專利名稱：凝固蛋白原原料及其制造方法、使用它測定來自生物的生理活性物質的方法和測定裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于迅速或高靈敏度地進行內毒素、β-D-葡聚糖等來自生物的生理活性物質的檢測或濃度測定的試劑、其制造方法、以及使用該試劑的測定方法和測定裝置。
背景技術：
內毒素是存在于革蘭氏陰性菌的細胞壁中的脂多糖，是最有代表性的致熱原。如果被該內毒素污染的輸液、注射藥、血液等進入人體，則可能引起發熱、休克等嚴重的副作用。因此，需要管理上述藥物等以使其不被內毒素污染。在鱟(力f卜力二)的血細胞提取物(以下也稱為“LAL 鱟變形細胞溶解物”)中存在被內毒素激活的酶——絲氨酸蛋白酶。并且在LAL與內毒素反應時，根據內毒素量而激活的絲氨酸蛋白酶產生酶級聯，由此，存在于LAL中的凝固蛋白原被水解成凝固素，凝固素締合生成不溶性的凝膠。利用該LAL的特性，可以高靈敏度地檢測內毒素。另外，β -D-葡聚糖是構成真菌中特征性細胞膜的多糖。通過測定β -D-葡聚糖， 不僅在如念珠菌(Candida) ^il· ^ il· % (Spergillus)、隱球菌(Cryptococcus)的一般臨床中常見的真菌中，而且在也包含稀有真菌的廣范圍內對于真菌感染病的篩選等是有效的。在β -D-葡聚糖的測定中，也利用鱟的血細胞提取成分被β -D-葡聚糖凝固(凝膠凝固)的特性，可以高靈敏度地檢測β-D-葡聚糖。對這種內毒素、β-D-葡聚糖等可由鱟的血細胞提取成分檢測的來自生物的生理活性物質(以下也稱為規定生理活性物質)進行檢測或濃度測定的方法是半定量凝膠化法，其中將要進行規定生理活性物質的檢測或濃度測定(以下也簡稱為“規定生理活性物質的測定”)的樣品與基于LAL制造的試劑(LAL試劑)混合所得的混合液靜置，在一定時間后將容器倒轉，通過樣品有無垂落來判定是否凝膠化，從而檢查樣品中是否含有一定濃度以上的內毒素。還有比濁法、比色法等，在比濁法中，LAL試劑與規定生理活性物質的反應導致凝膠的生成，隨時間測量伴隨凝膠生成的樣品濁度進行分析；在比色法中，使用由于酶級聯而水解并顯色的合成底物。在通過上述比濁法進行規定生理活性物質的測定的情況下，在經干熱滅菌處理的玻璃制測定池內生成測定樣品與LAL試劑的混合液。然后，從外部對混合液的凝膠化進行光學測定。但是，在比濁法中，特別是在規定生理活性物質的濃度低的樣品中，存在混合液發生凝膠化需要很長時間的情況。為此，需要可進行規定生理活性物質的短時間測定的方法。已提出了激光散射顆粒測量法等，該方法例如用磁性攪拌子來攪拌測定樣品與LAL試劑的混合液，由此生成凝膠微粒，根據由凝膠顆粒散射的激光強度或者透過混合液的光強度，可在短時間內測定樣品中規定生理活性物質的存在。LAL試劑是以鱟的血細胞提取物為主要原料制造的。因此，在制造中，內毒素、 β-D-葡聚糖可能以一定的概率混入，形成無法作為試劑利用的廢棄物。另外，在內毒素或β -D-葡聚糖中任一種的測定方法中，測定試劑的原料都為有限資源的鱟的血細胞提取物， 因此必須努力減少試劑的使用量、或者降低試劑制造上的損耗。作為減少試劑使用量的嘗試，當然可以單純地減少樣品容量，另外提高測定靈敏度因而降低測定次數也是有效的。另一方面，為了減少制造上的損耗，如何抑制內毒素、 β-D-葡聚糖帶來的污染是重要的。進一步地，還必須考慮如何從制造過程中變得無法作為試劑使用的原料中除去內毒素、β-D-葡聚糖，進行再利用，或者作為輔助性的試劑添加物利用等。在作為輔助性的試劑添加物利用的情況下，考慮作為起試劑粘性調節劑的作用、在凝膠化·凝集中起中心作用的凝固蛋白原原料的利用等。但是，如果只是除去例如被內毒素污染而變得無法使用的原料中的內毒素，仍不可能除去已經被激活的酶組。只使原料中的酶活性失活而仍保持凝固蛋白原的功能，即，被激活的凝固酶水解形成凝固素、發生凝膠化·凝集反應的功能的原料的制造方法尚未見報道。現有技術文獻
專利文獻
專利文獻1 日本特許第2667695號公報； 專利文獻2 日本特開2004-061314號公報； 專利文獻3 日本特開平10-2931 號公報。

發明內容
