專利名稱：來自完全以母乳喂養的嬰兒糞便的具有益生活性的菌株的分離、鑒定和表征的制作方法
技術領域：
本研究的一般目的是分離益生微生物以后續用于食品和制藥工業，特別是將其用于幼兒配方奶中。所述微生物對PH、膽汁鹽具有高度抗性并具有高度腸細胞粘附，因此它們特別適用于前述工業中。
背景技術：
近幾十年來，營養學已經得到了極大的發展，并且所述發展已改變了營養學的概念。以前認為膳食具有提供維持健康狀況所必需的營養物的作用，而現在，這一概念已經發展為以下看法膳食可以含有除了提供營養之外的促進健康的食品。這是食品工業開始開發大量促進健康的產品的原因。在這個領域，功能性食品的方面已有了極大的發展，其中人群對益生菌的食用每天都在增加。實際的挑戰是擴大對這些食品的了解，在這些食品中含有益生菌的那些食品得到特別的關注。存在非常古老的記錄涉及來自食用具有高細菌含量的食品的有益效果，例如在舊約中，其中提及亞伯拉罕將其長壽的原因歸結于食用奶，或者在公元前76年，羅馬歷史學家Plinius推薦使用發酵奶來治療腸胃炎(knmier和De Vrese，2001年)。在上個世紀最初，俄國微生物學家Elie Metchnikoff (1845年-1916年)建議食用發酵奶調節腸微生物群，從而對人體健康產生積極作用(Metchnikoff，1908年)。他關注于下述事實保加利亞百歲老人的人數令人難以置信，盡管這是最為貧窮的歐洲國家之一。 他觀察到保加利亞人大量食用酸奶。Metchnikoff成功地分離了產生酸奶的細菌，并將其用于他的研究中。這是益生研究的開始。Metchnikoff成為下述概念的堅定支持者膳食可以保護人體免受病原侵入，并因此改善和延長生命的質量。他還是開發膠囊形式的乳酸菌制劑用于口服的第一人，該制劑稱為乳桿菌素。同時，法國微生物學家Tissier觀察到，母乳喂養的新生兒的糞便微生物群比接受人造奶的兒童的糞便微生物群具有更多的雙歧桿菌屬的細菌，并且認識到這種微生物的有益作用。之后在1940年，雙歧奶顯示在第一次世界大戰期間減輕兒童的營養不良。1950 年，Degusta廠制備了 Biogur和Bio-garde。1989年，在瑞士，發酵奶的食用和產量提高。 1993年，兩位研究者Modler和Vila-Garcia開發了第一種低酸度生物酸奶。1965年，Lilly和Millwell首次將術語“益生菌”用于命名胃發酵的產物。但是益生菌的更為有效和廣泛使用的定義是在很長時間以后由Fuller說明的(Fuller，1992 年；Fuller，1989年)。益生菌定義為“經加入到食品中的活微生物的補充對接受者的健康起有益效果，因為它們調節他/她腸道微生物平衡的改善”。對于成年人，這包括來自發酵奶和用這些細菌凍干的制劑二者。1998年，位于布魯塞爾的國際生命科學會(International Life Science Institute, ILSI)將益生菌定義為活微生物，當其以足夠量攝入時，對健康具有有益效果，該效果大于常規營養效果。它們有益地影響生物體的一個或多個功能。它們提供更好的健康狀況，和/或降低疾病風險。它們可以對一般人群或其特殊群體具有功能。目前存在益生微生物的定義的標準1.它們是人來源的。2.它們具有非病原的性質。3.它們對技術方法的破壞具有抗性。4.它們對胃酸和膽汁的破壞具有抗性。5.它們粘附于腸上皮。6.它們能夠在胃腸道定殖。7.它們產生抗微生物物質。8.它們調節免疫響應。9.它們影響人代謝活性(膽固醇吸收、維生素產生等)益生細菌可以影響所有的腸細胞和這些細胞的作用機制，包括對微生物群的作用 (Backhed 和 Ley，2005 年)、免疫功能的調節(Picard 等人，2004 年；KalIiomaki，2004 年) 和上皮屏障功能的提高(Madsen等人，2001年；Isolauri & Salminen, 2005年)。在具有益生活性的細菌中，來自雙歧桿菌屬的那些細菌在腸中最為豐富，為成人結腸細菌的25%，母乳喂養的新生兒中的95%。目前有很多食品(酸奶和奶)補充了這種類型的細菌。根據抑制其它厭氧細菌(例如梭菌屬、類桿菌屬、雙歧桿菌屬、假單胞菌、葡萄菌屬、鏈球菌屬和腸桿菌科)的附著的“體外”研究，同樣具有益生活性的其它菌株為來自乳桿菌屬的那些細菌(Silva等人，1987年)。在一些病理學中采用益生菌作為醫學手段已得到了廣泛認可，并且其效果的證據確鑿，主要是對于以下的臨床研究和元分析(meta-analysis)的結果乳糖吸收不良 (Adolfsson等人，2004年；Piaia等人，2003年)、胃腸道感染(Brownlee等人，2003年)和與使用抗生素有關的腹瀉(D' Souza等人，2002年)。此外，已顯示使用益生細菌雙歧桿菌、乳桿菌和/或二者的混合物對一些消化性疾病具有有益效果。在文獻中存在很多有益效果方面的證據。對腸道微生物群的成分之間的關系以及與宿主的相互作用的理解是非常復雜的。 基因組有助于分析對腸道條件響應的經分離的細菌，從而部分揭示了菌株的代謝能力，但是，其中可以表達這些能力的條件以及得以分離形成腸道微生物群的絕大多數菌株的條件在很大程度上仍然是未知的，只能通過部分或全部鑒定它們的基因組的分子工具來進行鑒定。由于此原因，益生菌和功能食品領域的發展為全面的發展。因此，考慮到益生菌株之間存在不同作用并且屬于相同種的菌株種類可能具有不同生理特性，而不同生理特性又使它們具有抗其它細菌的不同或改善的益生性質，因此鑒于它們的健康和工業益處，對新益生菌株的作用的鑒定和表征是非常重要的。本研究的一般目的是分離益生微生物以后續用于食品和制藥工業，特別是將其用于幼兒配方奶中，所述益生微生物具有改善的益生性質、對酸性PH的抗性、對膽汁鹽的抗性和腸細胞粘附。本發明提供和表征了分離自完全以母乳喂養的兒童的糞便的益生微生物。隨著本發明的目標菌株通過胃和腸道，其對pH和膽汁鹽的更大抗性使得所述益生微生物具有更大的存活能力，并因此提高它們的定殖作用，也因此提高它們抗其它潛在病原細菌的拮抗作用。另一方面，構成本發明目標的益生菌株對人體腸道細胞的更大粘附性可以實現對所有免疫系統調節的更大作用。

發明內容
本發明提供了分離自完全以母乳喂養的兒童的糞便的益生微生物。由于所述微生物的益生性質，而所述益生性質對攝入它們的那些人健康具有有益作用，所述微生物用于食品或制藥工業中，特別是用于幼兒配方奶中。為分離所述益生微生物，本發明提出了下述具體目標a)分離獲自完全以母乳喂養的兒童的糞便的乳酸細菌菌株；b)評估對pH和膽汁鹽的抗性；和c)評估對腸上皮細胞的粘附性。通常在嬰兒的糞便中尋找益生細菌。此外，存在某些慣例，推薦益生菌必須是人來源的，據信其原因在于它們能更好地植入人體腸道中。然而，很多分離的菌株并不滿足益生條件，因為它們很少或根本不對消化液具有抗性，并且它們中的一些并不粘附于腸上皮。在本發明中，選擇完全以母乳喂養的嬰兒，以確保分離的細菌不是商業細菌。此外，已顯示以母乳喂養的嬰兒的腸道微生物群非常富含雙歧桿菌和乳桿菌。涉及益生菌，必須通過下述表征有效的益生菌1.其對宿主具有有益作用的能力，例如對疾病的抗性。2.其不造成病原性或毒性。3.其經通過胃腸道的存活能力。例如對胃酸和膽汁酸的抗性。4.其保持粘附于腸壁細胞的能力。5.其短且穩定的生成時間和其在儲存條件下長時間保持存活的能力。6.其是人來源的。7.其產生抗病原的抗微生物物質、抗腫瘤性質。8.其影響代謝活性的能力。與益生攝入有關的健康益處包括1.減輕源自乳糖吸收不良的癥狀。2.提高對腸道感染性疾病的天然抗性。3.降低血清膽固醇濃度。4.改善消化。5.刺激胃腸免疫力。6.發展對食物抗原的免疫耐受和降低過敏風險。因此，本發明涉及分離自嬰兒糞便的新的益生微生物。具體而言，本發明涉及鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)HERO 22A(CNCM 1-4036)、副干酪乳桿菌 (Lactobacillus paracasei) HERO 7 (CNCM 1-4034)和短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)HERO 15B(CNCM 1-4035)微生物。所述微生物具有抗相同種的微生物的改善的益生性質。制劑涉及一種或數種成分的組合物或組，即存在于復雜物質(食品或劑型等)中的成分的類別和數量以及它們存在的比例。
“載體”理解為允許本發明的菌株生長、運輸和/或施用的任何類型的物質。取決于所述菌株意指的目的和/或用途，“載體”可具有不同的性質。本發明涉及藥學上可接受的“載體”例如通常與膠囊、片劑或粉末相關的那些載體，以及由成分或食品形成的“載體”。意指用于特殊膳食的食品為這樣的食品S卩，由于它們的特定組成或制備它們的特定方法，所述食品與基本食品具有明顯區別，其適用于所指出的營養目標且銷售時指明它們實現所述目標。(1989年5月3日的歐盟指令89/398/EEC，其涉及近似于成員國對要用于特殊膳食的食品的法律(6月30日的DO series L no. 186))。特殊膳食理解為必須滿足下述人群的特定營養需要的那種i)具有吸收過程或代謝障礙的確定人群，或ii)處于特定生理狀況且因此從受控地攝入確定食物中獲得特殊益處的確定人群；或iii)健康的嬰兒或幼兒。食品補充劑涉及這樣的食品其目的是補充正常膳食，且由以單獨或組合方式具有營養或生理作用的濃縮的營養源或營養物或其它物質組成，以劑量形式銷售，所述劑量形式即膠囊、丸劑、片劑、錠劑和其它類似形式、粉末囊劑(powder sachet)、液體安瓿、具有點滴器的瓶和必須以小的整體量攝取的液體和粉末的其它類似形式；(歐洲議會和理事會 2002年6月10日的指令2002/46/EC，其涉及近似于成員國在食品補充物質方面的法律)。益生菌涉及對宿主的健康具有有益作用的那些微生物細胞制劑或微生物細胞或微生物細胞的組分。益生元理解為“來自有益于和刺激腸道細菌生長從而改善宿主腸道平衡的膳食的不可消化的成分”。使用的益生元包括菊粉、寡果糖、低聚半乳糖、來自膠質和其他橡膠以及黏液的水解的寡糖、和抗性淀粉和麥芽糊精以及核苷酸。本發明的目的涉及分離自完全以母乳喂養的兒童的糞便的益生微生物菌株， 其特征在于，包括鼠李糖乳桿菌HERO 22A(CNCM 1-4036)或副干酪乳桿菌HERO 7 (CNCM 1-4034)或短雙歧桿菌 HERO 15B (CNCM 1-4035)。在一個具體實施方式
