專利名稱：用于分子分析的設(shè)備和方法
用于分子分析的設(shè)備和方法交叉引用本申請(qǐng)要求2009年8月6日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/231，979、2010年2 月24日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/307，827、2009年8月6日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng) No. 61/231，963、以及2010年6月28日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/359，266、以及同此一起提交的在律師客戶檔案號(hào)32497-714. 601之下的共同未決的案例的優(yōu)先權(quán)利益，其中每個(gè)申請(qǐng)為了所有目的通過引用被全部并入本文。關(guān)于聯(lián)邦贊助的研究的陳述在國家健康研究所的合同號(hào)ROl DA025722和國家科學(xué)基金會(huì)(NBTC)的合同號(hào) ECS-9876771下以美國政府的支持來進(jìn)行本發(fā)明。
背景技術(shù)：
絡(luò)合生物分子的混合物的分離是在高通量篩選中的重要要素。分選生物分子的能力在基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和藥物篩選的領(lǐng)域中特別重要。在例如蛋白質(zhì)組學(xué)中，種類繁多 (大約10，000種不同的種類)的蛋白質(zhì)和肽樣本需要被分離和分析。蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)目的是快速鑒定并定量所有在細(xì)胞中表達(dá)的所有蛋白質(zhì)或在細(xì)胞中表達(dá)的與特定的通路或疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)的特定子集。在基因組學(xué)中類似地，快速分析并分離大量基因組片段的能力是高度合乎需要的。基因組學(xué)的一個(gè)目的是快速鑒定并定量細(xì)胞或任何類似地小的樣本實(shí)例如激光微觀捕獲的生物樣本中的所有基因組修飾。藥物篩選的一個(gè)目的是鑒定結(jié)合到細(xì)胞或細(xì)胞外蛋白質(zhì)的小分子，該細(xì)胞或細(xì)胞外蛋白質(zhì)用作治療介入的目標(biāo)(例如，藥物或氣體治療處理)。結(jié)合到目標(biāo)蛋白質(zhì)的分子(例如，小有機(jī)分子、肽或大分子例如蛋白質(zhì)和適配子)常常調(diào)整其能力。這樣的分子本身可用作治療法或可指導(dǎo)治療法的設(shè)計(jì)。當(dāng)前的分選技術(shù)例如柱純化、免疫沉淀反應(yīng)或凝膠電泳具有很多深層的缺點(diǎn)，包括低敏感性、 低速度和高成本。因此，仍然相當(dāng)需要對(duì)在基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物篩選和適配子選擇中的穩(wěn)健的聞通量應(yīng)用有用的可選工具。發(fā)明概述表觀遺傳狀態(tài)的單分子研究可能訪問使用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)當(dāng)前不可獲得的信息，染色質(zhì)免疫共沉淀被限制到在使用微克數(shù)量的起始原料時(shí)的一個(gè)表觀遺傳標(biāo)志的研究。在 Arnab Mukhopadhyay, Bart Deplancke, Albertha J M Walhout & Heidi A Tissenbaum, Nature Protocols 3，698-709 (2008)中描述了常規(guī) CHIP 技術(shù)。因此，本發(fā)明解決對(duì)用于以單分子分辨率分選絡(luò)合分子的方法和設(shè)備的需要。納流控中的單分子探測可消除對(duì)檢查多個(gè)表觀遺傳標(biāo)志所必需的重復(fù)連續(xù)的準(zhǔn)備。每個(gè)分子的多色特征可用于同時(shí)評(píng)估多個(gè)標(biāo)志的存在。這可允許表觀遺傳標(biāo)志的復(fù)雜互連的作用被理解并在皮可數(shù)量的輸入材料上被檢查。本發(fā)明提供了用于分選物體的系統(tǒng)，其包括(a)通道，其流體地連接到多個(gè)下游流路，所述通道適合于將所述物體保持在所述通道中的連續(xù)液體主體中；(b) —個(gè)或多個(gè)光源，其配置成照亮通道以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)探詢?nèi)莘e；(C)探測模塊，其配置成探測表示在所述一個(gè)或多個(gè)探詢?nèi)莘e中的物體的兩種不同的特性的至少兩種類型的信號(hào)；以及(d)分選模塊，其配置成基于所述兩種類型的信號(hào)使物體定向到所述多個(gè)下游流路中的一個(gè)。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)還可包括(a) —個(gè)或多個(gè)次級(jí)光源，其配置成照亮所述多個(gè)下游流路中的一個(gè)以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)下游探詢?nèi)莘e；以及(b)次級(jí)探測模塊，其配置成探測在所述一個(gè)或多個(gè)下游探詢?nèi)莘e中的至少一種類型的信號(hào)。系統(tǒng)還可另外包括次級(jí)分選模塊，其配置成基于所述一個(gè)或多個(gè)下游探詢?nèi)莘e中的所述兩種類型的信號(hào)使物體定向到多個(gè)次級(jí)下游流路中的一個(gè)。在前述實(shí)施方案的任一個(gè)中，物體選自由核酸分子、蛋白質(zhì)、染色質(zhì)、生物分子、細(xì)胞、細(xì)胞成分、碳水化合物和遺傳物質(zhì)組成的組。所述一個(gè)或多個(gè)探詢?nèi)莘e可小于10、1、 0. 5,0. 2,0. I或0. 05飛升(femtoliter)。通道可在分支點(diǎn)處流體地連接到2、3、4或5個(gè)下游流路。系統(tǒng)可包括由單個(gè)光源照亮的多個(gè)探詢?nèi)莘e。系統(tǒng)包括沿著直線定位的至少三個(gè)探詢?nèi)莘e。所述一個(gè)或多個(gè)光源可產(chǎn)生多個(gè)探詢?nèi)莘e。通道可以是微流控通道。物體可以由流體攜帶。通道可包括光學(xué)透明的壁。探測模塊可包括一個(gè)或多個(gè)光探測器。物體可通過電動(dòng)力流經(jīng)所述連續(xù)液體主體。分選模塊可包括配置成使物體定向到多個(gè)下游流路中的一個(gè)的多個(gè)電極。分選模塊可包括配置成使物體定向到所述多個(gè)下游流路中的所述一個(gè)的多個(gè)電極。分選模塊可包括配置成使物體定向到所述多個(gè)下游流路中的所述一個(gè)的多個(gè)電極，其中電極放置成接近切換容積高達(dá)大約0. 1、1或IOmm的距離。分選模塊可包括配置成使物體定向到所述多個(gè)下游流路中的所述一個(gè)的一個(gè)或多個(gè)閥。分選模塊可包括光鑷。 分選模塊可使物體以及不大于大約100、10、1、0. 5或0. I飛升的切換流體定向。分選模塊可使物體以及不大于大約100、50或10倍于所述一個(gè)或多個(gè)探詢?nèi)莘e的切換流體定向。在前述實(shí)施方案的任一個(gè)中，分選模塊包括現(xiàn)場可編程門陣列，其配置成接收關(guān)于物體的數(shù)據(jù)和/或返回使物體定向到所述多個(gè)下游流路中的一個(gè)的指令。現(xiàn)場可編程門陣列可解釋數(shù)據(jù)和/或在小于大約I X 10' I X 10' I X 10' I X 1(T6或I X 1(T7秒內(nèi)返回指令。本發(fā)明的另一方面提供了用于分選通道中的物體的方法，其包括(a)使物體流經(jīng)所述通道，其中用多個(gè)標(biāo)記來標(biāo)記所述物體；(b)照亮通道以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)探詢?nèi)莘e， 每個(gè)探詢?nèi)莘e由所述通道的壁和光束限制；以及(C)探測在所述一個(gè)或多個(gè)探詢?nèi)莘e的相同或不同探詢?nèi)莘e中的所述多個(gè)標(biāo)記的至少一個(gè)標(biāo)記和另一其它標(biāo)記，以產(chǎn)生所述第一標(biāo)記和第二標(biāo)記的時(shí)間相關(guān)的分辨率；以及(d)使物體定向到流體地連接到所述通道的多個(gè)下游流路中的一個(gè)。在一些實(shí)施方案中，方法還包括(a)照亮下游路徑以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)下游探詢?nèi)莘e；以及(b)探測在所述一個(gè)或多個(gè)下游探詢?nèi)莘e中的所述多個(gè)標(biāo)記的至少一個(gè)標(biāo)記。 方法還可包括基于探測到在所述一個(gè)或多個(gè)下游探詢?nèi)莘e中的至少一個(gè)標(biāo)記來使物體定向到多個(gè)次級(jí)下游流路中的一個(gè)。在前述實(shí)施方案的任一個(gè)中，物體可選自由核酸分子、蛋白質(zhì)、染色質(zhì)、生物分子、 細(xì)胞、細(xì)胞成分、碳水化合物和遺傳物質(zhì)組成的組。通道可被照亮以產(chǎn)生多個(gè)探詢?nèi)莘e。物體可被標(biāo)記有多個(gè)標(biāo)記。方法可包括探測多于兩個(gè)的不同標(biāo)記。所述一個(gè)或多個(gè)探詢?nèi)莘e可小于大約10、1、0. 5、0. 2、0. I或0. 05飛升。可光學(xué)地探測標(biāo)記。定向步驟由電動(dòng)力、光鑷或閥實(shí)現(xiàn)。物體可被分析并在小于大約1、0. 5,0. 1,0. 01,0. 001或0. 0001秒內(nèi)被定向。物體可被定向到在分支點(diǎn)處流體地連接到通道的至少2、3、4或5個(gè)下游流路中的一個(gè)。。可使用小于大約100、50或10倍于所述一個(gè)或多個(gè)探詢?nèi)莘e的切換容積使物體定向到所述多個(gè)下游流路中的所述一個(gè)。可使用小于大約1000、100、50或10倍于物體的容積的切換容積使物體定向到所述多個(gè)下游流路中的所述一個(gè)。多個(gè)下游流路中的所述一個(gè)可由現(xiàn)場可編程門陣列選擇，現(xiàn)場可編程門陣列配置成接收關(guān)于物體的數(shù)據(jù)和/或返回使物體定向到所述多個(gè)下游流路中的一個(gè)的指令。