本發明針對上述問題而提出，其目的在于提供獲得凝固蛋白原原料的技術，所述原料保持LAL試劑或者被來自生物的生理活性物質污染的LAL試劑等中的凝固蛋白原功能、同時使凝固酶活性不可逆地失活，并且可用于試劑。為解決上述課題，本發明的最大特征在于通過在某種溫度條件下對允許混入一些規定生理活性物質的LAL試劑進行加熱處理，只使LAL試劑中的酶活性不可逆地失活。在本發明中，此時凝固蛋白原原本的活性得以保持，該凝固蛋白原原本的活性是被激活的凝固酶水解形成凝固素，引發凝膠化·凝集反應。更具體地說，本發明是凝固蛋白原原料的制造方法，該凝固蛋白原原料在下述情況下使用使含有規定的酶組和凝固蛋白原的鱟的血細胞提取物LAL與來自生物的規定的生理活性物質反應，通過上述生理活性物質激活上述酶組，發生酶級聯，由此，凝固蛋白原被水解為凝固素，利用該性質檢測上述生理活性物質或測定上述生理活性物質的濃度；本發明的凝固蛋白原原料的制造方法的特征在于將LAL以規定溫度加熱處理規定時間，從而使該LAL中的上述酶組的至少一部分失活，同時保持凝固蛋白原的活性。由此，可以使LAL中構成酶級聯的酶組的至少一部分失活，由此來抑制酶級聯的發生，可以獲得即使被內毒素、β-D-葡聚糖等污染也難以被水解形成凝固素的凝固蛋白原原料。另外，由此，可以使由于內毒素、β -D-葡聚糖等的污染而變得不可使用的LAL試劑的凝固蛋白原在保持其功能的情況下獲得，因此可以更有效地活用由鱟的血細胞獲得的有限的資源。這里，規定的酶組例如是指LAL中的C因子、B因子、G因子、凝固酶前體等，它們通過內毒素、β-D-葡聚糖等發生酶級聯，可生成最終水解凝固蛋白原的凝固酶的酶類。即，不使LAL中的全部的酶失活，而是使至少一部分酶失活，即使存在內毒素或β -D-葡聚糖等， 也不會生成最終水解凝固蛋白原的凝固酶，則可實現本發明的目的。另外，在上述描述中，來自生物的規定的生理活性物質是指具有下述特性的生理活性物質激活LAL中的規定的酶組，發生酶級聯，生成最終水解凝固蛋白原的凝固酶，例如如上所述，可舉出內毒素、β-D-葡聚糖。不過，其意圖也包含具有同等特性的其它生理活性物質，并不限于上述2種物質。在上述描述中，在LAL以溶液的形式供給的情況下，可以使規定溫度為60°C以上。 這里，根據本發明人的深入研究，了解到將溶液形式的LAL試劑在60°C以上加熱處理，則可以使絲氨酸蛋白酶等酶組的酶活性大致完全失活。因此，在LAL以溶液的形式供給的情況下，通過使規定溫度為60°C以上，可以更確實地獲得即使被內毒素、β-D-葡聚糖等污染， 也不會被水解生成凝固素的凝固蛋白原原料。另外，在上述描述中，在LAL以溶液形式供給的情況下，規定溫度可以是80°C以下。這里，根據本發明人的深入研究，了解到在將LAL試劑加熱處理至比80°C高的溫度、使酶活性失活的情況下，由于LAL中蛋白質的變性而使試劑發生白濁。這樣，可能不適合通過試劑的透射光、散射光，通過光學方法進行規定生理活性物質的檢測或濃度測定的目的。因此，在本發明中，在LAL以溶液形式供給的情況下，通過使規定溫度為80°C以下，可以獲得也適合光學測定的、利用價值更高的凝固蛋白原原料。并且，在上述描述中，在LAL以溶液的形式供給的情況下，規定時間可以是10分鐘以上且8小時以下。這里，在將溶液形式的LAL試劑在60°C以上加熱處理的情況下，可知加熱時間10分鐘左右可以使絲氨酸蛋白酶等酶組的酶活性大致完全失活。因此，通過使規定時間為10分鐘以上，可以在廣范圍的加熱溫度下使絲氨酸蛋白酶等酶組的酶活性大致完全失活。另外，在加熱時間過長的情況下，即使在低溫下LAL中的蛋白質也會變性，產生白濁。因此，在本發明中，通過使規定時間為10分鐘以上且8小時以下，可以更確實地獲得即使被內毒素、β -D-葡聚糖等污染也不會被水解形成凝固素的適合光學測定的凝固蛋白原原料。并且，在上述描述中，在LAL以冷凍干燥物的形式供給的情況下，規定溫度可以是 100°C以上且250°C以下。這里可知，在LAL以冷凍干燥物的形式供給的情況下，與以溶液的形式供給時比較，必須以更高的溫度加熱處理。在這種情況下，通過使LAL試劑為100°C以上且250°C以下，可以更確實地獲得即使被內毒素、β -D-葡聚糖等污染也不會被水解形成凝固素的適合光學測定的、利用價值更高的凝固蛋白原原料。另外，在這種情況下，可以使規定時間為300分鐘以上。這里，在LAL以冷凍干燥物的形式供給的情況下可知，通過將LAL試劑在120°C下加熱300分鐘，可以使絲氨酸蛋白酶等酶組的酶活性大致完全失活。因此，通過使規定時間為300分鐘以上，可以在更廣范圍的加熱溫度下更確實地獲得即使被內毒素、β -D-葡聚糖等污染也不會被水解形成凝固素的凝固蛋白原原料。另外，本發明也為凝固蛋白原原料，該凝固蛋白原原料在下述情況下使用使含有規定的酶組和凝固蛋白原的鱟的血細胞提取物LAL與來自生物的規定的生理活性物質反應，通過上述生理活性物質激活上述酶組，發生酶級聯，由此，凝固蛋白原被水解為凝固素，利用該性質檢測上述生理活性物質或測定上述生理活性物質的濃度；