中，所述菌株為鼠李糖乳桿菌HERO 22A(CNCM 1-4036)。在另一個具體實施方式
中，所述菌株為副干酪乳桿菌HERO 7 (CNCM 1-4034)。在另一個具體實施方式
中，所述菌株為短雙歧桿菌HERO 15B(CNCM 1-4035)。在一個實施方式中，上述菌株以純的生物培養物的形式提供。在另一個實施方式中，所述菌株為分離的。在一個實施方式中，上述微生物菌株以活細胞的形式提供；在另一個實施方式中， 所述菌株以非活細胞的形式提供。本發明的另一個目的涉及包含上述微生物菌株的制劑。在一個具體實施方式
中， 所述制劑包含另一種益生物；在另一個實施方式中，其額外地包含益生元物質。在另一個具體實施方式
中，所述制劑包含適于攝入的載體。所述載體為藥學上可接受的，例如通常與膠囊、片劑或粉末相關的那些載體。在另一個具體實施方式
中，所述載體是食品。所述食品選自奶和奶衍生的產品，特別是發酵奶和乳酪；谷類食物和衍生物，包括面包團；湯和其他脫水形式的的類似產品；經發酵的肉制品；水果衍生物、果汁和軟飲料；用于特殊營養用途的食品。
本發明的另一個目的涉及益生微生物的菌株或上述用于膳食的制劑。在一個實施方式中，所述膳食涉及幼兒和/或成人和/或特殊膳食。在另一個實施方式中，上述益生微生物的菌株或制劑用于制備幼兒配方奶。在一個具體實施方式
中，所述配方由即食型幼兒奶和/或幼兒谷類食物和/或幼兒食品組成。在另一個實施方式中，上述益生微生物的菌株或制劑用于制備食品補充劑。在另一個實施方式中，上述益生微生物的菌株或制劑用于制備口服和/或腸營養的特殊配方。在另一個實施方式中，上述益生微生物的菌株或制劑用于制藥用途的制劑/可應用為醫藥制品/用于制備藥品。在另一個實施方式中，上述益生微生物的菌株或制劑可應用于刺激免疫系統和/ 或預防/治療哮喘和/或預防/治療胃腸道障礙，和/或消除/調節主要消化性病原，和/ 或預防/治療肥胖及其并存疾病(包括代謝綜合征和糖尿病)和/或衰老相關疾病。所述胃腸道障礙包括腸道運輸變化，例如便秘和礦物質生物利用度變化、感染和吸收不良綜合征。所述吸收不良綜合征包括影響腸道解剖結構的障礙(例如短腸綜合征)和影響腸道生理的障礙(例如胰腺囊性纖維化)、糖(尤其是乳糖)吸收不良、脂質吸收改變、食物過敏、和炎性腸病(例如克羅恩病和潰瘍性結腸炎)。


圖1通過表格示出了與兩種商業化菌株相比，PH對本發明的目標鼠李糖乳桿菌 CNCM 1-4036和副干酪乳桿菌CNCM 1-4034菌株存活的影響。具體而言，所述表格示出了來自下述菌株的PH抗性研究的菌落形成單元存活性的值(％)分離的鼠李糖乳桿菌 22A(CNCM 1-4036)、副干酪乳桿菌7 (CNCM 1-4034)菌株和它們的各商業對照。通過比較在測試的不同PH下存在于對照中的細菌數量和存在的細菌數量，以存活％示出所述值。結果表示為％列中的百分比單位。可以觀察到在PH 3，菌株7和22A的抗性和測試的商業菌株類似或稍高于測試的商業菌株。然而在PH 2，相比在此pH下不存活的其余菌株，菌株22A 具有非常高的存活性。圖2通過表格示出了與兩種商業化菌株相比，膽汁鹽(Oxgall)對本發明的目標鼠李糖乳桿菌CNCM 1-4036和副干酪乳桿菌CNCM 1-4034菌株存活的影響。因此，所述表格示出了來自下述菌株的膽汁鹽抗性研究的存活性的值(％)分離的菌株鼠李糖乳桿菌 22A(CNCM 1-4036)、副干酪乳桿菌7 (CNCM 1-4034)和它們的各商業對照。比較在測試的不同膽汁鹽濃度下存在于對照中的細菌數量與存在的細菌數量，以存活％示出所述值。結果表示為％列中的百分比單位。從所述結果可知，在0. 3%和0. 7%膽汁鹽的濃度下，菌株7 和22A的存活百分比都遠高于測試的商業菌株，是后者的兩倍。兩個菌株都具有高于100% 的存活率，說明它們甚至可以在這些鹽的存在下繁殖。結合它們對PH的高度抗性，表明了所述菌株的高定殖潛力。圖3通過表格示出了與兩種商業化菌株相比，本發明的目標鼠李糖乳桿菌CNCM 1-4036和副干酪乳桿菌CNCM 1-4034菌株對人腸HT-四細胞的粘附。通過來自下述菌株的腸上皮細胞粘附研究的存活性的值示出了所述能力分離的鼠李糖乳桿菌22A(CNCM1-4036)、副干酪乳桿菌7 (CNCM 1-4034)菌株和它們的各商業對照。比較存在于對照中的細菌數量，以粘附細菌％示出所述值。兩種細菌具有的對人腸HT-四細胞的粘附百分比都遠高于測試的商業菌株，這表明了它們在調節腸細胞活性(包括免疫調節)中的潛在作用。圖4通過表格示出了與兩種商業化菌株相比，PH對本發明的目標菌株短雙歧桿菌 CNCM 1-4035存活的影響。通過來自所述菌株相比其各商業對照的pH抗性研究的存活性的值示出了所述影響。通過比較在測試的不同PH下存在于對照中的細菌數量和存在的細菌數量，以存活％示出所述值。結果表示為％列中的百分比單位。可以觀察到在PH 3，菌株 15B的抗性顯著高于測試的其它兩種雙歧桿菌的抗性，其存活性為大于100%，這表明所述細菌甚至可以在該PH下繁殖。圖5通過表格示出了與兩種商業化菌株相比，膽汁鹽(Oxgall)對本發明的目標菌株短雙歧桿菌CNCM 1-4035存活的影響。以下述菌株的膽汁鹽抗性研究的方式示出該影響分離的菌株短雙歧桿菌15B(CNCM 1-4035)和其各商業對照。通過比較在測試的不同膽汁鹽濃度下存在于對照中的細菌數量與存在的細菌數量，以存活％示出所述值。結果表示為％列中的百分比單位。在低濃度膽汁鹽存在下的存活的值類似于另外兩種雙歧桿菌的那些值。然而，在更高的濃度下，菌株15B顯示出更高的存活。圖6通過表格示出了與兩種商業化菌株相比，本發明的目標短雙歧桿菌CNCM 1-4035對人腸HT-四細胞的粘附。通過來自下述菌株的腸上皮細胞粘附研究的存活性的值示出所述能力經分離的菌株短雙歧桿菌15B(CNCM 1-4035)和其各商業對照。比較存在于對照中的細菌數量，以粘附細菌％示出所述值。本發明的目標菌株對人腸HT-四細胞的粘附百分比遠高于測試的商業菌株的粘附百分比，這表明了其在調節腸細胞活性(包括免疫調節)中的潛在作用。圖7示出了與兩種商業化菌株(其對照)相比，本發明的目標菌株短雙歧桿菌 CNCM 1-4035(短雙歧桿菌15B)的酶活性(單位為單位/ml培養基)。結果如實施例11 中所述。獲得的結果使得得到下述結論CNCM 1-4035的發酵活性和來自雙歧桿菌屬的種的發酵活性相符，從而允許將CNCM 1-4035分類為所述屬。圖8示出了與兩種商業化菌株(其對照)相比，本發明的目標鼠李糖乳桿菌CNCM 1-4036(鼠李糖乳桿菌HERO 22A)和副干酪乳桿菌CNCM 1-4034 (副干酪乳桿菌HERO 7)的酶活性。結果如實施例11中所述。獲得的結果使得得到下述結論HERO 7和HERO 22A的發酵活性和來自副干酪乳桿菌屬和鼠李糖乳桿菌屬的種的發酵活性相符，從而允許將CNCM 1-4036和CNCM 1-4034分類為所述各屬和種。圖9 圖9A和9B示出了所選擇的CNCM 1-4034 (副干酪乳桿菌HERO 7)和CNCM 1-4036(鼠李糖乳桿菌HERO 22A)及其對照的碳水化合物和其它底物(API 50CHL)的發酵活性結果。結果如實施例11中所述。獲得的結果使得得到下述結論HERO 7(CNCM 1-4034) 和HERO 22A(CNCM 1-4036)的發酵活性和來自副干酪乳桿菌屬和鼠李糖乳桿菌屬的種的發酵活性相符，從而允許將CNCM 1-4036和CNCM 1-4034分類為所述屬。圖10 圖10AU0B和IOC示出了本發明的益生細菌對單核細胞增生李斯特菌 (L. monocytogenes)CECT 4031和宋內氏志賀氏菌(S. sonnei)CECT 457施加影響的結果。 (A)副干酪乳桿菌CNCM 1-4034生長17個小時后獲得的濃縮10倍的上清液對單核細胞增生李斯特菌CECT 4031施加的影響。(B)短雙歧桿菌CNCM 1-4035生長M小時后獲得的濃縮10倍的上清液對單核細胞增生李斯特菌CECT 4031施加的影響。(C)鼠李糖乳桿菌 CNCM 1-4036生長M小時后獲得的濃縮10倍的上清液對宋內氏志賀氏菌CECT 457施加的影響。圖11示出了培養時間17小時和M小時的和4%中和和未中和的副干酪乳桿菌CNCM 1-4034上清液對細菌傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi) CECT 725、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)CECT 443和鼠傷寒沙門氏菌CECT 4594的抑制作用。(A)培養時間17小時的未中和的副干酪乳桿菌CNCM 1-4034對鼠傷寒沙門氏菌CECT 443的抑制作用。⑶培養時間M小時的未中和的副干酪乳桿菌CNCM 1-4034對細菌鼠傷寒沙門氏菌 CECT 4594的抑制作用。(C)培養時間M小時的未中和的副干酪乳桿菌CNCM 1-4034對細菌傷寒沙門氏菌CECT 725的抑制作用。(D)培養時間M小時的中和的副干酪乳桿菌CNCM 1-4034對細菌傷寒沙門氏菌CECT 725的抑制作用。(E)培養時間17小時的未中和的副干酪乳桿菌CNCM 1-4034對細菌傷寒沙門氏菌CECT 725的抑制作用。圖12示出了培養時間17小時和M小時的和4%中和和未中和的短雙歧桿菌 CNCM 1-4035上清液對細菌傷寒沙門氏菌CECT 725的抑制作用。(A)培養時間17小時的
