載體(如PBI121或pCAMBIA2301)。本發明可用上述重組 載體轉化宿主植物細胞，篩選獲得轉化細胞。然后使用各種上述的逆境條件進行篩選。本發明中所述的“可操作地連于”表示如下情況即線性DNA序列的某些部分能夠 影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽 的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA ；如果啟動子控制序 列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位 置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前 導序列則意味著在閱讀框中相鄰。本發明的有益效果在于本發明提供了篩選標記基因在植物遺傳轉化中的應用。 將TTl基因作為篩選標記基因，用于篩選的成本低，而且在轉化目的基因的同時使植物獲 得了另一個逆境抗性，這使得篩選基因同時具有一定的應用價值，且該應用價值對于生物 沒有負面影響。


圖1 愈傷組織在含氯化鈉的分化培養基上生長，左管為未轉入TTl基因的愈傷 組織；右管為轉入TTl基因的愈傷組織，右管具有一定的耐鹽性，即能長出葉片(如右管所 示)°圖2 轉基因水稻植株中TTl基因的PCR電泳檢測結果。從左至右依次為陽性對 照(+)，待檢測植株1 7號，野生型陰性對照(_)。圖3 愈傷在篩選培養基上生長情況(若確實轉入TTl基因，該愈傷可長出愈傷 芽，黑圈中所示)。圖4 轉基因油菜植株中TTl基因的PCR電泳檢測結果。從左至右依次為陽性對 照(+)，待檢測植株1 8號，野生型陰性對照(_)。
具體實施例方式
下面通過實施例并結合附圖，進一步說明而不限定本發明。下述實施例中，凡未注明具體實驗條件的，均為按照本領域技術人員熟知的常規 條件，例如 Sambrook，Russell 的分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。下述實施例中，所 用農桿菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章魚堿型菌系的LBA4404菌株；大腸桿菌 (E. coli)采用DH5a菌株，菌株均購自于Qiagen公司。載體pBI121購自于Clontech公 司。其余化學實際均為市售分析純。下述實施例中，“SEQ ID N0. 1”單獨出現時，本領域技 術人員可理解1其為“SEQ IDN0. 1所示核苷酸序列”的簡稱。實施例一 TTl基因的克隆及過量表達重組載體的構建1、TTl基因的克隆以油菜中的atp6(genebank gi :89279377)基因為誘餌蛋白，根據酵母雙雜交方法(見Clontech公司所公開的資料)，篩選到油菜中的一個EST序列(SEQ ID N0:2所示)， 再根據這段篩選到的序列，通過5’RACE (見Takara公司所公開的資料)的方法獲得本發明 所述基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1所示。根據SEQ ID NO 1所示核苷酸序列設計引物，上游引物(SEQID NO. 3) :5，-ATGTCGGATGATTTGAGTTTATG-3，，下游引物(SEQID NO. 4) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。用TRIzoI法提取油菜RNA (見hvitrogen公司公開資料)反轉錄得到cDNA (見 Promega公司公開的反轉錄試劑盒資料)。經PCR從油菜cDNA中擴增SEQ ID NO 1所示的 核苷酸序列。對PCR產物純化(見Qiagen公司所公開的PCR產物純化資料)，經測序驗證， 得到序列SEQ ID NO 1的基因片段。2、TTl過量表達重組載體的構建根據SEQ ID NO 1所示核苷酸序列設計引物，上游引物(SEQID NO. 5) :5，-CGCGGATCCATGTCGGATGATTTGAGTTTATG-3，，下游引物(SEQID NO. 6) :5，-CCGGAGCTCTCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，。經PCR，從油菜cDNA中擴增完整的SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。對PCR產物 純化(見Qiagen公司所公開的資料)，然后用BamHl與Mcl酶切，膠回收，與載體pBI121 連接(連接位點=BamHl與Mel)，獲含SEQ ID NO 1的過量表達重組質粒。實施例二水稻遺傳轉化及NaCl篩選愈傷組織1、轉化載體的構建采用的水稻材料(Oryza sativa L.)