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括配置成在至少兩個(gè)限定的方向上移動(dòng)多個(gè)分子的微流控通路的設(shè)備，其中所述通路包括亞微米通道區(qū)，其中所述亞微米通道區(qū)配置成同時(shí)探詢單分子特性或在所述亞微米通道區(qū)內(nèi)的所述分子的多個(gè)分子特性，且其中所述探詢提供時(shí)間相關(guān)的單分子分辨率。亞微米通道可包括小于大約I U m的寬度和/或小于大約I U m的高度。亞微米通道可具有大約5 u m和大約500 u m的長度。設(shè)備可包括亞微米通道，其中所述亞微米通道區(qū)的一部分是光學(xué)透明的。在前述實(shí)施方案的任一個(gè)的另一方面中，本發(fā)明提供了一種設(shè)備，其中所述設(shè)備包括熔融硅石或熔融石英。在前述實(shí)施方案的另一方面中，本發(fā)明提供了一種設(shè)備，其中所述分子包括多核苷酸、蛋白質(zhì)、胎、適配子、有機(jī)分子、小有機(jī)分子或候選治療分子的一個(gè)或多個(gè)。設(shè)備可配置成探測在兩個(gè)分子或大分子或表觀遺傳修飾之間的結(jié)合。設(shè)備還可配置成提供所述多個(gè)分子在所述至少兩個(gè)限定的方向上的電動(dòng)推進(jìn)、壓力驅(qū)動(dòng)或壓力引導(dǎo)的流動(dòng)。設(shè)備還可配置成提供所述多個(gè)分子在所述至少四個(gè)限定的方向上的電動(dòng)推進(jìn)、壓力驅(qū)動(dòng)或壓力引導(dǎo)的流動(dòng)。設(shè)備還可包括接頭，其中所述接頭連接兩個(gè)或更多個(gè)、或三個(gè)或更多個(gè)微流控通路。設(shè)備可配置成檢測分子特性，其中所述分子特性選自由電荷、吸光率、熒光性、極化、分子尺寸、分子重量、分子長度、縱橫比、磁矩、電偶極矩、折射率、電導(dǎo)率和電容組成的組。在一些實(shí)施方案中，分子特性是熒光性。分子特性可以是在第一激發(fā)波長和第一發(fā)射波長處的突光性和在第二激發(fā)波長和第二發(fā)射波長處的突光性。多個(gè)分子特征可包括突光性，其中所述熒光性可包括至少兩種不同的發(fā)射波長。在一些實(shí)施方案中，設(shè)備包括至少一個(gè)激光器。設(shè)備可包括兩個(gè)激光器。設(shè)備還可包括激發(fā)濾光片、中性密度濾光片、分色鏡、熒光發(fā)射濾光片和光子探測器中的一個(gè)或多個(gè)。分色鏡可包括單頻帶分色鏡。設(shè)備可包括光纖。設(shè)備可包括光電探測器。光電探測器可以是光電倍增管或雪崩光電二極管。設(shè)備可包括物鏡或透鏡。物鏡或透鏡可以是高數(shù)值孔徑物鏡或透鏡。在一些實(shí)施方案中，設(shè)備配置成提供低自體熒光背景。在一個(gè)實(shí)施方案中，設(shè)備還包括兩個(gè)激發(fā)濾光片、兩個(gè)中性密度濾光片、兩個(gè)熒光發(fā)射濾光片、兩個(gè)分色鏡、和兩個(gè)光子探測器中的一個(gè)或多個(gè)。在另一實(shí)施方案中，設(shè)備可包括選自光電倍增管或雪崩光電二極管的兩個(gè)光子探測器。本發(fā)明提供了一種設(shè)備，其中兩個(gè)分色鏡的一個(gè)包括單頻帶分色鏡，而兩個(gè)分色鏡的另一個(gè)包括雙頻帶分色鏡。設(shè)備還可包括電啟動(dòng)的切換裝置。電啟動(dòng)的切換裝置可配置成改變所述多個(gè)分子從一個(gè)限定的方向到另一限定的方向的運(yùn)動(dòng)的方向。電啟動(dòng)的切換裝置可配置成電動(dòng)地改變所述多個(gè)分子的至少一個(gè)從一個(gè)限定的方向到另一限定的方向的運(yùn)動(dòng)的方向。電啟動(dòng)的切換裝置可通過所述多個(gè)分子的多個(gè)分子特性的同時(shí)探測來啟動(dòng)。在一些實(shí)施方案中，設(shè)備還可包括計(jì)算機(jī)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種設(shè)備，其包括流體入口、至少一個(gè)流體出口，其中所述設(shè)備配置成提供在流體入口和所述至少一個(gè)流體出口之間的可變電壓電勢， 亞微米通道包括一個(gè)或多個(gè)接頭、照明源和光電探測器；其中所述設(shè)備配置成光學(xué)地探詢多個(gè)分子的一種或多種分子特性的多個(gè)，所述多個(gè)分子布置在具有單分子分辨率的所述亞微米通道內(nèi)并穿過所述亞微米通道被電動(dòng)地推進(jìn)或壓力驅(qū)動(dòng)。光電探測器可包括一個(gè)或多個(gè)光電倍增管或雪崩光電二極管。照明源可包括一個(gè)或多個(gè)激光器。分子特性可選自由電荷、吸光率、熒光性、極化、分子尺寸、分子重量、分子長度、縱橫比、磁矩、電偶極矩、折射率、電導(dǎo)率和電容組成的組。設(shè)備還可包括邏輯設(shè)備，其中所述邏輯設(shè)備配置成探測所述多個(gè)分子中的兩種或更多種分子特性的時(shí)間符合，所述多個(gè)分子布置在具有單分子分辨率的所述亞微米通道內(nèi)并穿過所述亞微米通道被電動(dòng)地推進(jìn)或壓力驅(qū)動(dòng)。設(shè)備還可包括分選觸發(fā)器，其中所述分選觸發(fā)器配置成分選布置在具有單分子分辨率的所述亞微米通道內(nèi)并穿過所述亞微米通道被電動(dòng)地推進(jìn)或壓力驅(qū)動(dòng)的所述多個(gè)分子。可通過布置在具有單分子分辨率的所述亞微米通道內(nèi)的所述多個(gè)分子中的兩種或更多種分子特性的時(shí)間符合探測來啟動(dòng)分選觸發(fā)器。分選觸發(fā)器可通過布置在具有單分子分辨率的所述亞微米通道內(nèi)的所述多個(gè)分子中的兩種或更多種分子特性的時(shí)間符合探測來提供。設(shè)備可配置成提供時(shí)間符合探測。在前述實(shí)施方案的任一個(gè)中，設(shè)備還可包括高電壓分選執(zhí)行電路，其中所述高電壓分選執(zhí)行電路配置成改變?cè)诹黧w入口和所述至少一個(gè)流體出口的至少一個(gè)之間的電壓電勢。高電壓分選執(zhí)行電路可配置成響應(yīng)于來自分選觸發(fā)器的信號(hào)而改變?cè)诹黧w入口和所述至少一個(gè)流體出口的至少一個(gè)之間的電壓電勢。通過引用的并入在本說明書中提到的所有出版物和專利申請(qǐng)通過引用并入本文，其達(dá)到的程度如同特別且單獨(dú)地指明每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)通過引用并入。附圖簡述在所附權(quán)利要求中詳細(xì)地闡述了本發(fā)明的新穎特征。通過參考闡述例證性實(shí)施方案的下面詳述的描述將獲得對(duì)本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)的更好理解，其中本發(fā)明的原理被利用，且其中附圖圖I示出本發(fā)明的示例性分選設(shè)備的流控通道、光和電部件的結(jié)構(gòu)圖。廉價(jià)的可編程邏輯設(shè)備可用于評(píng)估光特征并提供電壓信號(hào)或“觸發(fā)器”來執(zhí)行分離。觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)變成高電壓信號(hào)，其接著重定向在流體通道中的分子運(yùn)動(dòng)的分子方向。圖2是用于分選的流體通道的光學(xué)微觀圖。該分支的通道在磨光的熔融石英襯底中被蝕刻，且蓋子被粘結(jié)以密封通道。亞微米寬度的窄區(qū)域允許在相對(duì)高濃度的溶液中的單分子的隔尚和分選。圖3是具有DNA的定向流的流控通道的熒光圖。DNA分子穿過設(shè)備的定向流動(dòng)通過在Y形接頭的分支之間切換外加電壓來實(shí)現(xiàn)。時(shí)間流逝的成像用于說明超過每分鐘1000 個(gè)分子的分子穿過接頭的高速率。圖4是由掃描電子顯微鏡成像的一個(gè)微流控通道的顯微照片。通道在寬度和高度上是大約500nm。紅圓圈被覆蓋以指示由聚焦的激光斑點(diǎn)照亮的大致區(qū)域。圖5示出使用場照明來幫助流經(jīng)流體通道的平行網(wǎng)絡(luò)的DNA的顯象的熒光光學(xué)顯微照片。左邊的圖是示出保留在流體通道內(nèi)的熒光標(biāo)記的DNA的快照。右邊的圖是示出在流動(dòng)和單分子隔離(狹窄的區(qū)域)期間同一熒光標(biāo)記的DNA的顯微照片(隨著時(shí)間消逝)。圖6示出本發(fā)明的示例性分選設(shè)備的示意圖。設(shè)備具有雙激光器誘導(dǎo)熒光探測模塊。圖7不出用于分選單個(gè)DNA分子的本發(fā)明的兩個(gè)不同實(shí)施方案的不意圖。A.電分選方法熒光標(biāo)記的染色質(zhì)從底部流到頂部，并在緊接著在Y形分離室之前的激光檢測容積中被鑒定。基于分子的顏色特征，分選觸發(fā)器控制外加電壓。在本實(shí)例中，展示主要綠色熒光的染色質(zhì)被分選到Y(jié)劈叉的右邊。B.光分選方法類似于圖7A，熒光標(biāo)記的分子在激光檢測容積中被鑒定。基于分選觸發(fā)器，粒子俘獲激光從捕獲位置(在Y分支的底部)偏轉(zhuǎn)到左或右分支中，使按需要分子定向。在本實(shí)例中，展示主要綠色熒光的染色質(zhì)-量子點(diǎn)結(jié)合物物被分選到Y(jié)劈叉的右邊，而紅色熒光結(jié)合物被分選到左邊。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的設(shè)備提供了三色探測(例如，紅、綠、黃)，其可提供具有兩種顏色(例如，紅和綠)的染色質(zhì)到一個(gè)分支的分選以及具有兩種顏色(例如，紅和黃)的染色質(zhì)到兩個(gè)分支的分選。圖8示出通過合并串行(左邊)或并行(右邊)的額外分支點(diǎn)來提供增加的分選能力的本發(fā)明的實(shí)施方案。圖9示出本發(fā)明的例證性分析和準(zhǔn)備設(shè)備的顯微照片。左邊的圖是本發(fā)明的分析設(shè)備的光學(xué)顯微照片，其中電壓梯度可被建立以使染色質(zhì)從底部移動(dòng)到頂部或從頂部移動(dòng)到底部。分選設(shè)備的中間光學(xué)顯微照片，其中分子從底部流到頂部，頂部的兩個(gè)分叉代表兩個(gè)可能的流出道。從底部到頂部流經(jīng)分選設(shè)備的T0T0-3標(biāo)記的DNA的右邊長曝光熒光顯微照片。在該圖像中，流出道的左臂中的電極被充電，使DNA定向到左收集室。注意，在右臂中的電極可由高速開關(guān)充電，高速開關(guān)被編程為對(duì)在恰好在分叉之下的檢測容積中進(jìn)行的觀察作出響應(yīng)。圖IOA示出在熔融硅石上的27個(gè)流控通道陣列的陣列。圖IOB示出流控通道的放大圖像。圖IOC示出涉及在納流控通道的橫截面內(nèi)的單分子的激光誘導(dǎo)熒光探測的示例性設(shè)置。圖IOD示出熒光數(shù)據(jù)的示例性分析輸出。數(shù)據(jù)是0. 25秒時(shí)間掃描，其使用綠色標(biāo)記的組織蛋白到紅色標(biāo)記的DNA的時(shí)間符合探測事件來說明納流控通道中的結(jié)合態(tài)天然染色質(zhì)片段。圖IlA示出分叉的納流控通道。圖IlB描繪示出進(jìn)入頂部并被主動(dòng)分選到左邊的分子的分叉通道的圖像。滿足分選條件的分子由FPGA鑒定并被穿梭到正確的分支。事件的緊湊時(shí)間分辨的記錄也被分選。圖IlC描繪示出分叉通道、探測器、現(xiàn)場可編程門陣列(FPGA)、數(shù)據(jù)記錄器和計(jì)算機(jī)以及高電壓分選執(zhí)行電路和電連接的示意圖。