和4%未中和的短雙歧桿菌CNCM 1-4035上清液對細菌傷寒沙門氏菌CECT 725的抑制作用。(B)培養時間17小時的和4%中和的短雙歧桿菌CNCM 1-4035上清液對細菌傷寒沙門氏菌CECT725的抑制作用。(C)培養時間M小時的和4%未中和的短雙歧桿菌 CNCM 1-4035上清液對細菌傷寒沙門氏菌CECT 725的抑制作用。(D)培養時間M小時的和4%中和的短雙歧桿菌CNCM 1-4035上清液對細菌傷寒沙門氏菌CECT 725的抑制作用。圖13示出了培養時間17小時和M小時的和4%中和和未中和的鼠李糖乳桿菌CNCM 1-4036上清液對細菌傷寒沙門氏菌CECT 725、鼠傷寒沙門氏菌CECT 4594、大腸桿菌ETEC CECT 501、大腸桿菌ETEC CECT 515、大腸桿菌ETEC CECT 7 和大腸桿菌ETEC CECT 742的抑制作用。㈧培養時間17小時的1 %和4%未中和的鼠李糖乳桿菌CNCM 1-4036上清液對細菌傷寒沙門氏菌CECT 725的抑制作用。(B)培養時間M小時的和 4%未中和的鼠李糖乳桿菌CNCM 1-4036上清液對細菌傷寒沙門氏菌CECT 725的抑制作用。(C)培養時間M小時的和4%中和的鼠李糖乳桿菌CNCMI-4036上清液對細菌鼠傷寒沙門氏菌CECT 74594的抑制作用。⑶培養時間17小時的1 %和4%未中和的鼠李糖乳桿菌CNCM 1-4036上清液對細菌大腸桿菌ETEC CECT 501的抑制作用。(E)培養時間M小時的和4%未中和的鼠李糖乳桿菌CNCM 1-4036上清液對細菌大腸桿菌ETEC CECT 501 的抑制作用。(F)培養時間17小時的和4%未中和的鼠李糖乳桿菌CNCM 1-4036上清液對細菌大腸桿菌ETEC CECT 515的抑制作用。(G)培養時間17小時的和4%未中和的鼠李糖乳桿菌CNCM 1-4036上清液對細菌大腸桿菌ETEC CECT 7 的抑制作用。(H)培養時間M小時的和4%中和的鼠李糖乳桿菌CNCM 1-4036上清液對細菌大腸桿菌ETEC CECT 742的抑制作用。圖14示出了本發明的菌株在㈧生長17小時后和⑶生長M小時后1倍濃縮的上清液獲得的病毒Ito、fe和VA70在HT-四細胞系中的感染中心的縮小。
具體實施方式
本發明提供益生微生物，其具有改善的對pH、膽汁鹽的抗性和粘附的益生性質。具體而言，本發明分離和表征了分離自嬰兒糞便的細菌鼠李糖乳桿菌HERO 22A(CNCM 1-4036)、副干酪乳桿菌 HERO 7 (CNCM 1-4034)和短雙歧桿菌 HERO 15B (CNCM 1-4035) 已知有大量和極多種微生物定殖于粘膜表面。成人中，存在的真核細胞要遠多于原核細胞，事實上，估計90%的人體細胞為微生物細胞，而僅10%相當于原核細胞 (Savage, 1977年)。該微生物群體對人體生理的影響可能在腸道中更為明顯，其原因在于下一事實該器官含有這些生物體中的絕大多數。近側小腸和中段小腸中的密度相對較低，但是在遠端小腸中存在顯著的提高，可以達到108CfU/ml腔容量，并且在結腸中高達 10n-1012/g。在生命的最初若干天中，在腸微生物群的組成中存在很大變化。出生時，腸為無菌的，并且在生命的最初若干小時中，細菌開始出現在糞便中。胃腸道首先被母體陰道和糞便細菌叢定殖。定殖在腸道中的微生物為具有該還原能力的那些微生物，包括例如腸細菌、鏈球菌和葡萄球菌的種類。氧被這些細菌消耗，逐漸改變了腸道環境，從而允許包括乳桿菌和雙歧桿菌的厭氧細菌生長。這些定殖于新生兒的細菌主要來自母體和環境，分娩方式是腸道微生物群的主要決定因素之一(Bezirtzoglou，1997年)。腸道生態系統由微生物群、腸上皮、粘膜免疫系統、和腸神經系統之間的相互作用形成(Gordon等人，1997年)。比較正常大鼠和具有無菌腸的大鼠，已經揭示了一系列的解剖、生化和生理差別。例如，微生物群的存在提高上皮交換，其還從膽酸上結合和移除羥基、 代謝膽紅素并將膽固醇還原為糞甾醇。因此，腸和微生物群之間的關系非常密切，并且其可以看作是共生關系，這是因為，例如微生物群可以降解由于缺乏酶促機制而不能被腸降解的碳水化合物。隨著產生短鏈脂肪酸，由該降解產生的產物主要用作腸上皮的營養物。此外，該微生物群的存在具有免疫調節作用，原因在于腸粘膜的主要生理特征為下述能力針對可定殖于腸上皮的入侵病原開始能量響應、并同時對包含于食物中的細菌或針對定居微生物群具有零響應的能力。 此響應缺乏是稱為口服耐受的若干機制的活性過程。此過程是必需的，從而使得宿主不對任何微生物的存在出現炎性響應，并因此可以對不同微生物具有不同響應，從而輔助腸菌群的穩定。這是具有正常組成的微生物群可以輔助宿主的生理、免疫和代謝發展的原因。此生態系統保持平衡，并且任何破壞該平衡的原因可能引發病理(腹瀉、炎性疾病)。重要的是理解該生態系統、非病原菌株或“好菌株”的功能的重要性。在此理念上已開發了作為人體健康介質的益生菌的概念。在不同研究領域中，益生菌對不同情況中基因表達的調節的影響是最令人感興趣的問題之一。如前所述，本發明從完全以母乳喂養的兒童的糞便中分離了具有改善的益生性質的乳酸細菌和雙歧桿菌。為此，評估了所分離細菌的PH抗性、膽汁鹽抗性和腸上皮細胞粘附能力。本發明的基本結果指示，在這些嬰兒的糞便中，存在對胃PH、膽汁鹽具有高度抗性且具有腸上皮細胞粘附能力的細菌，所述細菌可以用作益生菌。為了檢測細菌的益生活性，首先必須將所述細菌進行一系列的體外試驗，所述體外試驗模擬所述細菌將在生物體內經受的條件，它們必須在所述條件下保持存活，并因此保留它們有益健康的性質。在本發明中，和本發明的細菌進行比較以顯示其改善的益生性質而采用的對照細菌(實施例12)為對于雙歧桿菌，為Hero Espana S. Α.提供的兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)和長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)；對于乳桿菌，采用的是2種商業乳桿菌干酪乳桿菌(LactcAacillus casei) (Danone )和鼠李糖乳桿菌 GG (LGG) ( VALI0 )。考慮到構成本發明的細菌在刺激免疫系統和在其對主要消化性病原的作用方面的興趣問題，出于下述原因選擇了這些對照細菌目前它們在世界范圍內以發酵奶和其它劑量形式銷售，并且對它們的益生作用方面、特別是預防兒童急性腹瀉和調節動物和人的免疫系統方面存在若干公開報道。因此，所述體外試驗涉及對胃酸件的抗件在到達腸道之前，益生菌必須在它們通過胃的過程中存活(Henriksson等人， 1999年)。胃中的胃酸分泌針對通過口服途徑進入的絕大多數微生物負載形成第一防御機制。因此，細菌菌株在胃酸中存活是它們通過胃的能力的最準確的指示。科克大學益生菌研究組成功地分離和鑒定了顯示出理想的益生特征的乳酸細菌(Durme等人，1999年)。進行了初步實驗以確定分離自人回腸的乳桿菌和雙歧桿菌菌株所具有的初始抗性程度。通過胃管抽吸從健康個體獲得人的胃液。由于胃中PH上下波動(可達1.5)，在使用之前進行測量。將該酸添加到RSM培養基(Rogosa Siarpe培養基)中。在RSM培養基(De Man等人，1960年)中并使用HCl將pH值改變為2. O至3. 4，菌株的初始存活分別測量為乳桿菌 108%和雙歧桿菌106%。結果顯示雙歧桿菌對酸性非常敏感(Thornton，1996等)。因此， 構成本發明的菌株的抗性值大于所述實驗中研究的菌株的抗性值，即它們對酸性具有更大的抗性(圖1和4)。對膽酸鹽的抗性如上文所說明的，為表征益生潛力，必須還能夠抗膽汁鹽(Lee和Mlminen，1995 年)。在肝中由膽固醇合成膽酸，并且將膽酸以共軛化合物的形式從膽分泌到十二指腸 (500-700mL/天)，這些酸幾乎僅在微生物活性的作用下在結腸中經受更多的化學變化(去共軛、脫水、脫氫、以及去葡萄苷酸化)。共軛和去共軛的酸都具有體外抑制大腸桿菌、克雷伯氏菌屬、以及腸球菌屬菌株的生長的抗細菌活性(Lewis等人，1972年Jtewart等人， 1986年)。去共軛形式抑制作用更高，革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌更敏感(Floch等人， 1972年；？61^7_1 0^，1972年)。Dunne研究組(Dunne等人，1999年)在第一次試驗中選擇使用補充了牛、豬和人的膽酸的固體生長培養基，其中所述膽酸終濃度高達0.3%和 7. 5%，以評估菌株的膽汁鹽抗性。在使乳桿菌和雙歧桿菌生長之后，結果為它們表現出對牛膽酸的抗性，并且對于兩個細菌組，豬膽酸的結果抑制作用更高(Thornton，1996年)。因此，涉及用于人類食用的可能益生菌的研究，最相關的結果是其在人膽酸中生長的能力。考慮到人膽酸并沒有標準化，并且其膽酸含量在個體之間存在很大差別，將其膽酸含量標準化的牛膽酸(OXGALL)用作人膽酸的替代品是本領域現有技術中的普遍做法，這允許實施可重復的試驗。這是在本發明中所遵循的方法，以研究構成本發明的細菌的膽汁鹽抗性。獲得的結果表明所述細菌對膽汁鹽的抗性高于其商業對照(圖2和5)。益牛菌株的腸上皮粘附還必須在選擇中評估粘附于腸上皮組織的菌株的粘附性以及定殖于胃腸道的能力。此作用的重要性在于下述事實在選擇后，一些益生菌不再能夠定殖于它們的靶標宿