為粳稻日本晴，為四川農業大學水稻研究所 保存。農桿菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章魚堿型菌系的LBA4404菌株；大腸桿 菌(E. Coli)采用DH5 α菌株。通過凍融法將含SEQ ID NO. 1的過量表達重組質粒轉入大腸桿菌DH5 α中繁殖， 提取質粒(見Qiagen公司公開資料)，將含SEQ ID NO. 1的過量表達重組質粒轉入農桿菌 LBA4404中，涂平板形成單菌落待用。2、外植體培養——成熟胚愈傷組織的誘導和繼代選取外觀健康，飽滿，無病斑的成熟水稻種子脫去穎殼，75%酒精中浸泡1分鐘， 用無菌水沖洗干凈后，0. 升汞滅菌20分鐘，再用無菌水沖洗干凈。在超凈工作臺上晾 干，接種到誘導培養基(NB+2，4-D 2. 5mg/L)上，于^TC下暗培養。2周后統計愈傷組織的 誘導情況并進行繼代，以后每2周繼代一次。3、工程菌的活化與浸染在平板上挑取農桿菌單菌落，經PCR檢測(上游引物(SEQ ID N0. 7) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，，下游弓| 物(SEQ ID N0. 8) 5’ -TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’)，確定轉基因陽性菌落，放在IOmlYEP液體培養基(酵 母提取物IOg+胰蛋白胨5g+氯化鈉IOg+加水至IL+利福平50 μ g/mL)中，250r/min，28°C 活化培養過夜。取過夜培養液300 μ 1于:3ml YEP液體培養基中，在250r/min，28°C的條件 下遮光振動培養，至菌液達0D600 = 0. 5左右，即可用于轉化。上述含目的基因的菌液在無菌的50ml的離心管中以5000r/min離心5分鐘后回 收菌體，用30ml的NBCO (NB+2，4_D 2. 0mg/L+乙酰丁香酮100 μ mol/L)液體培養基重懸含目的基因的菌體。選擇生長狀態良好的，顆粒狀胚性愈傷組織用無菌鑷子將其適當夾小，創 造傷口，然后放在菌液中浸泡，一般浸染時間為10 30min，之后放入有濾紙的平皿中吸干 多余菌液。4、共培養與NaCl篩選將吸干菌液的愈傷置于NBC0(NB+2，4-D 2. Omg/L+乙酰丁香酮100 μ mol/L)固體 培養基上，22 25°C暗培養2 3天，直至愈傷組織上出現少量菌斑為止。將共培養的愈 傷組織放在廣口瓶中，用無菌水清洗至清澈，再浸泡于含頭孢霉素500mg/L NBCO液體培養 基中30 60min，將處理后的愈傷組織用無菌濾紙吸干。將愈傷組織接種到預分化培養基(NB+KTlmg/L+NAA 0. 25mg/L)上，暗培養10 15 天。再轉到分化培養基(NB+KTlmg/L+NAA 0. 25mg/L+6-BAlmg/L+NaCl 12mg/L)上，25 27°C光照培養(12小時/天)約1 2個月。如果轉入TTl基因，則該愈傷具有一定的耐鹽 性，即能長出葉片(見圖1)。之后將長出葉片幼苗轉到生根培養基(NB+NAA 0. 25mg/L+NaCl 20mg/L)上培養，當根長到2cm左右高時取出，洗凈根部的培養基，轉入盆栽。5、轉基因水稻的PCR檢測取上述步驟篩選出的轉基因陽性水稻植株新鮮葉片，抽提總DNA(見Qiagen公司 所公開的資料)，以提取的DNA做模板，進行PCR檢測。上游引物(SEQID NO. 7) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，下游引物(SEQID NO. 8) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，PCR反應完成，在瓊脂糖凝膠上電泳檢測，有目標條帶出現(見圖2)，表明目的基 因轉化成功。實施例三油菜遺傳轉化及NaCl篩選轉基因愈傷組織1、轉化載體的構建采用的甘藍型油菜(Brassica napus L)材料為蜀雜九號84100-18，為四川大學生 命科學院提供。農桿菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章魚堿型菌系的LBA4404菌 株；大腸桿菌(E. Coli)采用DH5 α菌株。通過凍融法將含SEQ ID NO. 1的過量表達重組質粒轉入大腸桿菌DH5 α中繁殖， 提取質粒(具體方法參見Qiagen公司公開的資料)，將含SEQ ID NO. 1的過量表達重組質 粒轉入農桿菌LBA4404中，涂平板形成單菌落待用。2、下胚軸的預培養選取籽粒飽滿的甘藍型油菜種子，4°C過夜春化后用70%乙醇浸泡30s lmin， 0. 1 %的升汞(HgC12)溶液浸泡8 lOmin，無菌水沖洗5次，濾紙吸干，接種于MS固體培養 基上，24°C暗培養2 5天，然后取出光照l^i/d繼續萌發7 10天。