圖12A示出說明使用給出的實(shí)驗(yàn)參數(shù)的收集效率的表，分子穿過單個(gè)分支前后移動(dòng)，使用吸管收集并接著使用qPCR被量化以展示 25%的分子收集效率。圖12B示出說明來自2和IOKbp片段的混合物的IOKbp片段的探測(輸入)、選擇 (分選)和收集(輸出)的時(shí)間跡線。150光子/bin的強(qiáng)度被應(yīng)用以分離片段。說明光子探測的時(shí)間跡線是頂部曲線，分選執(zhí)行是中間曲線，且輸出是底部曲線。
圖13示出描繪GFP標(biāo)記的HeLa染色質(zhì)和野生型HeLa染色質(zhì)的恢復(fù)的曲線(左) 以及描繪MBD甲基化DNA的未甲基化DNA的恢復(fù)的曲線(右)。左邊的曲線說明染色質(zhì)上 的結(jié)合核小體與存在的GFP-HeLa染色質(zhì)的量成比例地被探測到。右邊的曲線說明MBD甲 基化DNA的結(jié)合絡(luò)合物在不相關(guān)的分子的恒定水平的背景上被探測到。圖14示出描繪探測流量的表。圖15不出用于分選分子的概念布局。圖16示出說明本發(fā)明的處理順序的流程圖。圖17示出分叉流控網(wǎng)絡(luò)的電表示。圖18示出確定分叉網(wǎng)絡(luò)的電特性的示例性方程和計(jì)算。圖19示出外部電阻器的平行網(wǎng)絡(luò)的例證性覆蓋圖。圖20示出包括10 ii m(左)的微流控通道的不同設(shè)備的尺寸標(biāo)度的級(jí)數(shù)。圖21是利用可變電阻器的兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)的示意圖。圖22示出使用流控網(wǎng)絡(luò)來分離2、8和lOkbp DNA的實(shí)驗(yàn)(右)和作為脈沖群強(qiáng) 度的函數(shù)的DNA片段的相應(yīng)頻率(左)的示意圖。圖23示出本發(fā)明的示例性分子分選硬件的示意圖。固定電阻器和可變電阻器用 于便于分選。探測器和可編程邏輯設(shè)備用于提供實(shí)時(shí)分選觸發(fā)器。分選硬件還包括數(shù)據(jù)記 錄器和計(jì)算機(jī)、高電壓分選執(zhí)行電路以及電連接。圖24示出10秒分選的例子。分選條件如下100ii s bin，外加的50伏，每激光 光斑280iiW，分選閾值> 150光子/bin以及RC時(shí)間常數(shù) 1毫秒。具有> 150ph/bin的 分子的結(jié)果如下觀察到的26個(gè)分子(輸入)，滿足分選閾值的實(shí)時(shí)鑒定的23個(gè)分子(分 選)，被分選的9個(gè)分子(輸出)。圖25示出簧片繼電器與固態(tài)繼電器的比較。圖26示出具有弓形通道的示例性分選設(shè)備。圖27示出具有弓形通道和三個(gè)檢測容積的示例性分選設(shè)備。檢測容積由單個(gè)光 束照亮。圖28示出具有弓形通道的示例性分選設(shè)備的明視場光學(xué)顯微照片。標(biāo)度線是40 微米。圖29示出包含8Kbp DNA的溶液的熒光顯微照片，該溶液添加有流經(jīng)弓形通道的 Y0Y0-1并使用寬視場熒光顯微照片被觀察到。圖30示出通道電阻特征的示例性計(jì)算和實(shí)驗(yàn)測量。圖31示出觀察到的作為觸發(fā)延遲的函數(shù)的8Kbp分子的曲線。圖32示出時(shí)間相關(guān)的分選的例子。頂部曲線是在被分選的輸出中測量的光子，中 間曲線是在輸入中測量的光子，且頂部曲線是分選觸發(fā)器的啟動(dòng)。圖33示出作為時(shí)間偏移的函數(shù)的50毫秒bin中的相關(guān)事件的曲線。圖34示出高速分選的例子。頂部曲線是在被分選的輸出中測量的光子，中間曲線 是在輸入中測量的光子，且頂部曲線示出分選觸發(fā)器的啟動(dòng)。發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供了用于選定的分子和/或物體的自動(dòng)分選的系統(tǒng)、設(shè)備和方法。主題 發(fā)明一般利用流控系統(tǒng)來基于可鑒定信號(hào)分選給分子。這樣的可鑒定信號(hào)包括但不限于電、頻譜、光、熒光、電導(dǎo)率、極化、尺寸、縱橫比、折射率、磁矩和電偶極矩。本發(fā)明的設(shè)備可基于例如熒光標(biāo)記的探測來分選來自一集合的單獨(dú)分子。本文的方法和設(shè)備對(duì)分選和分析分子有廣泛的效用，所述分子通過其結(jié)合特別給出的標(biāo)記或其它可探測的特征的能力來鑒定。本文提供的設(shè)備和方法對(duì)用于鑒定具有對(duì)目標(biāo)分子的親和性的核酸分子的其它應(yīng)用也是有用的。此外，本文提供的設(shè)備和方法對(duì)鑒定用于篩選例如藥物篩選的化學(xué)庫的結(jié)合部件可能是有用的。例如，本文提供的設(shè)備和方法對(duì)鑒定結(jié)合到目標(biāo)例如治療目標(biāo) (例如，酶、激酶、蛋白酶、蛋白質(zhì)、生長因子、碳水化合物等)的核酸、適配子、小有機(jī)分子或蛋白質(zhì)可能是有用的。這可允許例如選擇潛在的藥物例如選擇性地結(jié)合治療目標(biāo)的適配子分子、結(jié)合劑例如選擇性地結(jié)合治療目標(biāo)的蛋白質(zhì)或抗體、或小有機(jī)分子或用于從絡(luò)合混合物提取特定的分子或粒子用于進(jìn)一步的分析的新的更有效的方法。系統(tǒng)、設(shè)備和方法對(duì)分析和/或分選物體特別有用。術(shù)語“物體”可指本文所述的任何分子、單分子、絡(luò)合物、細(xì)胞、細(xì)胞成分或珠子。例如，系統(tǒng)、設(shè)備和方法可用于分選分子，包括但不限于遺傳物質(zhì)、核酸(例如，DNA、RNA及其混合物)、核酸片段、蛋白質(zhì)、蛋白片段、適配子、碳水化合物、脂質(zhì)、核酸-蛋白質(zhì)絡(luò)合物、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)絡(luò)合物及其任何組合。 物體也可以是細(xì)胞、細(xì)胞成分或細(xì)胞片段。例如，系統(tǒng)、設(shè)備和方法可用于分選其它分子，包括聚合物、有機(jī)分子、小有機(jī)分子、藥物、藥物目標(biāo)和化合物。分選器也可分選粒子，例如珠子、囊泡和脂囊泡。在一些情況下，本文提供的系統(tǒng)、設(shè)備和方法可用于分選具有特定的結(jié)合蛋白質(zhì)或改變的化學(xué)狀態(tài)的核酸，用于表觀遺傳分析。在一些情況下，本發(fā)明提供對(duì)染色質(zhì)的分選，染色質(zhì)包括整體染色質(zhì)和染色質(zhì)片段和/或組織蛋白。待分選的物體可以具有各種尺寸。例如，待分選的物體一般具有小于在分選系統(tǒng)中的通道的尺寸、直徑或?qū)挾鹊某叽纭Ｔ谝恍?shí)施方案中，物體的所有尺寸可以大于通道的寬度，例如細(xì)長的核酸。如本文所述的，待分選的物體可針對(duì)內(nèi)在特性被測量，或可使用與物體絡(luò)合的另一分子來被標(biāo)記。這樣的標(biāo)記的例子包括熒光染料，例如任選地配對(duì)到核酸探針的量子點(diǎn)。可以利用的其它標(biāo)記包括添加染料，例如Y0Y0-1、T0T0-3、Syber Green、溴化乙啶。物體或樣本中的遺傳物質(zhì)可被絡(luò)合、預(yù)處理或與一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記混合。在一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳物質(zhì)被標(biāo)記有多個(gè)標(biāo)記，其中至少一個(gè)標(biāo)記特別與所述遺傳物質(zhì)上的表觀遺傳標(biāo)志物絡(luò)合，而至少一個(gè)其它標(biāo)記與所述遺傳物質(zhì)的蛋白質(zhì)和/或核苷絡(luò)合。標(biāo)記包括熒光染料、量子點(diǎn)、磁性粒子、金屬粒子和有色染料。在本文描述染料的例子。染料或標(biāo)記可被配對(duì)到結(jié)合部分，例如抗體、核酸、蛋白質(zhì)、適配子、親和鉗、肽、天然出現(xiàn)的蛋白質(zhì)和結(jié)合到所關(guān)注的目標(biāo)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。結(jié)合部分可以是特定或一般的。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)結(jié)合部分是表觀遺傳標(biāo)志所特有的，而第二個(gè)結(jié)合部分一般結(jié)合到核酸、蛋白質(zhì)或生物分子。分選的物體接著被收集、再次分選和/或進(jìn)一步分析。例如，分選的核酸分子可被恢復(fù)并具有其序列或化學(xué)特征，其使用例如DNA測序、質(zhì)量光譜測定法、ELISA、免疫沉淀反應(yīng)、雜交技術(shù)(例如，微陣列雜交)或PCR來被進(jìn)一步分析。設(shè)備本發(fā)明提供了用于分選物體的系統(tǒng)和設(shè)備。主題系統(tǒng)一般包括下面的部件通道， 其流體地連接到多個(gè)下游流路，所述通道適合于將所述物體保持在所述通道中的連續(xù)液體主體中；一個(gè)或多個(gè)光源，其配置成照亮通道以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)探詢?nèi)莘e；探測模塊，其配置成探測表示在所述一個(gè)或多個(gè)探詢?nèi)莘e中的物體的兩種不同的特性的至少兩種類型的信號(hào)；以及分選模塊，其配置成基于所述兩種類型的信號(hào)使物體定向到所述多個(gè)下游流路中的一個(gè)。圖I示出了示例性設(shè)置。例如，分選系統(tǒng)可包括流控端口或入口，其通到在分支點(diǎn)處連接到多個(gè)下游流路或通道的通道。