12主。事實上，在目前可得的益生菌中，看起來只有鼠李糖乳桿菌GG保持在胃腸道中較長的時間段(Berg等人，1998年；Goldin等人，1992年)。L rhamnosus GG粘附于屬于人腸細胞系的Caco-2細胞、HT-29細胞和Caco-2細胞，這些細胞表現正常人結腸細胞的形態和生理特征，并用于檢測調節腸病原粘附的機制(Bernet，1994年)。在近期研究中，它們已用于進行所述選擇，并因此評估可能的乳酸細菌或雙歧桿菌(基于所述菌的粘附能力)(Coconnier 等人，1992 年；Bernet 等人，1993 年；Greene & Klaenhammer, 1994 年； Crociani 等人，1995 年；Sarem 等人，1996 年；Tuomola & Salminen，1998 年)。從采用這些細胞系進行的研究可知，相比充分表征的鼠李糖乳桿菌GG菌株，本發明的乳桿菌菌株的粘附性(對Caco-2為約9%，對HT-四細胞為約5% Juomola等人，1998 年；Dunne等人，2001年；Botes等人，2008年)非常高，其中鼠李糖乳桿菌CNCM 14036為 7. 5 %，副干酪乳桿菌CNCM 1-4034為15. 5% (圖3)。本領域的現有技術認為相比乳桿菌， 雙歧桿菌無論其種類，其粘附性都小(Durme等人，2001年)。然而，HERO Espafta公司采用的兩歧雙歧桿菌和長雙歧桿菌(本發明中視為對照)以接近9%的值粘附于HT-四細胞。 同樣，本發明的目標雙歧桿菌以遠更高的值16. 7%粘附于所述細胞(圖6)。細菌的詵擇因此，在本發明中，使用對于雙歧桿菌和乳桿菌的特異培養基(實施例4)選擇細菌。在分離的過程中，使用了對雙歧桿菌描述為特異的3種新的培養基，它們是BFM培養基(Nebra和Blanch，1999年)、改良哥倫比亞培養基和Beerens培養基(Beerens，1991年； 實施例4. 1、4.2和4. 3)，從而在獲得雙歧桿菌菌落時獲得了更好的結果。為了選擇乳桿菌， 使用的培養基為Rogosa瓊脂培養基(實施例4. 4)。在本發明中，來自不同兒童的細菌菌落為4680個菌落，孵育該細菌菌落并進行選擇測試。在對PH 3. O或膽汁鹽抗性的第一個試驗后，有758個菌落存活性為90%;對腸上皮細胞的粘附測試后，僅有90個菌落(實施例5、6和7)。根據來源培養基，將這些菌落分成乳桿菌和雙歧桿菌。通過擴增每個菌落的16S rRNA基因以進行后續測序及其在NCBI (BLAST)數據庫中的同源性檢索的方式，直接進行它們的分子鑒定(實施例10)。最后，從Beerens培養基分離了四個細菌菌株，從Rogosa培養基分離了 13個細菌菌株，并從改良哥倫比亞培養基分離了 10個細菌菌株，所述菌株成功通過選擇。鑒于所選的菌落的數量，如已經說明的，通過擴增每個菌落的16S rRNA基因以進行后續測序及在 NCBI (BLAST)數據庫中的同源性檢索的方式，直接進行它們的分子鑒定。對分類為乳桿菌的菌株進行測序，并且這些序列彼此進行比對，以了解菌株是否具有相同的16s rDNA基因，并且發現41株細菌可以被分成2個組 對16s rDNA基因的1474bp片段具有99%同源性的組為
糊套乳桿菌菌株R-Il
糊套乳桿菌菌株La
糊套乳桿菌，菌株:MNFLM01
糊套乳桿菌菌株IDCC 3201
糊套乳桿菌菌株:YIT 0105( = ATCC 7469)
1李I套乳桿菌菌株Lcr35 16S
根據這些結果，從該組中選擇具有最佳抗性測試值的細菌(實施例7和9)，并稱為鼠李糖乳桿菌HERO 22A，(該菌之后被巴斯德研究所[CNCM National Collection of Microorganism Culture PASTEUR INSTITUTE 25,Ruedu Docteur Roux F-75724 Paris]編號為鼠李糖乳桿菌CNCM 1-4036，其于2008年7月2日保藏于該處)。對16s rDNA基因的1276bp片段具有100%同源性的另一組為副干酪乳桿菌，菌株Τ11-9副干酪乳桿菌，菌株Τ7-10干酪乳桿菌菌株KLDS 1.0720干酪乳桿菌菌株L5干酪乳桿菌，菌株:YIT0209( = NCDO 151)干酪乳桿菌，菌株=YIT0180( = ATCC 334)副干酪乳桿菌菌株IMPC 2. 1副干酪乳桿菌，菌株NRIC 1944副干酪乳桿菌，菌株NRIC 1942副干酪乳桿菌，菌株NRIC 1938副干酪乳桿菌，菌株NRIC 1934副干酪乳桿菌，菌株NRIC 0638干酪乳桿菌ATCC 334副干酪乳桿菌菌株DJl干酪乳桿菌菌株Ru2_2i副干酪乳桿菌分離株3C副干酪乳桿菌分離株2C副干酪乳桿菌干酪乳桿菌菌株MCRF-284乳桿菌L02副干酪乳桿菌副干酪乳桿菌，菌株SM20干酪乳桿菌菌株BL23副干酪乳桿菌副干酪亞種副干酪乳桿菌副干酪亞種干酪乳桿菌副干酪乳桿菌Tolerans亞種根據這些結果，從該第二組中選擇具有最佳抗性測試值的細菌(實施例7和9)，并最初稱為副干酪乳桿菌HERO 7，(該菌之后被巴斯德研究所[CNCM National Collection of Microorganism Culture PASTEUR INSTITUTE 25,Ruedu Docteur Roux F-75724 Paris] 編號為副干酪乳桿菌CNCM 1-4034，其于2008年7月2日保藏于該處)。之后，對雙歧桿菌的組進行相同處理，僅發現一組和下述菌株對16srDNA基因的 1136bp片段具有100%同源性未培養的細菌克隆rRNA235
短雙歧桿菌，菌株ATCC 15700根據這些結果，選擇雙歧桿菌組中具有最佳抗性結果(pH 2. 5下139. 6% )的細菌(實施例7和9)，并最初稱為短雙歧桿菌HERO 15B,(該菌之后被巴斯德研究所[CNCM National Collection of Microorganism Culture PASTEUR INSTITUTE 25,Ruedu Docteur Roux F-75724 Paris]重新命名為短雙歧桿菌CNCM 1-4035，其于2008年7月2日保藏于該處)。因此，這些菌株分類為鼠李糖乳桿菌HERO 22A副干酪乳桿菌HERO 7短雙歧桿菌HERO 15B。并且送至巴斯德研究所進行保存，在該處將這些菌株認可為獨特的菌株并且給予下述最終命名對DH、膽汁鹽的抗件和細胞粘附結果如上文所指示，為了使益生菌株對腸道發揮有益作用，它們必須在通過胃時存活， 從而抵抗其酸性(pH 2. 5-3. 5) (Holzapfel等人，1998年)，并且另一方面，它們必須對存在于小腸的膽汁鹽具有抗性，以到達結腸(Otles等人，2003年)。在本研究中，在pH 3.0下孵育細菌3小時，盡管已有描述90分鐘即足以重現進入胃和離開胃之間的這段時間(Jin等人，1998年)。在此情況中，分離的菌株和對照表現出接近100%的活性(實施例12/圖1和4)，但是暴露于pH 2. 5表明，這是非常有選擇性的， 因為沒有對照表現出活性，并且僅鼠李糖乳桿菌22A(CNCM 1-4036)菌株具有活性。換而言之，本發明的菌株鼠李糖乳桿菌22A比對照細菌具有顯著更高的抗酸性，因此，幫助其通過胃腸道以及之后的定殖。另一方面，在PH 3.0下，本發明的菌株鼠李糖乳桿菌7A比用作對照的菌株表現出更高的活性(實施例12，圖1、4)，這表示更多地進入小腸。pH 3. 0下2小時和在每升含有500_1000mg(0. 05-0. 1% )膽酸的培養基中的益生培養物的活性，被認為是對酸和膽汁鹽耐受的標準測試(Snelling，2005年)，盡管0. 3%膽汁鹽的濃度即適合用于選擇益生菌。在本發明的目標細菌的所有情況中，不同濃度(0.3% 和0. 7% )下進行的膽汁鹽測試提供了大于100%的值，并且大于用作對照的商業細菌(實施例12，圖2和5)。綜上所述，本發明的乳桿菌菌株相比目前用作益生菌的其它細菌而言， 對PH和膽汁鹽具有更大的抗性。已經描述了通常乳桿菌對胃腸道條件具有更大的抗性，特別是就酸性和膽汁鹽而言(Ross等人，2005年)。發現的結果和此描述是一致的，因為乳桿菌對胃腸道條件的抗性值要稍高于雙歧桿菌。如上文所述，益生菌進入腸道微生物群的另一個非常重要的方面是在腸上皮細胞
初始命名
副干酪乳桿菌7 短雙歧桿菌HERO 15B 鼠李糖乳桿菌HERO 22A
最終命名 CNCM1-4034
CNCM1-4035
CNCM1-4036上的粘附能力，原因在于，所述細胞防止益生菌株由于蠕動和形成腸道微生物群的其他細菌而被消除。此外，粘附是定殖的第一步，其可能是腸道病原的競爭性排除(Forestier等人，2001年；Lee等人，2003年)和宿主免疫調節(Ouwehand等人，1999年；Plant和Conway， 2002年)的先決條件。在本發明中，使用HT-四細胞作為腸上皮的體外模型研究了不同菌株的粘附性質 (實施例12，圖3和6)。粘附情況顯示對每種菌株來說是特異的，因為它們即使來自相同的種也具有非常不同的值。通過比較所述的不同益生菌的粘附能力可以對此進行理解，例如干酪乳桿菌(Fyos )具有14. 4%的粘附，而干酪乳桿菌(Lactophi Ius )具有2. 6%的粘附(Morata De Ambrosini等人，1999年)。如所指示的，本發明的乳桿菌菌株的粘附要比例如鼠李糖乳桿菌GG (在HT-四細胞上約5% ,Durme等人，2001年)的其它菌株高得多 (鼠李糖乳桿菌CNCM 14036為7. 5%，副干酪乳桿菌CNCM 1_40；34為15. 5% )(表3)。同樣，作為本發明的目標之一的雙歧桿菌短雙歧桿菌CNCMI-4035也以遠高于16. 7%的值粘附于所述細胞(圖5)，相比之下，用作對照的細菌為9%。這些數據證實了本發明的結果，顯示存在于不同益生菌株中的可變性。在此特異情況中，乳桿菌對照表現的粘附)對應于雙歧桿菌對照表現的粘附(8% )的一半，然而本發明中分離的菌株比它們的對照表現出更高的粘附，原因在于當比對了不同組的16s rRNA時，選擇了具有上皮粘附最佳值的菌株。因此，在乳桿菌的情況中，選擇下述菌株相比其對照的4. 80和4. 09%，所述菌株表現出約7. 48和11. 55%的粘附(圖幻；而在雙歧桿菌的情況中，選擇下述菌株相比其對照的8. 8和9. 1%，所述菌株表現出16. 7%的粘附(圖6)。換而言之，構成本發明的不同目的的細菌具有更高的定殖和保留于腸道中的能力，并且因此具有更高的益生作用。