取5 7cm無菌苗下胚軸，將油菜下胚軸切成7mm左右小段，分散均勻置于預培養 基(MS+ang/L 6-BA+lmg/L 2，4_D+2. 5mg/LAgN03+19. 62mg/L 乙酰丁香酮)中進行 2 5 天 的預培養。3、下胚軸的浸染及共培養在平板上挑取農桿菌單菌落，經PCR檢測(上游引物(SEQ ID N0. 7) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，，下游弓| 物(SEQ ID N0. 8) 5’ -TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’)，確定轉基因陽性菌落，將SEQ ID NO. 1過量表達重組質粒的農桿菌接種于含40mg/L利福平LB液體培養基中，搖菌過夜后收集菌體，重懸于 含100mg/L乙酰丁香酮的MS液體培養基中至0D600 = 0. 4 0. 6，搖菌1 2h。將經預培養的健壯的油菜下胚軸分別浸入含SEQ ID NO. 1的過量表達重組質粒的 農桿菌菌液中30s lmin，之后用無菌濾紙迅速吸干多余的菌液，將油菜下胚軸平放于共 培養基(MS+2mg/L6-BA+lmg/L2,4-D+2. 5mg/LAgN03+19. 62mg/L 乙酰丁香酮)上，培養 2 天。4、NaCl篩選培養與誘導將共培養后的油菜下胚軸分別接入分化培養基(MS+ang/L 6-BA+lmg/L 2， 4-D+2. 5mg/LAgN03+19. 62mg/L乙酰丁香酮)中繼續培養。每2周更新培養基一次，培養4 周，得到愈傷芽。將愈傷芽在篩選培養基(MS+ang/L6-BA+2. 5mg/L AgN03+NaCl 10mg/L)上，若確 實轉入TTl基因，該愈傷可長出愈傷芽(見圖3)。待芽長至4 6片真葉時，將芽從愈傷 組織中切下，移入生根培養基(1/2MS+0. 15mg/L NAA+250mg/L頭孢霉素+NaCl 15mg/L)中。 待再生苗根系生長發達時，然后將培養罐蓋揭開，在培養室中煉苗2 3d。煉苗后將含SEQ IDN0. 1的過量表達轉基因植株分別在生根培養基(1/2MS+0. 15mg/LNAA)上發育出完整根 系，將其轉入盆栽。5、轉基因油菜的PCR檢測將上述步驟篩選出的轉基因陽性油菜植株新鮮葉片，各取葉片少量抽提總 DNA (見Qiagen公司所公開的資料)，以提取的DNA做模板進行PCR檢測。上游引物(SEQID NO. 7) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，下游引物(SEQID N0. 8) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，PCR反應完成，在瓊脂糖凝膠上電泳檢測，有目標條帶出現(見圖4)，表明目的基 因轉化成功。實施例四油菜遺傳轉化及熱激篩選轉基因油菜種子1、轉化載體的構建采用的甘藍型油菜(Brassica napus L)材料為蜀雜九號84100-18，為四川大學生 命科學院提供存。農桿菌(Agrobacterium tumefaciensp)采用章魚堿型菌系的LBA4404 菌株；大腸桿菌(E. Coli)采用DH5 α菌株。通過凍融法將含SEQ ID NO. 1的過量表達重組質粒轉入大腸桿菌DH5 α中繁殖， 提取質粒(見Qiagen公司公開資料)，將含SEQ ID NO. 1的過量表達重組質粒轉入農桿菌 LBA4404中，涂平板形成單菌落待用。2、下胚軸的預培養選取籽粒飽滿的甘藍型油菜種子，4°C過夜春化后用70%乙醇浸泡30s lmin， 0. 1 %的升汞(HgC12)溶液浸泡8 lOmin，無菌水沖洗5次，濾紙吸干，接種于MS固體培養 基上，24°C暗培養2 5天，然后取出光照l^i/d繼續萌發7 10天。取5 7cm無菌苗下胚軸，將油菜下胚軸切成7mm左右小段，分散均勻置于預培養 基(MS+ang/L 6-BA+lmg/L 2，4_D+2. 5mg/LAgN03+19. 62mg/L 乙酰丁香酮)中進行 2 5 天 的預培養。3、下胚軸的浸染及共培養在平板上挑取農桿菌單菌落，經PCR檢測(上游引物(SEQ IDNO. 7) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，，下游弓| 物(SEQ ID NO. 8) 5’ -TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3’)，確定轉基因陽性菌落，將SEQ ID NO. 1過量表達重組 質粒的農桿菌接種于含40mg/L利福平LB液體培養基中，搖菌過夜后收集菌體，重懸于 含100mg/L乙酰丁香酮的MS液體培養基中至0D600 = 0. 