所述凝固蛋白原原料的特征在于將LAL以規定溫度加熱處理規定時間，從而使該LAL 中的上述酶組的至少一部分失活。在該凝固蛋白原原料中，與規定生理活性物質反應而發生酶級聯的酶組失活，因此可以抑制由于少量的規定生理活性物質污染而使凝固蛋白原水解、生成凝固素的情況， 可以獲得操作性更良好的凝固蛋白原原料。在這種情況下，在LAL以溶液的形式供給的情況下，規定溫度可以是60°C以上。還可以是80°C以下。并且規定時間可以是10分鐘以上且 8小時以下。另一方面，在LAL以冷凍干燥物的形式供給的情況下，規定溫度可以是100°C 以上且250°C以下。另外，規定時間可以是300分鐘以上。另外，本發明中可以是用于上述生理活性物質的檢測或上述生理活性物質濃度測定的LAL試劑，其特征在于通過將上述得到的凝固蛋白原原料與未經加熱處理的LAL混合，提高上述未經加熱處理的LAL中的凝固蛋白原濃度。即，通過將使規定的酶組失活的凝固素原料加入到未經加熱處理的LAL中，可以制備凝固蛋白原濃度比通常更高的LAL試劑。由此，可以使凝固蛋白原的量相對增加，該凝固蛋白原被與規定生理活性物質反應而激活的酶組水解、形成凝固素。因此，可以使規定生理活性物質引起的LAL試劑的凝膠化更為顯著，可以更高靈敏度地進行規定生理活性物質的測定。另外，本發明可以是用于測定內毒素的、結合凝固蛋白原的微珠，其特征在于將上述得到的凝固蛋白原原料中的凝固蛋白原結合或吸附于比該凝固蛋白原直徑大的多個微粒的表面來制備。這里可知，使內毒素等的規定生理活性物質與凝固蛋白原結合或吸附于例如樹脂制微粒上的狀態的LAL作用時，與使規定生理活性物質與LAL單體作用的情形比較，早期生成更大的凝集塊。這是由于微粒上的凝固蛋白原被LAL中的酶級聯水解，形成凝固素，它們使微粒之間產生締合。還明確了，該凝集反應難以受樣品的濁度、顏色的影響，并且該凝集反應與由LAL單體所引發的凝集反應相比非常強大。在本發明中，利用該現象，制備了使LAL中的酶組失活而得到的凝固蛋白原原料結合或吸附于微粒上的試劑(以下也稱為“結合凝固蛋白原的微珠”)。通過使含有內毒素的樣品與將該結合凝固蛋白原的微珠與LAL混合得到的試劑作用，LAL中原本存在的凝固蛋白原成為凝固素，發生凝集，同時，結合或吸附于微粒上的凝固蛋白原成為凝固素，使微粒之間締合，早期生成更大的凝集塊。由此，可以大幅促進LAL試劑與樣品的混合液中凝膠顆粒的生成。結果，可以更迅速且高靈敏度地進行規定生理活性物質的檢測或濃度的測定。LAL中所含的凝固蛋白原結合或吸附于微粒上時，首先，使可結合、吸附蛋白質的官能團存在于微粒的表面。然后，根據以往的方法，在該狀態下使LAL作用，使凝固蛋白原與微粒表面化學鍵合，或者靜電性、親水性、疏水性地吸附。此時的LAL中的反應時間長，因此考慮在以往的方法中，微粒、所使用的試劑類、水等中微量混合存在的規定生理活性物質與蛋白質中的酶組反應，凝固蛋白原被水解為凝固素，在凝固蛋白原與微粒的結合 吸附反應中，就開始發生了微粒的凝集。并且在這種情況下，由于酶的激活，試劑中的凝固蛋白原可能被水解、消耗。針對上述問題，以往，在將凝固蛋白原結合或吸附于微粒表面時，必須在使LAL試劑與微粒的懸浮液混合的同時，添加抑制LAL中的酶組與規定生理活性物質反應的抑制劑，將凝固蛋白原結合或吸附于微粒表面的操作復雜，在成本方面不利。與此相對，在本發明中，在凝固蛋白原原料的制備過程中使LAL中的酶組失活，因此可以省略添加抑制劑的步驟。由此，可以更簡便或以更低廉的成本制備將凝固蛋白原結合或吸附于微粒上的試劑。另外，本發明可以是來自生物的生理活性物質的測定方法，其特征在于將上述凝固蛋白原原料與未加熱處理的LAL混合，由此提高上述未經加熱處理的LAL中的凝固蛋白原濃度，將上述所得的LAL試劑與含有上述規定的生理活性物質的樣品混合；用上述規定的生理活性物質激活上述LAL試劑中的酶組，通過發生的酶級聯將濃度得到提高的上述凝固蛋白原水解為凝固素，利用上述過程來檢測上述規定生理活性物質或測定上述規定生理活性物質的濃度。根據該來自生物的生理活性物質的測定方法，可以使用更高濃度的凝固蛋白原進行規定生理活性物質的測定。因此，可以使規定生理活性物質與LAL的反應導致的凝膠化更為顯著，可以更高靈敏度地測定規定生理活性物質。另外，本發明可以是來自生物的生理活性物質的測定方法，其特征在于將上述結合凝固蛋白原的微珠與未經加熱處理的LAL和含有上述規定生理活性物質的樣品混合， 由此，通過上述規定的生理活性物質，上述未經加熱處理的LAL中的酶組被激活，發生酶級聯，由此，結合或吸附于上述微粒表面的凝固蛋白原被水解為凝固素，上述微粒之間交聯， 利用該性質來檢測上述規定的生理活性物質或測定上述規定的生理活性物質的濃度。根據該規定的生理活性物質的測定方法，使含有內毒素的樣品與如下制備的試劑作用將使LAL中的酶組失活得到的凝固蛋白原原料結合或吸附于微粒上，將所得到的結合凝固蛋白原的微珠和未經加熱處理的LAL混合而成的試劑。由此，原本在LAL中存在的凝固蛋白原成為凝固素，發生凝集，同時，結合或吸附于微粒上的凝固蛋白原成為凝固素， 使微粒之間締合，早期生成更大的凝集塊。由此可以大幅促進LAL試劑與樣品的混合液中凝膠顆粒的生成。結果，可以更迅速且高靈敏度地進行規定生理活性物質的檢測或濃度的測定。另外，本發明可以是來自生物的生理活性物質的攪拌比濁測定裝置，其特征在于， 該裝置裝備有以下設備