分離細菌的表征結果16s RNA 研究針對腸道整個細菌群體的鑒定、組成和計數已經出現不同的分子技術，其中多數基于16s核糖體RNA基因(rRNA)的研究，這是因為在過去十年中，16s rRNA基因已經變革了分類學者對細菌進行分類和鑒定的方式。16s rRNA基因包括從高度可變至高度保守的區域，并且序列的差異用于確定系統發育關系以及在種和株之間區分細菌。存在的可用數據庫具有超過 200，000 個 16s rRNA 基因，例如 NCBI/BLAST(http//blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)、核糖體數據庫 project-RPD (http //rpd. cme. msu. edu/htlm)禾口 EMBL(http//www. embl-heidelberg. de/)，這些數據庫比較現有16s rRNA基因序列和獲得的新序列。如實施例2所示，本發明中分離的細菌與鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌和短雙歧桿菌具有高度同源性，這和下述背景文獻一致在以母乳喂養的兒童中，在糞便中存在大量的雙歧桿菌，約占總微生物群的40-60%，而其中發現短雙歧桿菌為相當大的百分比 (Harmsen等人，2000年)。此外還存在高百分比的乳桿菌，主要是干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌等(Heiling等人，2002年；Satokari等人，2002年)。根據NCBI/BLAST數據庫，分離菌株的16s rRNA基因的同源性百分比非常高 (99-100% )(實施例2)。16s rRNA基因片段為約1.41Λ，并且第二片段范圍為對于鼠李糖乳桿菌 22A HERO (CNCM 1-4036)，為 1474bp ；對于(CNCM 1-4034) 7HER0，為 1274bp ；并且對于短雙歧桿菌15B HERO (CNCM 1-4035)為1118bp。精確來說，后者與短雙歧桿菌ATCC15700和雙歧桿菌的不可培養克隆具有100%的同源性，因此擴增16s rRNA基因的經測序片段將是重要的，但是在此情況中可以獲得更大的片段，因為寡核苷酸27F(SEQ. ID. NO 1) 和1492R(SEQ. ID. NO 2)(擴增約1400bp的片段)無法擴增短雙歧桿菌15B HERO菌株(CNCM 1-4035)的16s rRNA基因。因此，采用其它擴增較小片段的通用寡核苷酸，例如39F(SEQ. ID. NO 3)禾口 1391R(SEQ. ID. NO 4)。分離的乳桿菌菌株的16s rRNA基因經測序的片段顯示與鼠李糖乳桿菌組具有 99%的同源性，而其它菌株與多個副干酪乳桿菌和少量干酪乳桿菌具有100%的同源性。 將對照、鼠李糖乳桿菌HERO 22A (CNCM 1-4036)和副干酪乳桿菌7HER0 (CNCM 1-4034)菌株的16s rRNA片段與副干酪乳桿菌(其與分離的菌株具有高度同源性)的片段進行了比對。由此可以看到，在對照菌株、鼠李糖乳桿菌HERO 22A(CNCM 1-4036)和副干酪乳桿菌 7HER0(CNCM 1-4034)之間存在4個堿基的差異。在LGG和干酪乳桿菌對照之間也存在4個堿基的差異。鼠李糖乳桿菌22k HERO菌株(CNCM 1-4036)和2個對照都具有1個堿基的差異，和LGG對照有1個堿基的差異，并且和干酪乳桿菌有3個堿基的差異。在此情況中， 在比對的菌株之間存在較少差異，這表明在這些菌株中，16s rRNA基因相當保守。為了擴大所研究的細菌菌株的基因組信息，擴增了 16s和23s基因之間的基因間間隔，該間隔已知具有大的可變性(Barry等人1991年& Navarro等人，1992年)，其還用于區分原核生物的物種(Barry等人，1991年)。在分離的菌株中，基因間間隔片段的長度范圍為鼠李糖乳桿菌 22A HERO (CNCM 1-4036) 579bp、副干酪乳桿菌 7HER0 (CNCM 1-4034) 512bp 和短雙歧桿菌15B HERO (CNCM 1-4035) 182bp0將16s_23s基因間片段與NCBI/BLAST數據庫中的那些進行比較，結果顯示鼠李糖乳桿菌22A HERO菌株(CNCM 1-4036)與分離的鼠李糖乳桿菌TSl和鼠李糖乳桿菌PSl 16S具有100%的同源性。當比較所示的16s rRNA同源性結果時，結果則完全不同，因此可能菌株不在該數據庫中，或者NCBI/BLAST數據庫關于16s rRNA具有更多的信息，而關于16s-23s基因間間隔則不是這樣。這些結果表明，本發明的目標分離菌株是獨特的，這已通過巴斯德研究所特別將其命名為鼠李糖乳桿菌CNCM 1-4036而得到證實。在副干酪乳桿菌7HER0菌株(CNCM 1-4034)的情況中，16s_23s基因間間隔的結果顯示出干酪乳桿菌ATCC 334的100%的同源性。NCBI/BLAST數據庫含有完整的基因組， 并且其在顯示16s rRNA的100%同源性的副干酪乳桿菌列表上，因此很可能分離的菌株是干酪乳桿菌ATCC 334 ；在對基因組的其它片段(例如23s或k基因或其它)進行測序的任何情況中，可以同意或反對其完全對應于該菌株的這一看法。就此，在進行恰當的分析之后，巴斯德研究所認可該菌株是獨特的。對于雙歧桿菌菌株的情況，該片段相當短，因此擴增了對照的基因間間隔，對于長雙歧桿菌提供了 16^p，對于兩歧雙歧桿菌提供了 ^8bp，這證實了在該片段的大小方面存在很大的差異。將對照菌株、分離的菌株、短雙歧桿菌15B HERO (CNCM 1-4035)與和本發明的菌株具有99%同源性(NCBI/BLAST)的菌株進行了比對，觀察到在對照和短雙歧桿菌菌株之間具有大的差異；然而，在本發明的菌株和具有99%同源性的菌株(短雙歧桿菌 16S-23S內轉錄間隔區(ITS)，菌株Y8)之間僅存在1個堿基的差異。該菌株與具有16s rRNA的100%同源性的菌株完全不同，因此其可能是未進入該數據庫的菌株。所有這些結果都證實了本發明中分離的3個菌株是新的，因為它們尚未描述于本領域現有技術中。表型鑒定如實施例11所示，本發明采用碳水化合物發酵試劑盒(API 50CH)(圖8)和酶活性試劑盒(API Zym)(圖9)來分析所分離種的生化能力。它們構成了用于表型鑒定純生物培養物的快速和理論上可重復的方法。這些測試已用于表征和鑒別奶(Medina等人，2001 年)、酸奶和其它發酵奶制品(Andrighetto等人，1998年)、以及奶酪(Andrighetto等人， 1998年；Bouton等人，1998年；和De Angelis等人，2001年)中的乳桿菌。然而，這些測試的可靠性已受到質疑，特別是對于API 50CH，因此其最初開發用于鑒別臨床用途的乳桿菌菌株，并且制造商的數據庫未針對一些乳桿菌種進行更新，因此具有鑒別的不確定結果 (Andrighetto等人，1998年；和Collins等人，1993年)；然而，提供的信息仍對于在表型上表征分離的菌株是有價值的。如圖8所觀察到的，分離的菌株以及對照表現出用作胰蛋白酶和α-糜蛋白酶的低蛋白水解活性，但是它們表現亮氨酸的不同活性；對于纈氨酸，在雙歧桿菌中它們表現極低活性，而在乳桿菌中表現極高活性。雙歧桿菌對于α和β-半乳糖苷酶和α-糖苷酶也具有高活性。如Des jardins 等人(1990年)所述，α-半乳糖苷酶和α-糖苷酶活性可以將雙歧桿菌與其它乳酸細菌相區分。觀察到在雙歧桿菌和分離的鼠李糖乳桿菌22Α HERO菌株(CNCM 1-4036)中，存在高α-半乳糖苷酶活性。換而言之，這是重要的活性，因為特定的糖(例如α-D-半乳糖基-寡糖)的水解使得雙歧桿菌可以在腸道中選擇性繁殖(Gopal等人，2001年；Gulewicz 等人，2002年)，原因在于雙歧桿菌可以利用半乳寡聚糖。評估雙歧桿菌表型特征使得確認之前通過基因手段對它們的分類，并且確定它們的酶作用允許使用數種碳氫化合物底物， 優選具有α鍵以產生乳酸的葡萄糖聚合物。已經描述了其它來源和屬的很少菌株包括乳桿菌具有β -葡糖苷酸酶能力(Gopa 等人，2001年；Hopkins等人，1998年)。因此本發明的乳桿菌和雙歧桿菌菌株以及它們的對照并不具有葡糖苷酸酶活性水平，認為這一點是有利的特征。缺乏葡糖苷酸酶活性是所有被認為是良好益生菌所必需具有的特征，因為這種酶由微生物來源的使原致癌物轉化成致癌物的糞酶(硝基還原酶、偶氮還原酶)產生(Kurman，1988年)。Narmo等人 (1986年)證實具有陽性葡糖苷酸酶細菌的提取物提高苯并芘的膽汁代謝物的突變活化，而具有陰性β-葡糖苷酸酶的提取物不具有此活性。簡而言之，可以認為由于這些細菌對其它碳源例如甘露糖、海藻糖和葡糖苷酸具有低活性，它們優選乳糖和葡萄糖作為代謝碳源，盡管分離的鼠李糖乳桿菌22Α HERO菌株(CNCM 1-4036)具有α-海藻糖的酶活性， 這對于發酵巖藻糖基-乳糖衍生物例如存在于母乳中的那些具有有利的作用，從而對雙歧桿菌生長具有已知的有利效果。這一性質意味著本發明的益生菌在幼兒膳食中具有非常特殊的應用，但是它們也可以應用于成人膳食和特殊膳食中。應該注意的另一方面是API 50CH的結果(圖9B)，其中副干酪乳桿菌7HER0菌株 (CNCM 1-4034)發酵菊粉，這是其對照不具備的能力。發酵菊粉的能力并非是乳桿菌的普遍性質(Cebeci和Gurakan，2003年；Makras等人，2005年0)。這表明本發明的菌株具有發酵果寡糖(FOS)的能力，果寡糖廣泛用作幼兒膳食中的益生元，從而促進乳桿菌和雙歧桿菌主導的腸道微生物群的發展。本發明的細菌的這一特征強調了下述事實本發明的益生菌在幼兒膳食中具有非常特殊的應用，但是它們也可以應用于成人膳食和特殊膳食中。已經證實了菊粉和FOS提高結腸中雙歧桿菌的數量的能力(Roberfroid等人，1998年；Van Loo 等人，1999年)。