下游流路或通道可通到另外的流控端口或出口。一個(gè)或多個(gè)探測區(qū)可位于分支點(diǎn)的上游和/或下游。探測系統(tǒng)可利用本領(lǐng)域已知的各種探測技術(shù)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，探測系統(tǒng)可利用測量光、電、放射性、聲、物理(例如，尺寸、密度、導(dǎo)熱率、彈性、粘性和強(qiáng)度)和/或磁特性的探測器。光學(xué)特性可包括發(fā)光性、熒光性、顏色、吸收性、反射比、共振和光散射。可在變化或不同的波長或頻譜處測量這些光學(xué)特性的每個(gè)。電特性可包括電導(dǎo)系數(shù)、電阻、電偶極子、電荷、阻抗或電容。也可在頻域中測量電特性。探測器可配置成測量探詢?nèi)莘e內(nèi)的信號(hào)。探測器可將所測量的信號(hào)傳輸?shù)娇删幊踢壿嬙O(shè)備，其可解釋和/或分析信號(hào)。可編程邏輯設(shè)備可向分選執(zhí)行電路提供指令，如圖 I所示，使得物體可被適當(dāng)?shù)胤诌x。可編程邏輯設(shè)備還可向數(shù)據(jù)記錄器和/或計(jì)算機(jī)報(bào)告光子計(jì)數(shù)和關(guān)于物體的分選的信息。分選的物體可在下游流路中被探測和/或分析，或在收集之后被探測和/或分析。 在下游流路中的探測和分析可用于檢驗(yàn)適當(dāng)?shù)姆诌x，或提供關(guān)于如何進(jìn)一步分選物體并將物體定向到多個(gè)次級(jí)下游流路的信息。圖8(左)示出包括可允許物體的重復(fù)分選的多個(gè)分支點(diǎn)或分叉的通道的布置。在下游流路中的探測和分析可類似于在上面描述的上游通道中執(zhí)行的探測和分析。探測技術(shù)可以是相同或不同的，且物體的相同或不同特性可被測量。 在下游流路中的探測器可將所探測的信號(hào)傳輸?shù)酵豢删幊踢壿嬙O(shè)備，或不同的可編程邏輯設(shè)備。來自可編程邏輯設(shè)備的指令可以傳輸?shù)娇稍谌魏位蛩蟹种c(diǎn)控制物體的分選的同一分選執(zhí)行設(shè)備，或可傳輸?shù)娇稍谙掠蔚暮?或相鄰于探測器的分支點(diǎn)控制物體的分選的不同分選執(zhí)行設(shè)備。物體的分選可重復(fù)以產(chǎn)生1、2、3、4、5、6、7、8個(gè)或更多個(gè)分選事件。可使用初級(jí)、 次級(jí)、三級(jí)、四級(jí)、五級(jí)、六級(jí)、七級(jí)、八級(jí)或更多通道、探測區(qū)、分支點(diǎn)和下游流路來執(zhí)行重復(fù)的分選。通道如上所述，分選設(shè)備可包括一個(gè)或多個(gè)通道或流路。可使用各種技術(shù)——包括微制造和納米制造技術(shù)一來制造通道。通道可由各種襯底一包括但不限于硅石、鏡拋熔融硅石、硅、石英、玻璃或聚合材料(例如，PDMS、塑料)制成。通道可被蝕刻、燒蝕、模制到襯底中。通道或流路可被涂覆。涂層可改變通道的特性，并可被圖案化。例如，涂層可以是疏水的、親水的、磁性的、順磁性的、傳導(dǎo)的或功能化的，取決于待分選的物體。涂層或絡(luò)合、 配對(duì)或結(jié)合到涂層的材料可展示對(duì)一種或多種類型的物體的親和性。涂層或結(jié)合到涂層的材料可減小物體對(duì)通道的粘附性。涂層材料的例子包括PTFE。通道可具有形成為像圓、 橢圓、矩形、方形、梯形、三角形、五角形或任何其它形狀一樣的橫截面。通道可具有一個(gè)或多個(gè)橫截面尺寸，例如高達(dá)大約、小于大約或大約10、20、30、40、60、80、100、200、250、400、 500、550、600、700、800、900、1000、1250、1500或3000納米的直徑、寬度和/或高度。通道的尺寸可被選擇成高達(dá)大約、大于大約或小于大約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75或100倍于待分選的物體的寬度。一個(gè)或多個(gè)通道可在一個(gè)或多個(gè)分支點(diǎn)處彼此流體地連接。一個(gè)或多個(gè)通道允許在連續(xù)液體主體中或以可逆的方式(如上所述)分選物體。分支點(diǎn)可以是分叉，其中單個(gè)上游通道在分叉點(diǎn)處連接到兩個(gè)下游流路或通道。如圖8 (左邊)所示，分選設(shè)備可具有多個(gè)分叉點(diǎn)。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)通道可在分支點(diǎn)處流體地連接到多于兩個(gè)的下游流路或通道。如圖8 (右邊)所示，分選設(shè)備可包括在分支點(diǎn)處流體地連接到四個(gè)下游流路或通道的上游通道。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，設(shè)備具有多個(gè)分支點(diǎn)，每個(gè)分支點(diǎn)具有兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或更多下游流路或通道。分支點(diǎn)可具有相同或不同數(shù)量的下游流路。分支點(diǎn)可以是T形、Y形或其任何變形。通道可以是直的或彎曲的。通道可位于兩個(gè)或三個(gè)維度中，使得所有通道在同一平面中，或相同的通道在不同平面中。通道一包括下游流路和通道一可具有相同或不同的尺寸。下游流路或通道可具有與上游通道比較相同、更高或更低的橫截面區(qū)域。通道的尺寸可被選擇成維持通道內(nèi)的流體粘性。在一個(gè)例子中，上游通道在分叉點(diǎn)處流體地連接到兩個(gè)下游通道，且每個(gè)下游通道的橫截面是上游通道的橫截面的一半。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通道可從熔融硅石晶片蝕刻以產(chǎn)生具有27個(gè)流控通道陣列的堆棧，如圖IOA所示。流控通道可具有500nm的寬度和250nm的深度，如圖IOB 所示。通道可以是微流控或納流控通道。通道和分選系統(tǒng)的其它例子可在美國專利No. 2009/0050542和2009/0234202、美國專利 No. 6，927，065,7, 405，434 和 6，833，242 以及 PCT 公布 No. W0/2010/044932 中找到， 每個(gè)專利通過引用被全部并入本文。可使用外部壓力源、內(nèi)部壓力源、動(dòng)電學(xué)、磁學(xué)或其某種組合使攜帶物體的流體或僅僅物體穿過通道而定向。外部或內(nèi)部壓力源可以是泵，例如蠕動(dòng)泵、注射泵或氣動(dòng)閥泵。電動(dòng)力可通過使用放置成與通道電相通的電極而施加到物體或攜帶物體的流體。 電滲透和壓力驅(qū)動(dòng)的流是流控制的方法或系統(tǒng)的例子，也就是說，操縱分子細(xì)胞、粒子或試劑在一個(gè)或多個(gè)方向上或進(jìn)入本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)通道的流動(dòng)。也可使用其它方法，例如電泳和介電電泳。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，流在例如從入口區(qū)穿過主通道和分支通道到達(dá)出口區(qū)的一個(gè)“前向”方向上移動(dòng)。在其它實(shí)施方案中，流的方向是雙向的。根據(jù)本發(fā)明的這些技術(shù)的應(yīng)用提供了用于分選的更快速和準(zhǔn)確的設(shè)備和方法，部分地因?yàn)榉诌x出現(xiàn)在可在探測區(qū)處或緊接著之后放置的分支點(diǎn)處或中。這提供了分子或細(xì)胞移動(dòng)的更短距離，它們可更快速地且以較小的湍流移動(dòng)，并可在單個(gè)文件中，即，一次一個(gè)被更容易地移動(dòng)、檢查和分選。在另一實(shí)施方案中，可在不能恢復(fù)地將分子或細(xì)胞交付到出口或特定的分支通道之前例如通過反轉(zhuǎn)和減慢流以重新讀取或重新分選分子或細(xì)胞(或其多個(gè))來避免潛在的分選錯(cuò)誤。在沒有被任何理論束縛的情況下，電滲透被認(rèn)為通過在兩個(gè)或更多個(gè)電極之間施加微分電壓或電荷梯度而在包含離子的流例如液體如緩沖劑中產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)。中性(不帶電的)分子或細(xì)胞可由該流攜帶。電滲透特別適合于快速改變流的路線、方向或速度。電泳被認(rèn)為產(chǎn)生流體中的帶電物體朝著相反電荷的一個(gè)或多個(gè)電極和遠(yuǎn)離相似電荷的一個(gè)或多個(gè)電極的運(yùn)動(dòng)。由于其帶電性質(zhì)(對(duì)每個(gè)基本對(duì)有2個(gè)電荷)，DNA可方便地通過適當(dāng)PH 的緩沖劑中的電泳來移動(dòng)。
在沒有被任何理論束縛的情況下，電泳被認(rèn)為產(chǎn)生介電物體的運(yùn)動(dòng)，介電物體沒有凈電荷，但有相對(duì)于彼此帶正電或負(fù)電的區(qū)域。在存在粒子例如分子、細(xì)胞或珠子的情況下交變的非均勻電場使它們變成電極化的，因此經(jīng)受介電泳力。根據(jù)粒子和懸浮介質(zhì)的介電極性，介電粒子可朝著高場強(qiáng)或低場強(qiáng)的區(qū)域移動(dòng)。例如，活細(xì)胞的極性取決于其成分、 形態(tài)學(xué)和表型，并高度依賴于所施加的電場的頻率。因此，不同類型的和在不同生理狀態(tài)中的細(xì)胞通常擁有明顯不同的介電特性，其可例如通過微分介電泳力來提供對(duì)細(xì)胞分離的基礎(chǔ)。見例如 Fiedler 等人(S. Fiedler 等人 Analytical Chemistry 70,1909-1915(1998))。操縱也可依賴于具有懸浮介質(zhì)的粒子的介電常數(shù)(介電性質(zhì))。因此，聚合物粒子和活細(xì)胞在水中以高場頻率顯示負(fù)介電電泳。例如，由水中的0. 5MV/m場(對(duì)于20微米電極間隙是10V)中的膠乳球經(jīng)受的介電泳力被預(yù)測為對(duì)于3. 4微米膠乳球?yàn)?. 2皮牛頓 (pN)到對(duì)于15微米膠乳球?yàn)?5pN(Fiedler)。這些值大部分大于在流中的球經(jīng)受的液體動(dòng)力(對(duì)于3. 4微米球?yàn)?. 3pN而對(duì)于15微米球?yàn)镮. 5pN)。因此，單獨(dú)的細(xì)胞或粒子的操縱可在流動(dòng)流體中例如在細(xì)胞分選器設(shè)備中使用介電電泳來完成。使用常規(guī)半導(dǎo)體技術(shù)， 電極可被微制造到襯底上以控制在本發(fā)明的微制造的分選設(shè)備中的力場。