混合液保持設備，其使上述結合凝固蛋白原的微珠、未經加熱處理的LAL和含有上述規定的生理活性物質的樣品的混合液保持可以入射光，并使上述混合液中的反應進行； 攪拌設備，其攪拌上述混合液保持設備中的上述混合液； 光入射設備，其向上述混合液保持設備中的混合液入射光； 受光設備，其接收上述入射光在上述混合液中的透射光，并將其轉換為電信號； 導出設備，其通過從在上述受光設備中變換的電信號獲得的上述混合液的透射率而導出上述樣品中上述生理活性物質的濃度。本發明中，將使LAL中的酶組失活得到的凝固蛋白原原料結合或吸附于微粒上所得到的結合凝固蛋白原的微珠、未經加熱處理的LAL和含有規定生理活性物質的樣品混合，加入混合液保持設備中。然后，通過攪拌設備攪拌該混合液，由此促進被規定生理活性物質激活的凝固酶導致的凝固蛋白原的水解、以及由水解得到的凝固素所導致的微粒的締
I=I ο
然后，測定由光入射設備入射的光中透過上述混合液到達受光元件的光強度。在導出設備中，進一步由上述混合液的透射率導出規定生理活性物質的濃度。這里，結合或吸附于微粒上的凝固蛋白原的水解進展、生成凝固素時，凝固素使微粒之間締合，早期生成更大的凝集塊。這里，結合凝固蛋白原的微珠、未經加熱處理的LAL 和含有規定生理活性物質的樣品的混合液在混合時，大量微珠的微粒分散，因此產生強烈的混濁。然后，由于生成凝固素而使微粒的締合進展時，微粒的濃度急劇減少，因此混合液的透射率急劇升高。本發明中的攪拌比濁測定裝置與有關通常的比濁法的測定裝置不同，其測定伴隨著凝固素生成的微粒的締合導致的透射率急劇升高，因此，與攪拌混合液帶來的反應促進效果相聯合，可以大幅縮短測定時間，同時可以非常高靈敏度地進行規定生理活性物質的測定。對于解決上述本發明的課題的設備，其可以盡可能地組合使用。在本發明中，可以獲得保持LAL試劑、或者被來自生物的生理活性物質污染的LAL 試劑等中的凝固蛋白原的功能，同時使凝固酶活性不可逆地失活，并且可用于試劑的凝固蛋白原原料。


圖1是表示本發明的實施例中的LAL試劑水溶液的加熱溫度與殘留凝固酶比活性的關系的圖。圖2是表示本發明的實施例中的LAL試劑冷凍干燥物的加熱時間與殘留凝固酶比活性的關系的圖。圖3是表示本發明的實施例中比濁測量裝置的概略構成的圖。圖4是用于說明活性凝固酶導致凝固蛋白原的凝膠化 凝集過程和結合凝固蛋白原的微珠的凝集過程的圖。圖5是對結合凝固蛋白原的微珠法和比濁法中的內毒素用量反應進行比較的圖。圖6是用于對通過內毒素或β -D-葡聚糖使LAL凝膠化的過程及其檢測方法進行說明的概略圖。
具體實施例方式
已對LAL與內毒素反應生成凝膠的過程進行了詳細研究。即，如圖6所示，內毒素與LAL 中的絲氨酸蛋白酶C因子結合時，C因子被激活，形成活性C因子，活性C因子水解LAL中的其它絲氨酸蛋白酶B因子，使其激活，形成活性B因子。該活性B因子立即水解LAL中的凝固酶前體，形成凝固酶，并且，該凝固酶水解LAL中的凝固蛋白原，生成凝固素。然后，生成的凝固素互相締合，進一步生成不溶性的凝膠，認為全部LAL牽涉在其中，形成凝膠化。另外同樣地，β -D-葡聚糖與LAL中的G因子結合時，G因子被激活，形成活性G因子，活性G因子水解LAL中的凝固酶前體，形成凝固酶。結果，與內毒素同LAL的反應同樣， 生成凝固素，生成的凝固素互相締合，進一步生成不溶性的凝膠。該一系列反應與在哺乳動物中見到的克里斯馬斯(Christmas)因子、凝血酶等絲氨酸蛋白酶介導的纖維蛋白凝膠生成過程類似。這種酶級聯反應是即使是極少量的激活因子也會引起之后的級聯連鎖活化，因此具有非常強的擴增作用。因此，根據使用LAL的規定生理活性物質的測定法，可以檢測出亞皮克/mL級的極微量的規定生理活性物質。