益牛活件在滿足上述涉及對pH的抗性、對膽汁鹽的抗性、對腸上皮細胞的粘附和測序16S 的要求之后，已獲得了分離并確定的益生微生物。下一步驟包括表征其益生性質，具體而言，必需表征鼠李糖乳桿菌HERO 22A(CNCM 1-4036)和/或副干酪乳桿菌HERO 7 (CNCM 1-4034)和/或短雙歧桿菌HERO 15B (CNCM 1-4035)的益生性質。考慮到本發明的細菌滿足涉及對pH、膽汁鹽的抗性和粘附的要求，所述菌株可以應用于其中本領域現有技術已知使用益生菌的不同領域，例如應用于治療和預防不同病理學例如乳糖消化不良、降低膽固醇血漿水平、不同類型的腹瀉、炎性腸病、癌癥、由病原細菌引起的障礙等。因此，所述益生菌將應用于不同領域，如對主要消化性病原的作用和刺激免疫系統等。病源微牛物在對益生菌進行的不同類型的研究中，涉及胃腸系統的病源微生物的那些研究受到特別關注。在選擇病原細菌時，必需要考慮它們彼此之間不同的致病性的機制。目標細菌是腸毒性大腸桿菌，因為其腸毒素的產生是人腹瀉的重要原因。近期研究已經描述了某些乳酸細菌具有針對腸毒性大腸桿菌(Gopal等人，2001年；Todoriki等人，2001年；Chu等人，2005年；Tsai等人，2007年)和針對其它病原細菌例如鼠傷寒沙門氏菌和福氏志賀氏菌(Shigella flexneri) (Tien 等人，2006 年 Jankowska 等人，2008 年)的拮抗作用。益生菌株另一個感興趣的方面是可以產生稱為細菌素的物質，該物質由一些細菌分泌，從而與在相同生態位生長的其它微生物競爭。這些物質可以抑制病原細菌在腸上皮細胞上的生長或粘附，其可以由一些乳酸細菌產生(Klaenhamer，1993年Jack等人，1995 年；Sablon 等人，2000 年)。一個重要的方面是了解益生細菌或病原細菌與腸上皮細胞的相互作用，因為存在于人體微生物群中的所有細菌都直接與所述細胞相互作用。已經描述了腸上皮細胞中病原細菌的存在刺激促炎性響應譜(Thl)、釋放細胞因子例如TNF-α和IL-8、活化NF-κ B (Tien等人，2006年；0' Hara等人，2006年)以及提高其表達。在多數情況中，該響應在益生細菌的存在下被部分降低，這指示了益生作用 (Servin,2004 年)。因此，一些益生菌能夠調節DC的性質，包括它們活化特異免疫響應的能力 (Kelsall等人，2002年)。與腸道中的益生細菌接觸后的刺激和耐受平衡對于維持其動態平衡和能夠實施它們針對宿主消化系統中病原細菌的有益保護功能而言是重要的。本發明的益生菌株顯示對腸道病原微生物的生長具有抑制作用，所述病原微生物例如病原細菌，例如幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、單核細胞增生李斯特菌、宋內氏志賀氏菌、腸毒性大腸桿菌、腸沙門氏菌(Salmonella)、以及腸病毒例如輪狀病毒。乳糖吸收不良哺乳動物出生時具有足夠的乳糖酶活性，從而從母乳中利用乳糖。斷奶后，該活性隨著年齡而逐步降低，并且攝入含有乳糖的食物造成與乳糖耐受有關的指征和癥狀(異常脹氣、腹部疼痛、腹瀉等)。已知利用釋放乳糖酶的益生菌有利于在腸管中消化乳糖，從而減輕乳糖不耐的癥狀。膽固醇水平的下降高水平的血脂，例如膽固醇和甘油三酯，由于其與心臟疾病有關而意味著人體健康的高風險。由于食用低脂肪含量或具有參與脂質代謝的微生物的食品對預防這些病癥非常有益，因此已經表征了調節血清脂質的乳桿菌菌株。該益生作用與膽汁鹽的水解密切相關。因此已在動物(Akalin 等人，1997 ；Fukushina 和 Nakano，1996 年)和人類(Lin 等人，1989年)中觀察到施用益生菌可以降低血清膽固醇濃度。腹瀉事實上，益生菌最為廣泛記載的臨床應用是治療急性腹瀉。臨床試驗已顯示使用益生菌在用于預防和/治療數種腸道障礙中的治療劑中的功效，所述腸道障礙包括抗生素導致的腹瀉(McFarland等人，1995年)、成人腹瀉(H0cter等人，1990年)、兒童腹瀉 (Cetina-Sauri 和 Sierra，1994 年)和游客腹瀉(Kollaritsch 等人，1993 年)。在這些情況中，用作生物治療劑的益生菌影響大量酶和蛋白質的表達和活性，從而調節腸上皮并可以調節微生物群。涉及抗生素有關的腹瀉，當開具抗生素處方時采用益生菌可以降低腹瀉的發作和/或縮短其持續時間。采用最廣泛的微生物是屎腸球菌(Enterococcus faecium) SF6 (Wunderlich 等人，1989 年)、乳桿菌 GG (Siitonen 等人，1990 年；Vanderhoof 等人， 1999年)、嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌(L. bulgaricus)、和布拉酵母菌(Saccharomyces Boulardii)。這些試劑促進降低腸道中微生物群的改變、糞便硬度改變和后者的頻率。由艱難梭狀芽胞桿菌(Clostridium difficile，為機會性病原，其利用采用抗生素導致的腸道微生物群的改變)導致的腹瀉具有廣泛的臨床癥狀，范圍從溫和的良性腹瀉至發展出毒性巨結腸癥的嚴重的結腸炎、腹內和全身并發癥，可能導致患者死亡。腹瀉通常發生于抗生素治療開始后的數周。致病性順序由抗生素(如果人暴露于攝取該藥劑)誘導的腸道細菌微生物群的改變開始，這使得艱難梭狀芽胞桿菌定殖。之后，該細菌釋放導致組織損傷的毒素。艱難梭狀芽胞桿菌的病原株產生稱為A和B的毒素。布拉酵母菌通過釋放切除這些毒素及其膜受體的MkDa蛋白酶而抑制毒素A和B (Castagliuolo等人，1999年)。已顯示口服鼠李糖乳桿菌GG和布拉酵母菌有效恢復患者的正常微生物群。游客腹瀉是由于細菌、病毒或寄生蟲感染。存在導致游客腹瀉的多種微生物，它們在國家之間可能不同。從頻率上看，它們包括大腸桿菌、志賀氏菌屬(Shigela)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(CampylcAacter)、輪狀病毒和藍氏賈第鞭毛蟲(Giardia lamblia)。游客腹瀉影響半數進入高危地區的游客。在不同研究中用作益生菌的細菌為 乳桿菌、雙歧桿菌、鏈球菌和腸球菌。乳桿菌GG是針對游客腹瀉的最有效的益生菌。炎性腸病益生菌的主要用途之一涉及微生物群和免疫系統的失衡。據此方面，炎性腸病的研究是關于益生菌作為臨床療法的可能用途的最令人感興趣的焦點。此領域內進行的研究已就臨床使用益生菌和這些疾病中涉及的不同中間體的基因表達提供了重要信息。
炎性腸病(IBD)是來源未知的腸道慢性炎性障礙(潰瘍性結腸炎、克羅恩病)，發病機理復雜，并涉及至少3個重要因素基因易感性因素、腸道微生物叢和免疫介導受損。 已經提出下述假說IBD由于T細胞針對微生物群的異常響應而發生，還已推測病原生物體的存在可能導致這些疾病。在具有IBD的患者的結腸活檢樣本中存在降低量的乳桿菌和雙歧桿菌(Fabia等人，1993年Javier等人，1997年)。IBD的常規治療集中于抑制或調節宿主的免疫，并且在這些治療中，使用益生菌是克羅恩病的有效治療方法。這指示使用益生菌來調節微生物叢可能在治療IBD中是重要的。
背景技術：
中的近期研究已經發現，具有克羅恩病的患者在疾病活性時間期間的糞便中具有降低量的半乳糖苷酶。這一降低與雙歧桿菌的減少有關，所述雙歧桿菌是 β -半乳糖苷酶的來源O^avier等人，1997年)。癌癥結腸直腸癌癥是包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病的IBD的最嚴重的并發癥之一 (Eaden等人，2001年)。IBD可以產生致癌過程的最準確機制尚未得到明確的了解。推測其可能是慢性炎性過程的成因(Weitzman & Gordon，1990年)，其在一些實驗模型中可以起到腫瘤促進劑的作用。腸道微生物群和免疫系統在調節致癌作用中起重要作用。益生菌對這兩者都可以具有作用，因此在此領域中已進行了對抗結腸癌的很大努力。已發現益生菌可以降低可以涉及于結腸致癌過程中的酶、誘變物、次級膽酸的濃度(Wollowski等人，2001年)。 流行病學數據證實每日食用發酵制品具有抗結腸腺瘤或結腸癌的保護作用(Rafter和 Glinghammar,1995 年)。作為益生菌和益生元的混合物的共生組合已用于研究癌癥的預防。此組合提高短鏈脂肪酸的水平，短鏈脂肪酸是細菌發酵的主要產物，其主要作用為作為腸上皮的營養物來源。它們與分化誘導、增殖抑制和體外細胞凋亡的提高有關(Heerdt等人，1997年； Medina等人，1997年)，并且它們可以在預防一些疾病例如胃腸道障礙和癌癥中起作用 (Julia 等人，2006 年)。本發明不僅證實了所選擇的菌株抑制病原細菌和腸道病毒的生長的能力，而且比較本領域現有技術抑制的對照益生菌株，證實了定義微生物益生性質的卓越特征，例如對 PH、膽汁鹽的抗性和對腸的粘附。結果已表明在所有情況中，本發明的細菌的益生性質要優于所述對照菌株。因此已知用作對照的細菌的活性集中于下述領域Danone的免疫干酪乳桿菌與含有免疫干酪乳桿菌(Actimel )的益生組合物有關的有益作用對不同感染原具有最佳免疫響應，從而提高免疫系統活化細胞因子的水平、改善T細胞的增殖性響應和調節NK細胞的表達。已觀察到飲用Actimel 改善與感染有關的幼兒腹瀉的預后，從而降低其嚴重性并縮短其持續時間。因而含有免疫干酪乳桿菌的組合物對人結腸粘膜具有陽性的抗炎作用，因為它們提高宿主的免疫響應，這對具有炎性腸病的個體和對于預防結腸癌是有益的。前述和進行的不同比較實驗已顯示副干酪乳桿菌HERO 7 (CNCM 1-4034)相比免疫干酪乳桿菌具有更好的益生性質，鑒于此，副干酪乳桿菌HERO 7(CNCM 1-4034)作為人結腸粘膜的抗炎劑，在下述方面具有良好的應用例如預防不同病理學，所述病理學例如乳糖吸收不良、膽固醇血漿水平降低、不同類型的腹瀉、炎性腸病、癌癥等；改善針對不同感染原的免疫響應；改善幼兒腹瀉(以及相應地預防結腸癌)。