4 0. 6，搖菌1 2h。將經預培養的健壯的油菜下胚軸分別浸入含SEQ ID NO. 1的過量表達重組質粒的 農桿菌菌液中30s lmin，之后用無菌濾紙迅速吸干多余的菌液，將油菜下胚軸平放于共 培養基(MS+2mg/L6-BA+lmg/L2,4-D+2. 5mg/LAgN03+19. 62mg/L 乙酰丁香酮)上，培養 2 天。4、篩選培養與誘導將共培養后的油菜下胚軸分別接入分化培養基(MS+ang/L 6-BA+lmg/L 2， 4-D+2. 5mg/LAgN03+19. 62mg/L乙酰丁香酮)中繼續培養。每2周更新培養基一次，培養4 周，得到愈傷芽。將愈傷芽在篩選培養基(MS+ang/L 6-BA+2. 5mg/LAgN03)上，待芽長至4 6片真 葉時，將芽從愈傷組織中切下，移入生根培養基(1/2MS+0. 15mg/LNAA+250mg/L頭孢霉素) 中。待再生苗根系生長發達時，然后將培養罐蓋揭開，在培養室中煉苗2 3d。煉苗后將 含SEQ IDN0. 1的過量表達轉基因植株分別在生根培養基(1/2MS+0. 15mg/LNAA)上發育出 完整根系，將其轉入盆栽培養，收種備用。5、轉基因油菜種子的熱激篩選選取轉基因油菜種子各100粒，放入培養皿中，加水4°C春化過夜。之后將種子放 入盛水的EP管中，置于46°C水浴鍋中熱激池，之后將種子平鋪于墊有浸潤濾紙的培養皿 中，待觀察。約7天后，將可發芽的種子移入土壤中繼續生長，待長至3-4片真葉時，進行 PCR檢測。6、轉基因油菜的PCR檢測將上述步驟篩選出的油菜植株新鮮葉片，各取葉片少量抽提總DNA(見Qiagen公 司所公開的資料)，以提取的DNA做模板進行PCR檢測。上游引物(SEQID N0. 7) :5，-ATTTCATTTGGAGAGAACACGG-3，下游引物(SEQID N0. 8) :5，-TCAGACTGGTGTTGGGTTGGATAT-3，PCR反應完成，在瓊脂糖凝膠上電泳檢測，有目標條帶出現，表明目的基因轉化成 功，篩選出的植株確為轉基因陽性植株。
權利要求
1.TTl基因在植物遺傳轉化篩選中的應用。
2.根據權利要求1所述的用途，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列或其簡并序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。
3.植物遺傳轉化篩選方法，其特征在于包括以下步驟a、將TTl基因可操作地連于載體上的表達調控序列后，形成含有所述TTl基因的重組 載體；b、將步驟a中的重組載體轉入目標植物細胞中；c、經使用逆境條件進行篩選獲得轉化細胞。
4.植物遺傳轉化篩選方法，其特征在于包括以下步驟a、將TTl基因可操作地連于載體上的表達調控序列后，形成含有所述TTl基因的重組 載體；b、將步驟a中的重組載體轉入目標植物細胞中；C、然后將目標植物細胞培育成植株或其后代，所述植物的后代包括植物種子及植物組 織，經使用逆境條件進行篩選獲得轉化體。
5.根據權利要求3或4所述的方法，其特征在于所述TTl基因具有如下核苷酸序列(1)如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或O)在(1)限定的核苷酸序列中經過取代、缺失或添加至少一個核苷酸衍生所得的 核苷酸序列，且與SEQ ID NO. 1的序列編碼功能相同或相似的多肽。
6.根據權利要求3或4所述的方法，其特征在于所述的逆境篩選是指在目標植物的 野生型不能承受而轉入TTl基因的轉基因型能夠承受的高溫、低溫或高鹽的至少一種逆境 下進行篩選，能承受逆境并存活的表明為轉化體，即轉基因陽性。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述的逆境篩選在待篩選植物的愈傷組 織培養階段進行或者在待篩選植物的種子萌發階段進行。
8.基因工程用載體，其特征在于使用TTl基因作為篩選標記基因。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，具體涉及TT1基因在植物遺傳轉化篩選中的應用。本發明要解決的技術問題是為轉基因植物的篩選提供一種新的有效選擇。本發明解決技術問題的方案是提供了TT1基因在植物遺傳轉化篩選中的應用。實驗證明，將TT1基因作為篩選標記基因，用于篩選的成本低，而且在轉化目的基因的同時使植物獲得了另外的逆境抗性，這使得篩選基因同時具有一定的應用價值，且該應用價值對于生物沒有負面影響，具有很好的應用前景。
文檔編號C12Q1/02GK102140474SQ20101055221
公開日2011年8月3日 申請日期2010年11月19日 優先權日2010年1月28日
發明者楊毅 申請人:四川貝安迪生物基因工程有限公司