可以定量規定生理活性物質的測定方法如上所述，可舉出比濁法、以及激光散射顆粒測量法。關于這些測定方法，前者是以樣品的濁度、后者是以系統內生成的凝膠微粒來檢測由該LAL的酶級聯反應生成的凝固素的締合物，可進行高靈敏度的測定。特別是在激光散射顆粒測量法中，由于直接測定在系統內生成的凝膠的微粒，因此比比濁法靈敏度更高，并且由于通常是強制性攪拌含有LAL和分析物的樣品，因此與比濁法比較可在短時間內檢測出凝膠的生成。另外，內毒素的其它測定方法有比色法。如圖6所示，其為下述方法雖然利用LAL 的酶級聯反應，但并不測定凝固素凝膠導致的樣品的濁度，而是利用因凝固酶而受到水解而顯色的合成底物，使含有合成底物的LAL與分析物反應，測定其吸光度變化。在該比色法中，測定在系統內生成的顯色物質的濃度，因此與測定樣品中的凝膠生成的比濁法、激光散射顆粒測量法比較，可以在短時間內測定低濃度的規定生理活性物質。在制造用于按照上述各測定方法測定內毒素、β -D-葡聚糖的LAL試劑的過程中， 如果混入了內毒素或β -D-葡聚糖，則根據混入的物質的量，在試劑制造中存在原料發生了凝膠化而無法作為試劑使用的情況。此時的混入量即使是微量，也如上所述，由于LAL試劑具有酶的級聯產生的擴增作用，因此，在試劑的制備需要較長時間的情況下，可能全體試劑發生凝膠化。關于內毒素，已知存在多粘菌素B、聚賴氨酸等的吸附物質，通過將所述吸附物質應用于LAL試劑可以除去混入的內毒素。但是，已經激活的C因子、B因子、以及凝固酶在酶級聯的最下游的水解凝固蛋白原的方向上持續作用，因此，只除去內毒素無法防止LAL試劑的凝膠化。這對于β-D-葡聚糖也是同樣的。以下示出即使極微量混入內毒素或β-D-葡聚糖，也可以抑制在制造中發生凝膠化的LAL試劑、或者以LAL試劑為材料的凝固蛋白原原料的制造方法的例子。但是，本發明的LAL試劑和凝固蛋白原原料的制造方法并不限于以下的例子。有關本發明的凝固蛋白原原料的材料可以使用鱟的血細胞提取物、使用該提取物制造的LAL試劑、以及在它們之中有極微量的內毒素或β -D-葡聚糖混入因此無法作為試劑使用的廢棄物等。但是，本發明的目的在于制造具有功能的凝固蛋白原原料，因此，已經有大多數凝固蛋白原成為凝固素、已經凝膠化的物質除外。對于這些材料，可根據需要添加吸附內毒素的物質、吸附β-D-葡聚糖的物質、使內毒素的作用失活的物質、使β-D-葡聚糖的作用失活的物質的至少一種以上。吸附內毒素的物質可例舉多粘菌素B、聚賴氨酸、聚鳥氨酸、聚乙烯亞胺等，或者 C因子本身或含有C因子結合內毒素的部位的蛋白質、多肽、結合內毒素的抗體等。使內毒素失活的物質可例舉含有鐵離子、鋁離子、鉻離子、鎳離子、鈷離子、錳離子的水溶液，以及供給它們的金屬片等。同樣，與β-D-葡聚糖結合的物質可例舉凝集素、或G因子本身或含有G因子結合β-D-葡聚糖的部位的蛋白質、多肽、結合β-D-葡聚糖的抗體等。另外，為了使β-D-葡聚糖失活，考慮通過降低材料的氫離子濃度而使β -D-葡聚糖的溶解性降低并析出。接著，對于如此地根據需要混合了最適當的添加物的材料進行加熱處理。通過以適當的加熱溫度、加熱時間進行該加熱處理，使材料中規定的酶組C因子、活性C因子、B因子、活性B因子、G因子、活性G因子、凝固酶前體、凝固酶的至少一部分不可逆地失活。并且，不會通過與內毒素、β-D-葡聚糖的反應而生成凝固酶。這樣，即使被內毒素、β-D-葡聚糖污染，也可以獲得不被水解形成凝固素而發生凝膠化的凝固蛋白原原料。這種情況的加熱處理可根據材料的狀態適當調節加熱溫度和加熱時間。例如在材料為溶液的情況下，反應的溫度優選40°C以上且140°C以下，進一步優選60°C以上且100°C 以下。優選的加熱時間根據加熱溫度而有很大不同，優選30秒以上且72小時以下，進一步優選10分鐘以上且8小時以下。過于提高加熱溫度或過于延長加熱時間時，LAL試劑或者LAL中的蛋白質變性，發生白濁，可能難以在測定樣品的濁度的方法中使用，并且凝固蛋白原可能變性，喪失功能， 因此需要注意這些問題。另一方面，在材料為已經形成冷凍干燥物的LAL試劑的情況下，與材料為溶液的情況不同，更高的加熱溫度和更長的加熱時間是必須的。加熱溫度優選80°C以上且300°C 以下，進一步優選100°C以上且250°C以下。優選的加熱時間與水溶液的情況同樣地根據加熱溫度而不同，優選30秒以上且72小時以下，進一步優選10分鐘以上且8小時以下。對于這樣的加熱處理的材料，可根據需要，用各種金屬鹽或銨鹽、酸、堿、進一步地緩沖液等調節PH，還可以根據需要添加表面活性劑、糖類等。這樣制造的凝固蛋白原原料即使與內毒素、β-D-葡聚糖直接作用，也不會引發凝膠化或凝集反應。但是，與激活的凝固酶作用或者與未經加熱處理的LAL試劑混合后與內毒素、β -D-葡聚糖作用時，其可以迅速地水解為凝固素，引發凝膠化或凝集反應。另外，通過本發明制造的凝固蛋白原原料可在內毒素、β-D-葡聚糖的測定靈敏度提高、測定時間縮短、測定方便性提高等方面起作用。即，通過將本發明的凝固蛋白原原料與未經加熱處理的LAL試劑混合，可以制備凝固蛋白原的濃度比通常高的LAL試劑。通過使內毒素、β -D-葡聚糖與該LAL試劑作用，可以更迅速地進行高靈敏度的測定。另外，例如通過制備在將根據本發明的凝固蛋白原原料結合或吸附于聚苯乙烯膠乳的微小顆粒表面的狀態下的LAL試劑，可實現比以往的利用比濁法的內毒素測定更大幅度地縮短時間的測定方法。