LGG乳桿菌GG粘附于腸細胞，刺激免疫響應并預防病原性腹瀉。不同研究已證實食用含有LGG的組合物，例如Kaiku⑧的Bioactif，抑制病源微生物在腸道的競爭性定殖。這些微生物又產生抑制病原菌株生長的抗微生物化合物，隨后抑制病原菌株的生長。因此，食用具有LGG的組合物維持或恢復腸道微生物叢平衡，從而優化腸粘膜功能的吸收過程。前述和進行的不同比較實驗已證實鼠李糖乳桿菌HERO 22A(CNCM 1-4036)相比乳桿菌GG具有更好的益生性質，鑒于此，鼠李糖乳桿菌HERO 22A(CNCM 1-4036)在下述方面具有良好的應用例如刺激免疫響應和預防病原性腹瀉以及維持或恢復腸道微生物叢平長雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌本領域現有技術已知長雙歧桿菌對抗生素具有抗性，因此用抗生素進行治療的個體定期食用長雙歧桿菌會預防在患者中偶然導致的腹瀉。這些微生物的其它應用目的在于降低膽固醇，減輕乳糖不耐的癥狀，刺激免疫系統和預防癌癥。食用具有兩歧雙歧桿菌的組合物緩解與腹瀉有關的癥狀。因此，它們是通過提高外周血中噬菌細胞活性而提高個體免疫響應的微生物。前述和進行的不同比較實驗已證實短雙歧桿菌HERO 15B(CNCM 1-4035)相比長雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌具有更好的益生性質，鑒于此，短雙歧桿菌HERO 15B(CNCM 1-4035) 在下述方面具有良好的應用例如刺激免疫響應和預防由抗生素引起的腹瀉，降低膽固醇， 改善乳糖不耐的癥狀，預防癌癥等。食品、飲料、藥物等中的益生菌將活微生物摻入食品中是一項長期的實踐。酸奶和其它發酵奶是傳統上包含有活微生物的食品。近年來功能性食品的開發已經帶來了基于使用能夠對生物體產生有益作用的微生物的新應用的發展。在功能性食品領域中，幼兒膳食領域也不例外，并且近年來此類型的成分已經開始包含于不同類型的幼兒食品中。益生菌是主要發展方面之一，多數應用于配方奶的領域， 主要為持續和生長配方。將益生菌摻入食品中的目的是它們植入宿主的結腸中，并且獲得一系列的有益作用(降低病原菌叢、產生維生素和其它營養物質、降低培養介質的PH等)。本發明的益生細菌已全部被認可為乳酸細菌群中的種，并且它們已經在世界范圍內已知為零病原性。因此，可以接受它們以分離方式或者與其它乳酸細菌組合的方式用于發酵奶制品等，所述其它乳酸細菌例如嗜熱鏈球菌(Sti^ptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳鏈球菌(Streptococcus lactis)等。類似地,它們在幼兒奶中的應用和任何其它乳酸細菌一樣，不涉及任何潛在的食品安全問題。將這些益生菌摻入食物和飲料中必需確保在產品最長保質期后通過使用合適的混合(或者適當時的發酵)方法在最終產品中有特定數量的活細菌。本發明的益生菌可以應用于幼兒膳食以及成人膳食和特殊膳食中。所述益生菌可
22以單獨以粉末形式或與其他本領域現有技術已知的賦形劑一起混合使用，所述賦形劑例如糖、蛋白質、奶粉等，或者作為優選發酵基于奶的制品中的活性成分。因此，所述益生菌可以以粉末或液體形式摻入到食品中，所述食品被一般人群使用，特別是奶或奶衍生的產品，尤其是發酵奶和奶酪；谷類食物和衍生物，包括面包團；脫水形式的湯和其它類似產品；發酵肉制品；水果衍生物、果汁和軟飲料；用于特殊營養用途的食品，包括幼兒奶、幼兒谷類食物、即食型幼兒食品等。它們還可以見于食品補充劑和用于臨床應用的口服和腸道營養的特殊配方。如果其為粉末產品(幼兒奶、谷類食物等)，通過將它們干燥混合到最終產品中而將益生菌摻入。因此，本發明的益生菌可以摻入到用于以水或另一液體如奶復原的食品粉末中(幼兒奶粉、谷類食物等)。在它們用于發酵奶或奶制品以及制備酸化奶的用途中，在以可控溫度和時間而產生發酵的工藝的中間步驟向液體奶中加入益生菌，從而獲得酸化奶。本發明的益生菌還可以應用于食品補充劑和甚至在藥品中，其可以以粉末制劑、 片劑、糖涂覆的片劑等形式提供。這些產品具有治療炎性腸病、胃潰瘍、急性腹瀉和胃腸道其它疾病的領域用途。實施例實施例L擴增16S-23S基因間片段擴增了所選菌株的基因間片段、進行測序并在NCBI (BLAST)數據庫中進行了同源性檢索，得到下述結果·鼠李糖乳桿菌22A(CNCM 1-4036)和下述菌株具有579bp片段的100%同源性-鼠李糖乳桿菌分離株TSl-鼠李糖乳桿菌分離株PSl16S 副干酪乳桿菌7 (CNCM 1-4034)和下述菌株具有512bp片段的100%同源性-干酪乳桿菌ATCC334 短雙歧桿菌15B(CNCM 1-4035)和下述菌株具有182bp片段16s_23s基因間間隔的99%同源性-短雙歧桿菌(ITS)，菌株Y8-長雙歧桿菌(ITS)，菌株YlO實施例2.比對經測序的區段采用Clustalw 程序在線工具(http //www. ebi. ac. uk/clustalw/)比對所選菌株和對照的經測序的區段。菌株和對照的rDNA 16S基因序列的整體比對顯示在對照與樣品鼠李糖乳桿菌 22A和副干酪乳桿菌7之間存在差異，而在樣品7和副干酪乳桿菌的所選序列之間觀察到完全的同源性。涉及所選樣品短雙歧桿菌15B，觀察到對照和樣品短雙歧桿菌15B序列之間有差異，在短雙歧桿菌15B和短雙歧桿菌的所選序列之間觀察到100%同源性。菌株15B和對照的基因間間隔16S-23S的序列的完全比對使得在對照和樣品短雙歧桿菌15B的序列之間觀察到大的差異。事實上，16S-23S基因間間隔的測序是獨特的，并且不與針對雙歧桿菌之前所述的任何情況相符，這指示本發明的菌株是獨特的，巴斯德研究所通過給其同樣獨特的命名而認可了這一點。實施例3獲取和處理樣品樣品的獲取。在本專利發明人兒科醫生JM的診所，在厭氧條件下獲取2至4個月大的完全以母乳喂養的兒童的糞便。首先要求父母在早上將其兒童帶到診所，期望兒童在刺激后進行腸道運動，并在腸道運動后通過連接于無菌容器的蓋的塑料匙將糞便收集于無菌容器中。 一旦完成收集，將具有樣品的容器放于厭氧罐(Anaerojan Oxoid，Hampshire, United Kingdom)中，所述厭氧罐連接有生成厭氧氣氛的囊(Anaerogen Oxoid，Hampshire, United Kingdom)，并且將罐不透氣地密封并在不超過2小時的時間內運到處理樣品的實驗室。處理和接種樣品要進行分析的樣品可以一經收集立刻處理，或者處理后在正確標記的Eppendorf 管中冷卻于_80°C。因此，制備糞便在PBS(磷酸鹽鹽水緩沖液(PBS，Sigma_Aldrich，Madrid，Spain)) 中的 10%懸浮液和 L-半胱氨酸鹽酸鹽(Scharlau CEIME,Barcelona, Spain) (0. 05% ) 由此制劑制備IO1至IO7的7個稀釋液，最后將每個稀釋液的50 μ 1接種于2個所選的培養基中，并在37°C下在用于培養雙歧桿菌的厭氧生活條件(Anaerogen )和用于培養乳桿菌的 CO2豐富培養基(CO2Gen)中孵育72小時。實施例4.制備培養基然后指出用于雙歧桿菌的3種特異培養基和專門用于乳桿菌的培養基1. Beerens培養基{Beerens，1990年)此培養基用于確定雙歧桿菌。對于其制備，在1升Erlenmeyer燒瓶中，混合47g腦心浸液瓊脂、5gD_(+)葡萄糖、 0. 5g檸檬酸鐵III、0. 5g L-半胱氨酸和1升蒸餾水。在加熱攪拌板上恒速攪拌并加熱該混合物若干分鐘直到其沸騰，然后將其在室溫下冷卻。一旦達到55°C，向其中加入5ml丙酸和 2. 2ml 2Eq/L氫氧化鈉，然后調整pH至5.0。2. BFM培養基(Nebra & Blanch，1999年)此培養基專門用于雙歧桿菌。所述培養基以所指示的每升溶液的比例具有下述組分· 2g肉浸膏· 7g酵母提取物· 2g 淀粉· 0. 5g L-半胱氨酸鹽酸鹽· 5g氯化鈉 5g蛋白胨眷2g胰蛋白胨 5g半乳糖苷果糖· Img 核黃素 *· Img 硫胺 * lemg亞甲基藍
· 2g氯化鋰· 5ml 丙酸· 15g 瓊脂所對應的量用于制備500ml的此雙歧桿菌選擇性培養基。在加熱攪拌板上恒速攪拌并加熱該混合物若干分鐘直到其沸騰，然后高壓滅菌該溶液。最后，在濃縮溶液(原液 lmg/ml)中制備維生素O，然后將其過濾并在溶液達到約55°C時和丙酸一起添加到培養基中。3.改良哥倫比亞培養基(pH 5. 0)此培養基專門用于雙歧桿菌。所述培養基以所指示的每升溶液的比例具有下述組分 哥倫比亞瓊脂培養基(Oxoid, Hampshire, United Kingdom) 葡萄糖(5g/L) 半胱氨酸(0. 5g/L) 瓊脂(高達 15g/L)前述量用于制備IOOOml的此雙歧桿菌選擇性培養基。在加熱攪拌板上恒速攪拌并加熱該混合物若干分鐘直到其融化，然后將溶液高壓滅菌。最后，在溶液達到約55°C時將丙酸添加到培養基中，并且用IN NaOH溶液調節pH至5. 0。4. Rogosa瓊脂培養基此培養基用于確定乳桿菌。對于其制備，下文是商業公司提供的說明。根據商業公司提供的說明制備該培養基。實施例5接種樣品一旦進行稀釋后，通過接種環一式三份地接種它們中的每一個。然后將具有不同培養基的所有培養板在受控溫度37°C的孵育器中進行孵育。事先將具有雙歧桿菌培養基的培養板放入厭氧生長罐中，其中加入了 Anaerogen 的囊(厭氧氣氛生成系統)，并且在含有乳桿菌培養板的那些中加入了 C02Gen 的囊(O)2氣氛生成氣氛)，最后將它們在37°C下孵育72小時。實施例6確定菌落形成單元的數量孵育后，選擇具有大于10個菌落形成單元生長的稀釋液，通過電子菌落計數筆 (菌落計數器型號608702，Bio Co, Kobe, Japan)計數每個培養基中的CFU。最后，通過下文的公式計算CFU的總數CFU =菌落數量X稀釋因數X稀釋進行培養后，將剩余的糞便樣品儲存于-80°C，直到進行分子生物學研究。實施例7.測定對pH和膽汁鹽的抗性孵育72小時后，就用裸眼觀察的形態學，從每個兒童的每個培養基中選擇100個菌落。在液體Man Rogosa Siarpe (RSM)培養基和厭氧條件下孵育所述菌落(乳桿菌和雙歧桿菌)48小時。隨后，立刻用它們中的每一個制備甘油原液(RSM+甘油10% )。同時，隨著由不同菌落制備甘油原液，分析它們在pH 3. O和3%膽汁鹽(Oxgall， Sigma-Aldrich, Spain)的濃度下的活性。為此目的，以下述方式進行所述操作1.以5000rpm離心菌落5分鐘。2.去除上清液并重懸于無菌PBS中。