介電電泳特別適合于移動(dòng)是電導(dǎo)體的物體。AC電流的使用是優(yōu)選的，以防止離子的永久取向。兆赫頻率適合于提供凈取向、吸引力和在相對(duì)長的距離上的運(yùn)動(dòng)。例如Benecke (Benecke等人的美國專利 No. 5，454，472(1995))。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通道可布置成使得在分支點(diǎn)的上游和下游的通道具有平行的部分。圖26中示出示例性實(shí)施方案。在圖26中，一個(gè)輸入通道可通到分支點(diǎn)， 而兩個(gè)輸出通道可在分支點(diǎn)處連接到輸入通道。輸出通道可以是弓形的，使得輸出通道的下游部分平行于輸入通道。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，通道可布置成使得在分支點(diǎn)的上游和下游的一個(gè)或多個(gè)通道在彼此的大約或小于大約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、 55、60、65、70或75微米內(nèi)。這些布置可允許穿過通道的物體的有效的設(shè)置、照明和探測。 圖28示出這樣的布置的示例性明視場圖像。圖29示出分選系統(tǒng)的示例性實(shí)施方案的熒光圖像。在圖26中，流入和流出道可以是40微米寬。增加道的寬度可減小達(dá)到特定的分子計(jì)數(shù)率所必須的外加電壓。在一些實(shí)施方案中，10伏電勢可用于達(dá)到每分鐘500-1000個(gè)分子的計(jì)數(shù)率，這可允許使用具有10倍快的開關(guān)速度的固態(tài)繼電器，該開關(guān)速度可以在系統(tǒng)的脈沖響應(yīng)的數(shù)量級(jí)上。探測樽塊和光源分選系統(tǒng)可包括配置成測量相應(yīng)于待分選的物體的特性的信號(hào)的一個(gè)或多個(gè)探測模塊。本文所述的探測模塊可利用各種探測技術(shù)。探測模塊可探測光、電、放射性、物理 (例如，尺寸、密度、導(dǎo)熱率、彈性、粘性和強(qiáng)度)和/或磁特性。探測模塊可探詢或檢測限定的容積內(nèi)的物體。限定的容積可稱為探詢?nèi)莘e，其與術(shù)語“檢測容積和探測容積”可互換地使用。在一些實(shí)施方案中，探測容積是其中光信號(hào)被探測的光學(xué)容積。探測容積一般由照到通道上的光束的給定波長和被照通道的壁的特性限制。探測模塊可測量來自物體的一、 二、三、四、五、六種或更多種特性或信號(hào)。例如，物體可具有根據(jù)物體的狀態(tài)而改變的不同的可測量的特性。這些可測量的特性可以是物體內(nèi)在的，或可由與物體絡(luò)合的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記給予。可與物體絡(luò)合的標(biāo)記的例子包括與包含核酸的染色質(zhì)上的表觀遺傳標(biāo)志物絡(luò)合的熒光標(biāo)記的抗體。探測器的選擇可取決于所使用的標(biāo)記的類型。例如，光探測器可用于探測熒光標(biāo)記，且電導(dǎo)儀或電探測器可用于探測金屬標(biāo)記。在通過引用被全部并入本文的PCT公布 NO.W0/2010/044932中描述了電探測系統(tǒng)的例子。電探測器可包括放置在探測區(qū)域附近的電線、納米線、納米管、晶體管或電容器。電探測器可由碳、硅、碳/硅或其它半導(dǎo)體材料制成。利用物體的特性的光學(xué)探測的探測模塊可包括光探測器或光電探測器。光探測器可以是CCD、CM0S陣列、光電倍增管、雪崩光電二極管(APD)、單光子計(jì)數(shù)模塊、光敏電阻器、 光伏電池、光敏晶體管、LED和其任何組合。探測模塊可包括一、二、三、四或更多個(gè)光源。光源可包括激光器、LED、熒光燈、白熾燈、鹵素?zé)簟怏w放電燈和/或高強(qiáng)度放電燈。一個(gè)或多個(gè)光源可發(fā)射照亮一個(gè)或多個(gè)通道內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域或容積的一個(gè)或多個(gè)光束。光束可由光學(xué)部件例如高數(shù)值孔徑物鏡聚焦。照亮通道的光束可產(chǎn)生由通道的壁和光束限定的一個(gè)或多個(gè)檢測容積。光束和通道的尺寸可限定檢測容積的尺寸，如圖IOC所示。檢測容積可具有大約、高達(dá)大約、或大于大約 0. 01,0. 05,0. 1,0. 2,0. 5,0. 75、1、5、10、25、50、75 或 100 飛升的容積。術(shù)語“檢測容積” 也可稱為探詢?nèi)莘e、光學(xué)容積或探測容積。光源可在探詢?nèi)莘e內(nèi)產(chǎn)生高達(dá)大約、大約或大于大約0. 1、1、5、10、50、100、200、 280、300、500、750、1000 或 2000iiW 的光束。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)光束將不同頻譜或波長的光發(fā)射到通道中的相同或不同位置上。光束可產(chǎn)生重疊的探尋容積或不同的探尋容積。光束可具有大約、小于大約或大于大約通道的寬度的直徑。在一些實(shí)施方案中，光束可比通道的寬帶寬大約、高達(dá)大約或大于大約1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。光束的寬度可被選擇成使得通道內(nèi)的光實(shí)質(zhì)上是均勻的。探測模塊還可包括一個(gè)或多個(gè)光學(xué)部件。例如，探測模塊可包括一個(gè)或多個(gè)高數(shù)值孔徑物鏡或透鏡、光纖、反射鏡、分色鏡、光柵和共焦孔徑。光源、探測器和光學(xué)部件的布置可允許一、二、三、四、五、六或更多個(gè)信號(hào)的探測。該探測可以是同時(shí)的或時(shí)間相關(guān)的。 時(shí)間相關(guān)的分辨率和/或精確度可以高達(dá)大約或大約0. 0001,0. 0005,0. 001,0. 005,0. 01、 0. 05,0. 1,0. 5、1、5、10、50、100、500 或 1000 毫秒。本發(fā)明的設(shè)備可配置成使得多個(gè)檢測容積可由單個(gè)光源照亮。作為例子，圖27的設(shè)備可包括沿著直線定位的至少三個(gè)檢測容積。作為例子，圖27示出包括由單個(gè)光束照亮的三個(gè)平行通道的設(shè)備。單個(gè)光束可由橢圓透鏡改變來產(chǎn)生橢圓光束。穿過這三個(gè)檢測容積的物體可接著由一、二、三、四或更多個(gè)探測器測量。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)檢測容積由單個(gè)探測器測量。在一些實(shí)施方案中，兩個(gè)或更多個(gè)檢測容積由單個(gè)光束照亮，且每個(gè)檢測容積由單個(gè)探測器監(jiān)控。如圖27所示的設(shè)備可具有w形或弓形通道。這可允許輸入和輸出的同時(shí)或時(shí)間相關(guān)的探測。這可提供分選性能的原位檢驗(yàn)，并可提供反轉(zhuǎn)流并校正不適當(dāng)?shù)姆诌x出現(xiàn)的情況的能力。在一些實(shí)施方案中，允許同時(shí)或時(shí)間相關(guān)的探測的這樣的通道可具有斜角或銳角分叉、帶有多個(gè)分支點(diǎn)的蛇形通道、以及圓對(duì)稱的輸入通道。圓對(duì)稱的輸入通道可便于檢測容積的Cd播放器型讀出。
沿著公共軸和/或維持每個(gè)檢測容積之間的小距離的多個(gè)檢測容積例如二、三、 四或更多個(gè)檢測容積的布置可減小在自由空間光學(xué)設(shè)置中的光束與通道調(diào)準(zhǔn)時(shí)間和容差。 緊湊結(jié)構(gòu)減小對(duì)旋轉(zhuǎn)中的未調(diào)準(zhǔn)和流控設(shè)備在X或y (平面中)方向上相對(duì)于共焦檢測容積(或光學(xué)設(shè)置)的機(jī)械偏移的敏感性。這可允許提高的調(diào)準(zhǔn)穩(wěn)定性、信噪比中的系統(tǒng)化變化的減小、以及較長的持續(xù)時(shí)間實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明的設(shè)備可布置成使得穩(wěn)定的測量可在大約或大于大約 1、5、10、15、25、30、35、50、60、90、180、270、360、480 或 960 分鐘的過程內(nèi)進(jìn)行。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，光源和/或探測器可與流控設(shè)備集成。集成的光源和探測器可包括集成的波導(dǎo)、LED、激光二極管或等離子聚焦蝴蝶領(lǐng)結(jié)。在其它實(shí)施方案中， 探測是電的，并可包括可位于流控通道內(nèi)或背面附近的集成電極。一個(gè)或多個(gè)探測器可配置成將關(guān)于一個(gè)或多個(gè)所探測的信號(hào)的信息傳輸?shù)教幚砥鳌Ｌ幚砥骺梢允强删幊踢壿嬙O(shè)備、計(jì)算機(jī)、或可記錄或解釋信號(hào)的任何其它部件。處理器可以是本文所述的分選模塊的部件。如圖I所示，探測激光器可恰好位于分支點(diǎn)的上游。探測激光器可照亮通道以產(chǎn)生檢測容積。如圖I所示，高速光電探測器可探測從探詢區(qū)發(fā)射的光并將光轉(zhuǎn)換成光子計(jì)數(shù)。 光子計(jì)數(shù)可傳輸?shù)娇删幊踢壿嬙O(shè)備。可編程邏輯設(shè)備可解釋光子計(jì)數(shù)并確定物體如何基于光子計(jì)數(shù)來分選。分詵樽塊分選系統(tǒng)可包括分選模塊，其解釋由探測模塊測量的一個(gè)或多個(gè)信號(hào)和/或使物體定向到多個(gè)下游通道或流路的一個(gè)。由探測模塊或探測器傳輸?shù)男畔⒖捎商幚砥鹘邮铡?處理器可以是計(jì)算機(jī)或可編程邏輯設(shè)備，例如現(xiàn)場可編程門陣列(FPGA)、PAL、GAL或CPLD。 處理器可在大約、高達(dá)大約或大于大約15、25、50、60、75、100、200、500、1000或2000Hz、MHz 或GHz處操作。在一些實(shí)施方案中，處理器是可解釋數(shù)據(jù)并在小于大約1X10_2、2X10_2、 I X 10' I X 10' I X 10' I X I(T6或I X 1(T7秒內(nèi)返回指令的FPGA0處理器可被編程為接收所測量的信號(hào)并使物體定向到多個(gè)下游流路中的一個(gè)。用于將物體分選到一個(gè)路徑或另一個(gè)的條件可由用戶經(jīng)由計(jì)算機(jī)系統(tǒng)或另一設(shè)備上的用戶界面編程到處理器中。