S卩，使被內毒素、β-D-葡聚糖激活的凝固酶與將凝固蛋白原原料結合或吸附于聚苯乙烯膠乳的微粒(以下也稱為珠)的表面所得的LAL試劑作用時，凝固蛋白原由于酶級聯而水解，成為凝固素，它們使微粒之間締合。因此，通過將由本發明獲得的凝固蛋白原原料中的凝固蛋白原結合或吸附于微粒，可以更高效率地使微粒之間締合，可以更早期地生成凝集塊。在將本發明的凝固蛋白原原料中的凝固蛋白原與珠結合時考慮以下方法通過珠所帶有的電荷進行吸附的方法；利用珠的離子性質的方法；在珠表面形成可與凝固蛋白原原料中的蛋白質反應的官能團，利用該官能基團和蛋白質中的氨基或羧基進行化學結合的方法等，并且可以采用任何方法。以往，在改變LAL的材料、這樣進行結合或吸附于珠上的操作時，制造所需的時間需要數小時以上的較長時間，因此，微量混入其它材料中的內毒素、β-D-葡聚糖產生影響， 或者這些生理活性物質在操作中微量混入，導致原料凝膠化，在這種情況下存在無法獲得目標物質的情況。為此，以往考慮了對原料添加各種酶抑制劑的對策。該酶抑制劑可例舉氟磷酸二異丙酯、芐脒、苯基甲磺酰氟、4- (2-氨基乙基)-苯磺酰氟、6-脒基-2-萘基-4-胍基苯甲酸酯二甲磺酸鹽、對脒基苯基甲磺酰氟、抑酶肽、抗蛋白酶、亮抑蛋白酶肽、大腸桿菌素、PPACK (苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-氯甲酮)、α 2-巨球蛋白、胰蛋白酶抑制劑等。但是，在使用本發明的凝固蛋白原原料的情況下，只有LAL中的酶功能不可逆地失活，同時保持凝固蛋白原活性。因此，無需添加上述酶抑制劑，即可防止在結合或吸附于珠的操作中混入材料中的內毒素、β -D-葡聚糖導致的原料的凝膠化。以下對于本發明的凝固蛋白原原料的制造方法進行詳細說明。制造例給出制造方法的一個例子，有關本發明的制造方法并不限于以下制造例的條件。[制造例1]
在LAL試劑的冷凍干燥物A A 7 ES-II * > 7 A歹ζ卜7 ^ —，和光純藥制造，以下簡稱為ES-II)中加入規定量(0. 15 mL)的注射用蒸餾水(大塚制藥制造)，用旋渦混合器混合。然后設置于預先加熱至規定溫度(后述)的鋁塊加熱器(HDB-1N，>制造， 以下如無特別說明，使用這種機器作為鋁塊加熱器)中，進行規定時間(后述)的加熱。加熱后立即在冰中冷卻，得到凝固蛋白原原料的水溶液。[制造例2]
將LAL試劑(ES-II)的冷凍干燥物直接設置于預先加熱至120度的鋁塊加熱器中，進行規定時間(后述)的加熱。加熱后立即在冰中冷卻，得到凝固蛋白原原料的冷凍干燥物。[制造例3]
使用可進行內毒素定量的激光散射顆粒測量法，對于制造例1以及制造例2中所得的凝固蛋白原原料的酶活性不可逆失活和凝固蛋白原功能的保持進行評價。在激光散射顆粒測量法中，使用內部存在用于攪拌樣品的不銹鋼制攪拌子(Φ1 mm，長度5 mm)的Φ7 mm、 長度50 mm的專用玻璃容器。為了使該容器中不含內毒素，用鋁箔覆蓋容器的開口部，進一步將各20個用鋁箔分包的容器裝入鐵制干燥熱處理罐中，在250°C下加熱處理3小時，使內毒素熱分解。這樣，通過干熱處理制造不含內毒素的測定容器并用于試驗。[制造例4]
為了研究根據本發明的凝固蛋白原原料的凝固蛋白原功能、即，研究凝固蛋白原是否被激活的凝固酶水解并凝膠化，或者是否顯示凝集反應，如下得到凝固酶的激活物。即，使 200 μ L 1.0 EU/mL濃度的內毒素水溶液與未經加熱處理的LAL試劑(ES-II)作用，將LAL 試劑和內毒素水溶液的混合物轉移至根據制造例3制造的測定容器中，在37°C下一邊保溫一邊用在容器底面方向配置了容器內部的不銹鋼攪拌子的攪拌器使其旋轉，進行反應。在激光散射顆粒測量法中，已知通過內毒素凝膠化的LAL試劑由于攪拌而作為微小的凝集塊出現，該凝集塊的出現時間與樣品中內毒素的濃度在雙對數圖上形成直線。在該條件下，在約6分鐘檢測出凝集，檢測出凝集后繼續攪拌，自測定開始20分鐘的時間點， 從裝置中取出容器，將容器內部的凝膠凝集物全部回收，轉移至無內毒素的一次性離心管中，以15000 rpm (轉子半徑7 cm)離心2分鐘，使凝固素聚合物為主成分的凝膠成分沉淀。 通過其它方法確認了離心上清中不含有凝固蛋白原。通過該制造方法，可制備通過內毒素激活的凝固酶。[制造例5]
向LAL試劑(ES-II)中加入0.2 mL規定濃度(后述)的內毒素水溶液，用旋渦混合器混合，然后設置于預先加熱至100°C的鋁塊加熱器上，進行20分鐘的加熱。加熱后立即在冰中冷卻，得到混入了內毒素的凝固蛋白原原料的水溶液。[制造例6]