3.在類似于上文的條件下再次離心。4.重復步驟1至3三次。 5.最后重懸于Iml無菌PBS中。6.將IOOml的前述懸浮液接種于pH 7. 0和pH 3. 0以及溶于PBS的0. 3% Oxgall 的 900ml PBS 中。7.在37°C下，在厭氧條件下孵育3小時。8.對于其中進行孵育的每個條件，進行不同的稀釋(IO1至IO5)。9.接種50 μ 1的每個稀釋液。10.在37°C下，在厭氧生長條件下孵育72小時。11.通過計數確定存在于對照和pH和Oxgall中的菌落數量。12.通過下述等式確定每個菌落的存活性
+ .H PH/Oxgall下的茴落數量
存活性=-XlOO
對照茴落的數量在pH 3. O和0. 3% Oxgall下顯示出大于90%的存活性的所有那些菌落都被認為是陽性的，保留所述菌落以進行其余測試。消除其它菌落。實施例8.對照細菌下述為和陽性對照使用的菌落Para雙歧桿菌Hero Spain S. A提供的兩歧雙歧桿菌和長雙歧桿菌。Para乳桿菌采用了 2種商業乳桿菌干酪乳桿菌(Danone )和鼠李糖乳桿菌 GG (LGG)(ΚΑΙ KU )。用所選菌落完成初始篩選后，進行二次篩選。在此情況中，驗證了在PH 2. 5和2. 0 以及0.5%和0.7% Oxgall的存活性。進行的操作類似于第一次試驗中采用的操作。確定存活性后，測定了存活性范圍。在此二次篩選中，商業細菌對照提供的值小于零，因此具有大于4%的存活性百分比的細菌確定為選擇陽性菌落的初始最佳范圍。將菌落分成3組組1 存活性大于66%的菌落。組2 存活性為33至66%的菌落。組3 存活性大于4%的菌落。圖1和4示出了本發明的目標菌株對pH的抗性或存活結果。在菌株鼠李糖乳桿菌 22A(CNCM 1-4036)以及副干酪乳桿菌7 (CNCM 1-4034)的情況下，在圖1中示出了結果，并且它們證實在PH 3.0下，菌株的抗性類似于或者稍高于測試的商業菌株。然而，在pH 2.0 下，菌株22k相比其余在該pH不存活的菌株具有非常高的存活性。在菌株短雙歧桿菌CNCM 1-4035的情況中，圖4示出了結果，其中可以觀察到，在pH 3. 0下菌株15B的抗性顯著高于測試的另外兩種雙歧桿菌的抗性，其存活性高于100%，這指示細菌可以在該pH下繁殖。圖2和5示出膽酸鹽對本發明的菌株的存活的影響結果。圖2中，提供了涉及菌株CNCM 1-4036和CNCM 1-4034的結果。如所提及的，兩個菌株都顯示遠高于所測試的商業菌株的存活百分率，存活百分比大于100%，這指示它們甚至可以在這些鹽的存在下繁殖。 圖5中，提供了涉及菌株CNCMI-4035的結果。如此圖中所示，如與本領域現有技術的對照雙歧桿菌相比，該菌株顯示了在更高濃度下的更好的存活。
實施例9.對腸上皮細胞粘附的測試采用已通過對pH和膽汁鹽抗性所選的菌落，進行了細胞粘附試驗。所述試驗采用腸上皮細胞HD9進行。首先，進行了通過不同染色測定細胞粘附的一系列嘗試革蘭氏染色、亞甲基藍染色、姬姆薩染色等。觀察到，通過此手段非常難以測定對HD9細胞的粘附百分比。提出了哪種方法為測定粘附百分比的最佳方法的問題，結論是最佳方法可能為將允許回收到所有粘附細菌的方法。因此，選擇了胰蛋白酶化方法，最后以下述方式進行1.在37°C和5% CO2下孵育Η ^9細胞，直至在孔板中匯合。2.在厭氧條件下孵育要試驗的不同菌落。3.根據下述步驟使細菌與細胞接觸a.以5000rpm離心細菌5分鐘。b.去除上清液，然后將細菌重懸于Iml無菌PBS中。c.再重復步驟a和b兩次。d.在600nm下測定每種細菌的0. D.。e.在前述制備的不含FBS(牛血清白蛋白)和抗生素(1至hl06CFU/ml)的細胞培養基中稀釋細菌培養物至0. D為0. 8。f.去除細胞的培養基。g.用無菌PBS洗滌數次，從而去除FBS和抗生素殘留物。h.向每個孔中加入250ml的細菌懸浮液。一式三份進行實驗。i.在37°C禾口 5% CO2下孵育90分鐘。4.當細菌與細胞一起孵育后，進行下述操作a.通過用巴斯德吸管抽吸去除培養基。b.用 IX PBS(pH 7. 0)洗滌 4 或 5 次。c.加入100 μ 1胰蛋白酶，并在37°C下孵育10-15分鐘。d.回收孔中的整個體積，并轉入Eppendorf。e.用150 μ 1的PBS洗滌孔，并加入到同一 Eppendorf中。f.每個樣品進行數次稀釋G或5次)。g.接種每個稀釋液的50 μ 1。h.在37°C和厭氧條件下孵育72小時，i.進行菌落數量的計數。5.測定粘附百分比。
權利要求
1.一種益生微生物菌株，其分離自完全以母乳喂養的兒童的糞便，其特征在于，所述菌株由鼠李糖乳桿菌HERO 22A(CNCM 1-4036)或副干酪乳桿菌HERO 7 (CNCM 1-4034)或短雙歧桿菌 HERO 15B (CNCM 1-4035)組成。
2.根據權利要求1所述的益生微生物菌株，其特征在于，所述菌株為鼠李糖乳桿菌 HERO 22A(CNCM 1-4036)。
3.根據權利要求1所述的益生微生物菌株，其特征在于，所述菌株為副干酪乳桿菌 HERO 7(CNCM 1-4034)。
4.根據權利要求1所述的益生微生物菌株，其特征在于，所述菌株為短雙歧桿菌HERO 15B(CNCM 1-4035)
5.根據前述權利要求中任一項所述的微生物菌株，其特征在于，所述菌株以純生物培養物的形式提供。
6.根據前述權利要求中任一項所述的微生物菌株，其特征在于，所述菌株為分離的。
7.根據前述權利要求中任一項所述的益生微生物菌株，其特征在于，所述菌株以活細胞的形式提供。
8.根據權利要求1-6中任一項所述的益生微生物菌株，其特征在于，所述菌株以非活細胞的形式提供。
9.一種包含根據前述權利要求中任一項所述的微生物菌株的制劑。
10.包含根據前述權利要求中任一項所述的微生物的混合物的制劑。
11.根據權利要求9-10所述的制劑，其特征在于，所述制劑還包含另一種益生物質。
12.根據權利要求9-11所述的制劑，其特征在于，所述制劑還包含益生元物質。
13.根據權利要求9-12中任一項所述的制劑，其特征在于，所述制劑還包含適合于其攝取的載體。
14.根據權利要求13所述的制劑，其特征在于，所述載體是藥學上可接受的載體，例如膠囊、片劑或粉末。
15.根據權利要求13所述的制劑，其特征在于，所述載體是食品。
16.根據權利要求14所述的制劑，其特征在于，所述食品選自奶和奶衍生的產品，特別是發酵奶和奶酪；谷類食物和衍生物，包括面包團；湯和脫水形式的其它類似產品；發酵的肉制品；水果衍生物、果汁和軟飲料；用于特殊營養用途的食品。
17.用于膳食的根據權利要求1-8中任一項所述的益生微生物菌株或根據權利要求 9-16中任一項所述的制劑。
18.根據權利要求17所述的菌株或制劑，其特征在于，其用于幼兒和/或成人和/或特殊膳食。
19.用于制備幼兒配方奶的根據權利要求18所述的菌株或制劑。
20.根據權利要求19所述的菌株或制劑，其特征在于，所述配方奶為即食型幼兒奶和/ 或幼兒谷類食物和/或幼兒食品。
21.用于制備食品補充劑的根據權利要求17所述的菌株或制劑。
22.用于制備口服和/或腸道營養的特殊配方的根據權利要求17所述的菌株或制劑。
23.用于制備藥品的根據權利要求1-8中任一項所述的益生微生物菌株或根據權利要求9-16中任一項所述的制劑。
24.可應用于下述方面的根據權利要求1-8中任一項所述的益生微生物菌株或根據權利要求9-16中任一項所述的制劑刺激免疫系統和/或預防/治療哮喘和/或預防/治療胃腸道障礙；和/或消除/調節主要消化道病原；和/或預防/治療肥胖及其共存疾病，包括代謝綜合征和糖尿病和/或典型的衰老相關疾病。
25.根據權利要求M所述的菌株或制劑，其特征在于，所述胃腸道障礙包括腸道傳輸變化，例如便秘和礦物質的生物利用度變化、感染和吸收不良綜合征。
26.根據權利要求25所述的菌株或制劑，其特征在于，所述感染包括胃感染和具有急性或慢性腹瀉的胃腸道感染。
27.根據權利要求25所述的菌株或制劑，其特征在于，所述吸收不良綜合征包括影響腸道解剖結構的障礙，例如短腸綜合征，和影響腸道生理學的障礙，例如胰腺囊性纖維化、 糖尤其是乳糖的吸收不良、脂質吸收改變、食物過敏、和炎性腸病例如克羅恩病和潰瘍性結腸炎。
全文摘要
本發明涉及分離自完全以母乳喂養的兒童的糞便的益生微生物。所述微生物由于其對攝取它們的人的健康具有有益作用的益生性質而用于食品或制藥工業，特別是用于幼兒配方奶。所述微生物包括鼠李糖乳桿菌HERO 22A(CNCM I-4036)、副干酪乳桿菌HERO 7(CNCM I-4034)和短雙歧桿菌HERO 15B(CNCM I-4035)。
文檔編號C12N1/20GK102421889SQ201080020442
公開日2012年4月18日 申請日期2010年3月9日 優先權日2009年3月10日
發明者何塞·瑪麗亞·維埃特斯·費爾南德, 何塞·馬爾多納多·洛扎諾, 卡羅萊納·戈麥斯·略倫特, 塞爾吉奧·穆諾茲·奎扎達, 安東尼奧·弗朗西斯科·蘇阿雷茲·加西亞, 安琪兒·吉爾·赫爾南德茲, 尹瑪庫拉達·拉瑪斯·科姆帕尼, 米里亞姆·貝穆德斯·布里托, 費爾南多·羅梅羅·布拉奎哈伊 申請人:海羅西班牙有限公司