用于分選物體的條件可包括二、三、四、五、六或更多個(gè)信號(hào)的同時(shí)或時(shí)間相關(guān)的探測。在預(yù)先選擇的閾值之上的多于一、二、三、四、五、六或更多個(gè)信號(hào)的探測可用于區(qū)別物體。在一些實(shí)施方案中，信號(hào)相應(yīng)于物體的光、電、磁、放射性或物理特性。所測量的信號(hào)可表示物體的不同特性。處理器可解釋數(shù)據(jù)以確定如何分選物體并將指令傳輸?shù)椒诌x執(zhí)行器。處理器可解釋在位于上游通道中的一個(gè)探詢?nèi)莘e處獲得的數(shù)據(jù)，并將指令提供到分選執(zhí)行器以在一、 二、三、四、五或更多個(gè)分支點(diǎn)處使物體定向到多個(gè)下游流路中的一個(gè)。處理器可解釋在一個(gè)探詢?nèi)莘e處獲得的數(shù)據(jù)，并將指令返回到分選執(zhí)行器以在緊鄰探詢?nèi)莘e和/或在探詢?nèi)莘e下游的分支點(diǎn)處使物體定向到多個(gè)下游流路中的一個(gè)。分支點(diǎn)可以是遠(yuǎn)離探詢?nèi)莘e的已知的距離、容積或時(shí)間。在探詢?nèi)莘e和分支點(diǎn)之間的距離、容積或時(shí)間的精確知識(shí)可允許物體的準(zhǔn)確和/或精確的分選。在探詢?nèi)莘e和分支點(diǎn)之間的距離、容積或時(shí)間的減小可增加分選的精確度和/或準(zhǔn)確度。分選執(zhí)行器可通過改變物體的軌跡或流路來執(zhí)行物體的分選。分選執(zhí)行器也可改變物體或攜帶物體的流體的軌跡或流路。分選執(zhí)行器可通過物理地改變通道內(nèi)的流路和下游流路或通過傳遞磁性、電或光學(xué)力來分選物體。在一些實(shí)施方案中，分選執(zhí)行器可包括傳遞在物體上的電動(dòng)力的一個(gè)或多個(gè)電極。可選地，分選執(zhí)行器可包括改變攜帶物體的流體的流路的一個(gè)或多個(gè)閥。閥可以是氣動(dòng)閥、機(jī)械閥、磁性閥、旋轉(zhuǎn)閥、液壓閥、壓電閥、梭式閥、彈性閥和電閥。在一些實(shí)施方案中，電極也可用于改變攜帶物體的流體的流路。靜電學(xué)可用于改變物體的流路。光鑷也可用于通過將物體放置在一位置上以沿著多個(gè)下游流路中的一個(gè)流動(dòng)或使物體朝著多個(gè)下游流路中的一個(gè)偏轉(zhuǎn)來改變物體的流路。光鑷可在本發(fā)明中用于使用聚焦的光束例如激光器來俘獲和移動(dòng)物體，例如分子或細(xì)胞。圖I示出了利用電動(dòng)力的分選系統(tǒng)。每個(gè)電極可位于分支點(diǎn)的大約、小于大約或大于大約0. 01,0. 5、1、2、5、10、20、50、75、100、200或300mm內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，電極位于探詢?nèi)莘e和/或切換容積之外。一組電極可用于使物體沿著通道定向，而第二組電極可用于使物體選擇性地定向到多個(gè)下游流路中的一個(gè)。第二組電極可放置成極接近于分支點(diǎn)，或可位于僅僅一個(gè)分支點(diǎn)周圍。特定電極的使用可允許利用多個(gè)串行放置的分支點(diǎn)來分選系統(tǒng)中的物體。除了由通道內(nèi)的流體提供的電連接以外，分選物體還可包括電極之間的電連接。 例如，外部電阻器可放置在流控通道的入口和出口之間，如圖23所示。外部電阻器的使用可允許在分選物體時(shí)增加的精確度和準(zhǔn)確度。外部電阻器還可減小分選物體所需的電壓。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，分選模塊可包括繼電器。繼電器可以是固態(tài)繼電器和/或簧片繼電器。繼電器可用于切換施加在多對(duì)電極對(duì)的一對(duì)之間的電壓。如圖25所示，簧片繼電器和固態(tài)繼電器具有相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，處理器可包括濾波功能。濾波功能可減小噪聲并便于數(shù)據(jù)解釋。濾波功能可以是求和或卷積濾波器。在一些實(shí)施方案中，求和或卷積濾波器使用大約、小于大約或大于大約1、2、3、4、5、6、7、8、9或IObin的窗口。bin可以是大約、小于大約或大于大約1、5、10、25、50、100、150、200、250、500、750或1000微秒、毫秒或秒的時(shí)間幀。求和濾波器可對(duì)在5bin的窗口內(nèi)的所關(guān)注的大約Ibin的信號(hào)求和。其它濾波器可對(duì)在5bin的窗口內(nèi)的所關(guān)注的大約Ibin的信號(hào)求和并被bin的數(shù)量除。分選系統(tǒng)的電子設(shè)備可包括可調(diào)節(jié)分選執(zhí)行繼電器。可調(diào)節(jié)分選執(zhí)行繼電器可在分選應(yīng)出現(xiàn)時(shí)便于通過允許用戶調(diào)節(jié)時(shí)間來分選物體，而不改變探詢?nèi)莘e的位置。這可對(duì)涉及靜態(tài)配置中的光學(xué)器件和流控的實(shí)驗(yàn)設(shè)置是重要的。繼電器可被編程為在一范圍之間。該范圍可以在0到3、6、9、10、12、12. 8、15、18或更多毫秒之間。增量可以是大約、小于大約或大于大約 0. 01,0. 1、1、5、10、20、25、50、75、100、125、150、175、200、250、500、750 或 1000微秒。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)分選系統(tǒng)可以可操作地連接到具有用戶界面的計(jì)算機(jī)，用戶界面用于控制分選系統(tǒng)(例如，探測模塊和分選模塊)、給可編程邏輯設(shè)備編程并顯示結(jié)果。計(jì)算機(jī)可以是主題分選系統(tǒng)的整體部分或分離的部分。用戶界面可以是圖形用戶界面。用戶界面可通過探測器顯示測量、物體的分析和物體的分選，這可以是實(shí)時(shí)的。用戶界面可允許選擇操作條件， 例如電壓梯度、分選條件、信號(hào)閾值、總分選時(shí)間、光源功率和探測器校準(zhǔn)。操作條件可使用鍵盤、鼠標(biāo)或其它輸入設(shè)備來輸入。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，分選系統(tǒng)包括用于分選在分選期間由處理器和/或探測器傳輸?shù)臄?shù)據(jù)的存儲(chǔ)模塊。存儲(chǔ)模塊可在分選期間或在分選之后被訪問以取回在分選期間收集的數(shù)據(jù)。方法本發(fā)明提供了用于基于物體的一個(gè)或多個(gè)特性來分選物體的方法。特性可以是本文所述的特性的任一個(gè)。待分選的物體流到主題系統(tǒng)的通道中。當(dāng)測量物體的一個(gè)或多個(gè)特性時(shí)，物體基于所測量的一個(gè)或多個(gè)特性被自動(dòng)選擇并定向到多個(gè)下游流路中的一個(gè)。 物體的分選可在物體懸浮在可被可逆地分選的連續(xù)流體主體中時(shí)出現(xiàn)。可使用本文所述的相應(yīng)類型的測量來執(zhí)行特性的測量。例如，可使用光探測系統(tǒng)來測量光學(xué)特性的測量，并使用電探測系統(tǒng)來測量電特性。在通過引用被全部并入本文的PCT公布No. W0/2010/044932 中描述了電探測系統(tǒng)的例子。可在探詢?nèi)莘e內(nèi)執(zhí)行物體的特性的測量。在一些實(shí)施方案中， 探詢?nèi)莘e通過通道的照明來產(chǎn)生并由光束的尺寸和通道的壁來限定。物體的分選可基于物體的一、二、三、四、五、六或更多個(gè)不同的特性。在一些實(shí)施方案中，分子可通過串行地放置的多個(gè)分支點(diǎn)來分選，分支點(diǎn)由也串行地放置的多個(gè)探詢?nèi)莘e創(chuàng)建。分子的準(zhǔn)確分選也可使用放置在分支點(diǎn)的下游的探詢?nèi)莘e來檢驗(yàn)。包含待分選的物體和其它材料的樣本可被認(rèn)為是分選系統(tǒng)的輸入貯庫。物體的濃度可以是大約、高達(dá)大約或大于大約1、5、10、20、50、100、200、30、500、750或1000納摩爾、 微摩爾或毫摩爾。在一些實(shí)施方案中，樣本可以被稀釋到一濃度，使得在預(yù)先選擇的時(shí)間段內(nèi)在探詢?nèi)莘e內(nèi)的分子的期望值是0. 5、1、2、5或10。預(yù)先選擇的時(shí)間段可以是0. 001、
0.005,0. 01,0. 05,0. 1,0. 5、1、5、10、50、100、500 或 100 毫秒。樣本中的物體可被絡(luò)合、預(yù)處理、或與一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記混合。標(biāo)記包括熒光染料、 量子點(diǎn)、磁性粒子、金屬粒子和有色染料。本文描述了染料的例子。染料可被配對(duì)到結(jié)合部分，例如抗體、核酸、蛋白質(zhì)或適配子。結(jié)合部分可以是特定或一般的。在一些實(shí)施方案中， 一個(gè)結(jié)合部分是表觀遺傳標(biāo)志所特有的，而第二個(gè)結(jié)合部分一般結(jié)合到核酸、蛋白質(zhì)或生物分子。在一些實(shí)例中，可使用相應(yīng)于第一種特性的兩種一般染料和一種特定染料。這可考慮自由染料、沒有第一特性的物體和有第一特性的物體之間的區(qū)別。在其它實(shí)施方案中， 可使用兩中一般染料和兩種特定染料，其中第一特定染料相應(yīng)于第一特性，而第二特定染料相應(yīng)于第二特性。除了探測自由染料、沒有第一特性的物體和有第一特性的物體之外，這還可允許既沒有第一特性也沒有第二特性的物體、有第二特性的物體、沒有第二特性的物體以及有第一特性和第二特性的物體的探測。在一些實(shí)施方案中，樣本由分選系統(tǒng)處理，而不移除自由染料和/或自由標(biāo)記。可適當(dāng)?shù)赜煞诌x系統(tǒng)通過使用多種特性的時(shí)間相關(guān)的或同時(shí)的探測來分選自由染料和/或自由標(biāo)記。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，在分選之前從樣本移除自由染料和/或自由標(biāo)記。 在樣本中的自由染料和/或自由標(biāo)記的濃度可以是與物體絡(luò)合的自由染料和/或自由標(biāo)記的濃度的大約、小于大約或大于大約 0. 01,0. 05,0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9、