將0. 5mL表面被羧基化的聚苯乙烯膠乳微粒(Polybeads羧基化微球，0. 45 μ m，固形成分2. 63%，Polysciences Inc.制造，以下簡稱為羧基珠)的懸浮液用無內毒素的帶旋蓋的離心管(容量0.2 mL)、以15000 rpm離心5分鐘，除去上清，接著加入注射用蒸餾水，制成2.0 mL，使其懸浮后再次離心，除去上清。再次通過該離心操作除去上清，然后再懸浮于 1 mL注射用蒸餾水中，其后再轉移至無內毒素的帶旋蓋離心管(容量15 mL)。進一步加入 4 mL的注射用蒸餾水，然后實施高壓滅菌(121°C，20分鐘)，使混入珠中的內毒素失活以及除去。將高壓滅菌后的羧基珠轉移至2 mL容量的帶旋蓋離心管中，按照上述方法將組合了離心和除去上清、進一步在注射用蒸餾水中再懸浮的洗滌操作共進行2次。接著用注射用蒸餾水溶解，在10 mL制備為20 mg/mL濃度的水溶性碳二亞胺(WSC，同仁化學制造) 水溶液中混合2 mL 0. 1 M乙酸緩沖液(pH 4. 98)，將其通過孔徑Φ0. 2 μ m的滅菌用濾器 ($ V 制造)，使上述羧基珠的沉淀物再懸浮于其中的0.5 mL中。另外，向LAL試劑(ES-II)的冷凍干燥物中加入0. 5 mL注射用蒸餾水(大塚制藥制造)進行溶解，在60°C下進行10分鐘的加熱。將0. 5 mL由該加熱處理得到的本發明的凝固蛋白原原料和0. 5 mL按照上述方法制備的羧基珠懸浮液、以及10 μ L制備為1. 0%的非離子表面活性劑TritonX-IOO水溶液(用注射用蒸餾水制備后，用孔徑Φ0. 2 μ m的滅菌用濾器過濾)混合，在室溫下反應2小時。通過該反應，羧基珠的羧基被碳二亞胺激活，然后與凝固蛋白原的氨基發生酰胺鍵合，在珠表面化學鍵合凝固蛋白原。反應后，如上所述離心、除去上清、用注射用蒸餾水再懸浮2次來洗滌反應物。接著加入100 μ L 0.25 M的氨基乙醇水溶液(用注射用蒸餾水制備后，用孔徑Φ 0.2 μ m的滅菌用濾器過濾)，在室溫下攪拌20分鐘，使羧基珠上的被激活的羧基中未反應的部分失活。然后，同樣用注射用蒸餾水共洗滌3次，再懸浮于5 mL的注射用蒸餾水中，將上述1. 0%的TritonX-IOO水溶液與1的疊氮化鈉水溶液(用注射用蒸餾水制備，然后用孔徑Φ0.2 μ m的滅菌用濾器過濾)各加入50 μ L，得到結合凝固蛋白原的微珠。以下對本發明的實施例進行說明。[實施例1]
在制造例ι中，將鋁塊加熱器的指示溫度設為4o°c、5o°c、6(rc、7(rc、8(rc、io(rc以及 120°C的任一條件，使加熱時間為10分鐘，由所制造的凝固蛋白原原料中取出100 yL，加入到制造例3中制造的測定容器中。向其中加入100 μ L 2.0 EU/mL濃度的內毒素水溶液使其作用，用激光散射顆粒測量裝置(PA-200，興和制造，以下簡稱為PA-200)進行測定。由未經加熱處理時的測定濃度(C=l. 0 EU/mL)和加熱的LAL試劑中的測定濃度(S)，按照下式定義和導出加熱后殘留的酶活性、即殘留凝固酶比活性(A)。A=S/CX100(%)(1)
圖1表示所得殘留凝固酶比活性㈧與LAL試劑水溶液的加熱溫度的關系。如圖1所示可知，在加熱時間為10分鐘的情況下，加熱溫度達到60°C以上，則酶活性完全消失。另外，雖然未圖示，但可觀察到加熱溫度越高則制造后凝固蛋白原原料的水溶液發生白濁現象。例如，在120°C下加熱制造凝固蛋白原原料水溶液的情況下，有很大一部分由于熱變性而變為可見的白濁和不溶物，判定其不適合實際應用。[實施例2]
在制造例ι中，將鋁塊加熱器的指示溫度設為4o°c、5o°c、6(rc、7(rc、8(rc、io(rc和 120°C中的任一條件，使加熱時間為10分鐘，在所制造的凝固蛋白原原料(150 μ L)中加入 50 μ L制造例4中得到的激活的凝固酶水溶液并使其作用，用旋渦混合器混合5秒鐘。將該樣品轉移至制造例3中制造的測定容器中，用激光散射顆粒測量裝置(ΡΑ-200)進行凝集開始時間的測定。表1中示出了各加熱溫度下的凝集開始時間，其示出在任一加熱溫度下在從添加激活的凝固酶水溶液起3分鐘左右開始聚集，凝固蛋白原的功能幾乎未受加熱的影響。另外，在120°C的高溫下處理時，LAL試劑中的大部分蛋白質發生熱變性而凝固，但殘留在其中的凝固蛋白原本身保持功能，自添加激活的凝固酶水溶液起4分鐘左右開始凝集。由此顯示凝固蛋白原對于加熱的耐性非常強。另外，由表1可知，在80°C以下對LAL試劑進行加熱處理使酶活性失活時，LAL試劑中幾乎未見到白濁。因此可知，通過在80°C以下對LAL 試劑進行加熱處理使酶活性失活，可以獲得適合光學測定的、利用價值更高的凝固蛋白原原料。[表 1]。
權利要求