1、2、3、4、5、6、7、9、10、15、30、50倍。Ml在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了可以是微流控或納流控的設(shè)備，其對(duì)各種分子特性——包括但不限于熒光例如量子點(diǎn)熒光特征——的同時(shí)或時(shí)間相關(guān)的探測是有用的。 如本文所述的，可使用各種探測技術(shù)來測量物體的特性。探測模塊可探測光、電、放射性、物理(例如，尺寸、密度、導(dǎo)熱率、彈性、粘性和強(qiáng)度)和/或磁特性。在一些情況下，本發(fā)明提供了適合于分析目的的納流控設(shè)備。熒光特征可被實(shí)時(shí)地觀察到，且事實(shí)上被用作觸發(fā)事件來控制如本文提供的分選方法。可用同時(shí)或時(shí)間相關(guān)的方式探測物體的特性。同時(shí)探測可通過在時(shí)間上的一個(gè)時(shí)刻測量物體的一種或多種特性而出現(xiàn)。例如，可在單個(gè)探詢?nèi)莘e或重疊的探詢?nèi)莘e中測量相應(yīng)于兩個(gè)不同的標(biāo)記的光的兩個(gè)波長。可選地，可在不同的時(shí)間測量物體的兩個(gè)或更多個(gè)特性。這可被執(zhí)行，如果在通道內(nèi)的物體在沿著通道移動(dòng)時(shí)的位置可被知道、預(yù)測或估計(jì)。例如，可在位于第二探詢?nèi)莘e的上游的第一探詢?nèi)莘e處測量第一特性，在第二探詢?nèi)莘e處物體的第二特性被測量。來自第一探詢?nèi)莘e和第二探詢?nèi)莘e的信號(hào)的相關(guān)性可基于物體穿過通道的速度和在兩個(gè)通道之間的距離。以這種方式，物體的2、3、4、5、6、7、8、9種或更多種特性可同時(shí)地或以時(shí)間相關(guān)的方式來測量。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，可反轉(zhuǎn)物體的流動(dòng)。這可允許對(duì)單個(gè)探詢?nèi)莘e內(nèi)的物體進(jìn)行多于一次的測量。可選地，多個(gè)探詢?nèi)莘e可放置在分支點(diǎn)之前的通道中，以便在分選事件之前對(duì)物體執(zhí)行相同特性的多次測量。例如，二、三、四、五、六、七或更多個(gè)探詢?nèi)莘e可位于分支點(diǎn)的下游，從而允許用于確定如何分選物體的相同的二、三、四、五或更多種特性的多次測量。公選物體的探測和實(shí)時(shí)評(píng)估和/或物體的收集可由本發(fā)明的分選模塊執(zhí)行。物體的分選可基于在探測期間測量的一、二、三、四、五種或更多種特性。可同時(shí)或以時(shí)間相關(guān)的方式來測量特性。處理器可用于解釋對(duì)物體收集的數(shù)據(jù)并確定物體的期望流路。頻譜或其它單個(gè)分子特征的探測和實(shí)時(shí)評(píng)估和/或這些特定分子的分離和收集可由本發(fā)明的分選模塊執(zhí)行。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的設(shè)備和方法提供在設(shè)備的高度限制的結(jié)構(gòu)(流控通道、鈉米孔或其它方面)內(nèi)檢查的在時(shí)間和頻譜上符合的特征的聯(lián)機(jī)評(píng)估。使用這些符合特征的單分子分離可提供顯著的特征，例如分離與蛋白質(zhì)結(jié)合的特定序列的核酸或在其它生物種類或偽熒光污染的存在下分離分子的能力，都具有極其低的假陽性探測率。這樣的實(shí)現(xiàn)的一個(gè)例子是鑒定對(duì)在染色質(zhì)中結(jié)合的組織蛋白的罕見表觀遺傳修飾。本發(fā)明的設(shè)備提供了穿過通道移動(dòng)的序列的明確鑒定，并提供通過分離對(duì)這些分子的選擇，即使在存在其它細(xì)胞碎片和常常伴隨染色質(zhì)鏈的蛋白質(zhì)的情況下。在一些實(shí)施方案中，在本發(fā)明的設(shè)備中可一次分析、分選、并檢驗(yàn)一個(gè)物體。例如， 一個(gè)物體可進(jìn)入上游檢測容積，被探測、分選到多個(gè)下游通道的一個(gè)，并接著在隨后的物體進(jìn)入上游檢測容積之前在下游通道中被檢驗(yàn)。在其它實(shí)施方案中，可一次分析、分選并檢驗(yàn)多于一個(gè)的物體。例如，第一個(gè)物體可進(jìn)入上游檢測容積，而第二個(gè)物體可在第一個(gè)物體被分選或檢驗(yàn)之前進(jìn)入同一上游檢測容積。一次分析單個(gè)物體可稱為同步探測，而一次分析多個(gè)物體可稱為異步探測。異步探測可增加分選的速率。物體可單獨(dú)地或連同攜帶物體的流體一起被分選，也稱為切換容積。在設(shè)備利用閥來控制攜帶物體的流體的流動(dòng)的情況下，閥選擇性地將物體分選到多個(gè)下游流路之一的定時(shí)可改變連同物體一起被分選的流體的量。當(dāng)流體經(jīng)過分支點(diǎn)被發(fā)送到下游流路時(shí)，切換容積可以與物體一起被分選。切換容積可不大于大約0. 2、1、5、7. 5、10、25、50、75、100、 200、300、500、750、1000、2500、5000或10000飛升。切換容積可不大于物體的容積的大約 I、10、50、100、500、1000、5000、10000、50000倍。切換容積可不大于探詢?nèi)莘e的容積的大約
1、10、50、100、500、1000、5000、10000、50000倍。如果物體已知在大約100飛升的流體的容積內(nèi)，則切換容積可以是100飛升。如果物體已知在大約10飛升的流體的容積內(nèi)，則切換容積可以是10飛升。如果物體被定向到多個(gè)通道之一而不移動(dòng)周圍的流體，則切換容積可以是大約或小于大約0、0. 001,0. 005或0. 01飛升。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，分選可增加物體的濃度。濃度可增加大約或大于大約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多的量級(jí)。物體的增加的濃度可通過使用低切換容積來獲得。例如，如果樣本包含在ImL溶液中的待分選的1000個(gè)物體且切換容積是100飛升，100個(gè)待分選的物體將被分選，每個(gè)有100飛升。因此，將在具有相應(yīng)于8個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度的10000飛升或I X KT8HiL的貯庫中收集100個(gè)物體。常規(guī)分選方法常常涉及以數(shù)十毫秒時(shí)間尺度或更慢的速率移動(dòng)的閥和門。然而， 本發(fā)明提供了超過2 X IO3個(gè)分子/min、3X IO3個(gè)分子/min、5X IO3個(gè)分子/min、2X IO4個(gè)分子/min、5 X IO4個(gè)分子/min、I X IO6個(gè)分子/min、2 X IO6個(gè)分子/min、6 X IO6個(gè)分子/ min、7X IO6個(gè)分子/min、I X IO7個(gè)分子/min或更高的高流量探測。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是提供所探測的分子或事件的高速分選的能力。本發(fā)明提供對(duì)分子的電和光軌跡施加控制的兩種高速分選方法。這些分選方法可使用用于分選的分岔或Y形分離室在納流控和/ 或微流控通道中實(shí)現(xiàn)。在一些情況下，本發(fā)明的設(shè)備合并串行或平行的額外的分支點(diǎn)，如果需要，進(jìn)一步增加分選能力(圖8)。在本發(fā)明中，展示了超過2，000個(gè)分子/min的高流量計(jì)數(shù)，且這可更進(jìn)一步地增加。因此，高速分選方法是根本的。至少兩種高速分選方法可用于對(duì)分子的軌跡施加控制， 那些軌跡是電和光的。這些分選方法可使用用于分選的分岔(例如，Y形)分離室中在納流控通道中實(shí)現(xiàn)。可合并串行或平行的額外的分支點(diǎn)，如果需要，進(jìn)一步增加分選能力。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，分子例如核酸穿過Y形通道被電動(dòng)地驅(qū)動(dòng)，Y形通道提供分選和收集特定的分子的機(jī)會(huì)。對(duì)分子分選所需的設(shè)備和方法實(shí)質(zhì)上是不同的，如對(duì)單獨(dú)分子的快速檢測和分選所需的。如本文所示的，本發(fā)明提供了用于制造和使用可被電啟動(dòng)的設(shè)備的方法，該設(shè)備使染色質(zhì)穿過分選室流動(dòng)。在一些情況下，兩種不同的熒光染料的符合探測可用于鑒定所關(guān)注的分子。在一些情況下，本發(fā)明的方法規(guī)定使用一種染料或標(biāo)記來標(biāo)記分子例如DNA，以及使用另一染料或標(biāo)記來標(biāo)記特定蛋白質(zhì)、甲基化狀態(tài)或所關(guān)注的其它標(biāo)志或修飾。在其它情況下，使用一種標(biāo)記來標(biāo)記治療目標(biāo)，而使用另一標(biāo)記來標(biāo)記包含小分子、肽、蛋白質(zhì)或適配子(其中一些可結(jié)合到該目標(biāo))的用于藥物篩選的化學(xué)庫。兩種不同標(biāo)記的符合探測可用于鑒定結(jié)合到治療目標(biāo)的來自化學(xué)庫的分子。被鑒定為結(jié)合到目標(biāo)的這樣的分子可接著被鑒定為用于治療發(fā)展的候選治療法或候選導(dǎo)聯(lián)。在這些修飾中，對(duì)通過本發(fā)明的設(shè)備和方法的探測、分選和分析有用的是DNA甲基化和各種組蛋白改變，包括標(biāo)記沉默基因的組蛋白H3第27位賴氨酸(H3K27)的三甲基化、以及組蛋白H3第4位賴氨酸(H3K4)的三甲基化。DNA甲基化在以小鼠植入前胚胎開始的發(fā)展期間被生動(dòng)地重塑。關(guān)于H3K27和H3K4甲基化狀態(tài)如何在胚胎中變化知道得很少，然而使用ES細(xì)胞的工作提議，這兩種標(biāo)記同時(shí)存在于染色質(zhì)上是干細(xì)胞的基本特征，且當(dāng)區(qū)分細(xì)胞時(shí)，保留一個(gè)標(biāo)志或另一標(biāo)志。本發(fā)明提供了納米制造的設(shè)備，其可分選在尺寸上超過50kbp的單獨(dú)的DNA片段， 在多色(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多)熒光顯微鏡下分析它們，并收集揭示以大約 IOObp的分辨率的沿著DNA鏈的熒光信號(hào)強(qiáng)度的數(shù)據(jù)。這些方法可例如用于表征在小鼠植入前胚胎中的染色質(zhì)狀態(tài)。