1.凝固蛋白原原料的制造方法，所述凝固蛋白原原料在下述情況下使用使含有規定的酶組和凝固蛋白原的鱟的血細胞提取物LAL與來自生物的規定的生理活性物質反應，通過所述生理活性物質激活所述酶組，發生酶級聯，通過所述酶級聯將凝固蛋白原水解為凝固素，利用這一過程檢測所述生理活性物質或測定所述生理活性物質的濃度；所述凝固蛋白原原料的制造方法的特征在于將LAL以規定溫度加熱處理規定時間，從而使所述LAL中的所述酶組的至少一部分失活，同時保持凝固蛋白原的活性。
2.權利要求1的凝固蛋白原原料的制造方法，其特征在于所述LAL是以溶液的形式供給的，所述規定溫度為60°C以上。
3.權利要求1或2的凝固蛋白原原料的制造方法，其特征在于所述LAL是以溶液的形式供給的，所述規定溫度為80°C以下。
4.權利要求1-3中任一項的凝固蛋白原原料的制造方法，其特征在于所述LAL是以溶液的形式供給的，所述規定時間為10分鐘以上且8小時以下。
5.權利要求1的凝固蛋白原原料的制造方法，其特征在于所述LAL是以冷凍干燥物的形式供給的，所述規定溫度為100°c以上且250°C以下。
6.權利要求1或5的凝固蛋白原原料的制造方法，其特征在于所述LAL是以冷凍干燥物的形式供給的，所述規定時間為300分鐘以上。
7.凝固蛋白原原料，所述凝固蛋白原原料在下述情況下使用使含有規定的酶組和凝固蛋白原的鱟的血細胞提取物LAL與來自生物的規定的生理活性物質反應，通過所述生理活性物質激活所述酶組，發生酶級聯，通過所述酶級聯將凝固蛋白原水解為凝固素，利用這一過程檢測所述生理活性物質或測定所述生理活性物質的濃度；所述凝固蛋白原原料的特征在于將LAL以規定溫度加熱處理規定時間，從而使所述LAL中的所述酶組的至少一部分失活。
8.權利要求7的凝固蛋白原原料，其特征在于所述LAL是以溶液的形式供給的，所述規定溫度為60°C以上。
9.權利要求7或8的凝固蛋白原原料，其特征在于所述LAL是以溶液的形式供給的， 所述規定溫度為80°C以下。
10.權利要求7-9中任一項的凝固蛋白原原料，其特征在于所述LAL是以溶液的形式供給的，所述規定時間為10分鐘以上且8小時以下。
11.權利要求7的凝固蛋白原原料，其特征在于所述LAL是以冷凍干燥物的形式供給的，所述規定溫度為100°C以上且250°C以下。
12.權利要求7或11的凝固蛋白原原料，其特征在于所述LAL是以冷凍干燥物的形式供給的，所述規定時間為300分鐘以上。
13.LAL試劑，所述試劑用于生理活性物質的檢測或者生理活性物質的濃度測定，其特征在于通過將權利要求7-12中任一項的凝固蛋白原原料與未經加熱處理的LAL混合，使所述未經加熱處理的LAL中的凝固蛋白原濃度提高。
14.用于測定內毒素的結合凝固蛋白原的微珠，其特征在于使權利要求7-12中任一項的凝固蛋白原原料中的凝固蛋白原與比所述凝固蛋白原直徑大的多個微粒表面結合或吸附來制備。
15.來自生物的生理活性物質的測定方法，其特征在于將權利要求13的LAL試劑和含有所述規定生理活性物質的樣品混合，由此通過所述規定的生理活性物質將所述LAL試劑中的酶組激活，發生酶級聯，通過所述酶級聯將濃度得到提高的所述凝固蛋白原水解為凝固素，利用這一過程檢測所述規定的生理活性物質或者測定所述規定的生理活性物質的濃度。
16.來自生物的生理活性物質的測定方法，其特征在于將權利要求14的結合凝固蛋白原的微珠、未經加熱處理的LAL和含有規定生理活性物質的樣品混合，由此，通過所述規定的生理活性物質將所述未經加熱處理的LAL中的酶組激活，發生酶級聯，通過所述酶級聯將結合或吸附于所述微粒表面的凝固蛋白原水解為凝固素，所述微粒之間交聯，利用這一過程檢測所述規定的生理活性物質或測定所述規定的生理活性物質的濃度。
17.攪拌比濁測定裝置，其特征在于，所述裝置裝備有以下設備混合液保持設備，其使權利要求14的結合凝固蛋白原的微珠、未經加熱處理的LAL和含有規定的生理活性物質的樣品的混合液保持可以入射光，并使所述混合液中的反應進行；攪拌設備，其攪拌所述混合液保持設備中的所述混合液；光入射設備，其向所述混合液保持設備中的混合液入射光；受光設備，其接收所述入射光在所述混合液中的透射光，并將其轉換為電信號；導出設備，其通過從在所述受光設備中變換的電信號獲得的所述混合液的透射率而導出所述樣品中所述生理活性物質的濃度。
全文摘要
本發明提供獲得保持LAL試劑、或者被來自生物的生理活性物質污染的LAL試劑等中的凝固蛋白原的功能，同時使凝固酶活性不可逆地失活，并且可用于試劑的凝固蛋白原原料的技術。通過將LAL試劑在某些規定溫度下加熱處理規定時間，只使LAL試劑中的酶活性不可逆地失活。此時，凝固蛋白原本來的活性得以保持，即，通過激活的凝固酶水解形成凝固素，引發凝膠化、凝集反應。
文檔編號C12M1/34GK102326082SQ201080008580
公開日2012年1月18日 申請日期2010年2月19日 優先權日2009年2月19日
發明者藪崎克己 申請人:興和株式會社