在一些實(shí)施方案中，染色質(zhì)可被隔離、對(duì)照RNA聚合酶II被標(biāo)記有熒光抗體、三甲基化H3K27和三甲基化H3K4。可接著針對(duì)這些蛋白質(zhì)的存在和空間位置使用本文提供的方法和設(shè)備來分析單獨(dú)染色質(zhì)模板。本文的方法和設(shè)備規(guī)定以空前的敏感度和分辨率確定在整個(gè)基因組和在小鼠植入前胚胎中轉(zhuǎn)錄的懸著的基因處的染色質(zhì)狀態(tài)。本發(fā)明的方法提供了可調(diào)節(jié)分析執(zhí)行延遲的調(diào)節(jié)。改變可調(diào)節(jié)分選延遲或觸發(fā)延遲的響應(yīng)的例子在圖31中示出。在圖31中，2和8Kpb片段的混合物被輸送到輸入通道。 在穩(wěn)定的設(shè)置中在大約25分鐘的時(shí)間段內(nèi)測量片段的分選。分選閾值是300，且脈沖寬度是10毫秒。在分選中存在過渡(這里是大約3-4ms)的點(diǎn)可依賴于分叉區(qū)和繼電器開關(guān)時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，可基于與進(jìn)入輸入通道的物體比較的在每個(gè)通道中分選的物體的測量來測量分選模塊的準(zhǔn)確度。被分選的物體可按照下游探詢?nèi)莘e來測量，且進(jìn)入輸入通道的物體可按照上游探測容積來測量。上游和下游對(duì)于將輸入通道連接到兩個(gè)或更多個(gè)下游通道的分支點(diǎn)是相對(duì)的。在一些實(shí)施方案中，物體中的損失或增益可以是大約或小于大約 0. 01,0. 1,0. 5、1、2、3、4、5、5、6、7、9 或 10%。電分詵在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，電分選用于基于事件或分子特性的探測來分選分子。本發(fā)明提供了可快速切換施加到分岔流體通道的電壓以將所關(guān)注的分子分離到收集容積中的設(shè)備。流體系統(tǒng)電切換的適當(dāng)設(shè)計(jì)允許快速探詢?cè)诜诌x系統(tǒng)中的大量分子。在一些情況下，電分選可在本發(fā)明的方法和設(shè)備中用于基于多個(gè)事件的同時(shí)探測來分選。例如，兩個(gè)不同的熒光發(fā)射的同時(shí)(即，時(shí)間符合)探測可觸發(fā)所關(guān)注的分子的分選。在一些情況下，兩種不同的熒光發(fā)射的時(shí)間符合探測可用于電分選染色質(zhì)或其它絡(luò)合生物分子。例如，可使用施加到設(shè)備的貯庫的電壓電動(dòng)地引起染色質(zhì)穿過納流控設(shè)備的流動(dòng)。可在寬范圍內(nèi)以極好的準(zhǔn)確度來控制在這些設(shè)備內(nèi)部的分子的流速。流速可被控制到大約或好于大約 0. 00001,0. 00005,0. 0001,0. 0005,0. 001,0. 005,0. 01,0. 05,0. 1,0. 5、1、 5、10、50、100、500、1000、5000或10，000乩/8或U L/s的準(zhǔn)確度。流速可以是大約。小于大約或大于大約 0. 00001,0. 00005,0. 0001,0. 0005,0. 001,0. 005,0. 01,0. 05,0. 1,0. 5、1、5、 10、50、100、500、1000、5000 或 10，000fL/s 或 u L/So 這不僅提供增加分子(例如，DNA 或染色質(zhì))流量的速率的機(jī)會(huì)，而且允許使用用于快速單子分選的電方法。Y形分離室(即， 接頭)可放置在緊接著探測區(qū)——公認(rèn)的“道路中的岔路”——之后。流速可增加，并通過暫時(shí)增加岔路的相應(yīng)部分中的電壓偏置來優(yōu)先被定向到岔路的一個(gè)分支或另一分支。以這種方式，分子朝著期望路徑被分選，用于可能的再捕獲。該控制方法可應(yīng)用于任何帶電的分子，例如核酸，包括DNA或染色質(zhì)片段。例如，該方法可應(yīng)用于結(jié)合到抗體交聯(lián)的熒光團(tuán)的 DNA或染色質(zhì)片段，抗體交聯(lián)的熒光團(tuán)報(bào)告表觀遺傳狀態(tài)，例如交聯(lián)到對(duì)特定的甲基化蛋白質(zhì)(例如甲基化組蛋白)或DNA序列的抗體或?qū)θ绫疚奶峁┑腞NA pol II的抗體的熒光團(tuán)。圖7示出了使用電分選的設(shè)備的設(shè)計(jì)。圖I示出利用電動(dòng)力的分選模塊。如圖I所示，電極與通道的流體入口和出口電接觸。分選執(zhí)行器可切換施加到在(a)入口和第一出口以及(b)入口和第二出口之間的通道的電壓。如果分選系統(tǒng)具有多個(gè)分支點(diǎn)，如圖8(左)所示，分選執(zhí)行器可切換施加到在入口和四個(gè)下游出口之一之間的通道的電壓。在一些實(shí)施方案中，電壓梯度可施加到入口和多于一個(gè)的出口。可基于待分選的物體的有效電荷來選擇電壓梯度的方向。可基于期望的物體速度、物體的有效電荷、物體的尺寸、圍繞物體的流體或緩沖劑的條件以及電極之間的距離來選擇電壓梯度的幅值。電執(zhí)行的分選的操作或速度限制可取決于通道的電阻和電容。圖30和圖18中給出了通道的電特性的示例性計(jì)算和測量。雙層效應(yīng)可影響給定系統(tǒng)的測量電阻和理論電阻。在弓形流控設(shè)備中，如圖26所示，可施加在輸入流控貯庫處的電壓脈沖，且可使用電流前置放大器來測量在輸出流控貯庫之一處的電流響應(yīng)。在IX 10_7安培/伏特的增益設(shè)置處，觀察到的穩(wěn)態(tài)離子電流可為大約或近似120pA。電容限制的開關(guān)時(shí)間可以是大約40微秒。在一些實(shí)施方案中，可以通過改變?cè)O(shè)備和將電壓梯度施加到設(shè)備的電部件的電特性來改變電容限制的開關(guān)時(shí)間。例如，前置放大器可具有30微秒上升時(shí)間限制。開關(guān)時(shí)間可以是大約或小于大約 0. 0001,0. 001,0. 01,0. 01,0. 1、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、70、 80、90或100微秒。前置放大器可具有大約或小于大約0. 01、0. 1、1、2、3、4、5、10、15、20、30、
40、50、60、70、80、90或100微秒的上升時(shí)間限制。光分詵光分選涉及使用強(qiáng)激光束來保持或“鉗出”在介質(zhì)例如氣體或液體中的一個(gè)或多個(gè)粒子。使用強(qiáng)紅外激光器，為了最小化對(duì)所探詢的粒子或分子例如核酸(例如DNA或 RNA)或蛋白質(zhì)以及高數(shù)值孔徑光學(xué)器件的光損壞，為了產(chǎn)生緊密約束的光學(xué)電勢壁，熒光團(tuán)(例如，量子點(diǎn))_分子結(jié)合物可被捕獲。該技術(shù)可在本發(fā)明的設(shè)備內(nèi)部由本發(fā)明的方法應(yīng)用。例如，光分選技術(shù)可在Y形分離室內(nèi)部被應(yīng)用，且激光位置可被偏轉(zhuǎn)以控制粒子軌跡用于分選。可通過本發(fā)明的方法在本發(fā)明的納流控設(shè)備中的單分子水平處使用熒光團(tuán)、粒子或量子點(diǎn)的介電特性來執(zhí)行光分選。在一些情況下，可使用恒定施加的電壓對(duì)在限定的方向上經(jīng)過激光器的分子流執(zhí)行該分選技術(shù)。該分選技術(shù)提供極快的分選——具有可只由流體力而不是分選激光偏轉(zhuǎn)限制的速度。在光潛在俘獲中的力按照常規(guī)為大約1-lOOOpN， 且在這種情況下橫穿流動(dòng)方向而被施加。在高流量條件下在本發(fā)明的設(shè)備中的流動(dòng)速度在 20nm直徑的粒子上標(biāo)稱地傳遞大約IOpN的斯托克斯曳力。這指示在流存在時(shí)量子點(diǎn)或類似尺寸的粒子的偏轉(zhuǎn)是可能的，特別是因?yàn)槠D(zhuǎn)到適當(dāng)?shù)姆较蛑恍枰赡艿姆@力的一小部分。偏轉(zhuǎn)速度可擴(kuò)展到兆赫范圍中。本發(fā)明的方法允許在流控結(jié)構(gòu)內(nèi)以接近基本限制的速率的極快分選控制。圖7示出使用光分選的設(shè)備的示例性設(shè)計(jì)。以電或光分選方法利用的本發(fā)明的分支的分離室可在所關(guān)注的特定分子——包括本文提供的任何分子例如DNA、RNA、染色質(zhì)、適配子、蛋白質(zhì)或肽——的恢復(fù)中提供空前水平的純度和速度。在一些實(shí)施方案中，對(duì)該分選方法的觸發(fā)事件可基于在激光檢測容積中的激發(fā)期間產(chǎn)生的熒光團(tuán)(例如，量子點(diǎn))顏色特征。可使用高速超靈敏雪崩光電探測器例如光電二極管(APD)或光電倍增管來觀察所發(fā)射的熒光，高速超靈敏雪崩光電探測器輸出代表所觀察的光子的數(shù)量的數(shù)字信號(hào)。為了誘發(fā)實(shí)時(shí)分選觸發(fā)信號(hào)，可編程高速硬件單元可用于執(zhí)行快速?zèng)Q策過程。現(xiàn)場可編程門陣列(FPGA)或本領(lǐng)域已知的其它邏輯設(shè)備—— 包括數(shù)字信號(hào)處理器或集成電路——可被提供來合并幾個(gè)操作以作出最終的分選決定。代表熒光的輸入信號(hào)可使用積分器操作來收集，并接著被緩存到比較器以決定單分子事件是否已出現(xiàn)。可同時(shí)對(duì)每個(gè)熒光顏色和相應(yīng)的光電探測器來執(zhí)行該操作。當(dāng)用戶指定的用于分選的條件被滿足時(shí)，分選觸發(fā)器可被輸出到可調(diào)節(jié)電源(電分選方法)或使紅外激光偏轉(zhuǎn)的相控陣(光分選方法)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于通過探測和分選以單分子分辨率準(zhǔn)備分子 (例如，DNA、RNA、蛋白質(zhì)、肽、適配子等)的準(zhǔn)備設(shè)備。在一些情況下，本發(fā)明的準(zhǔn)備設(shè)備可在分子例如染色質(zhì)片段被分析時(shí)合并允許分子例如染色質(zhì)片段的分選的特征。在一些情況下，攜帶一組標(biāo)志(例如熒光特征)的染色質(zhì)可被定向到室中，在該室中它們可被恢復(fù)用于隨后的分析，而缺少那些標(biāo)志的染色質(zhì)可被定向到分離的室中。在本發(fā)明的準(zhǔn)備設(shè)備的一些實(shí)施方案中，在設(shè)備的亞微米通道內(nèi)的接頭可提供設(shè)備內(nèi)的分叉的流出道。包括接頭的提供分叉的流出道的該設(shè)備可通過給流出道的兩個(gè)分叉之一上的電極充電來提供定向分子流動(dòng)。例如，通過在期望的流出道施加正電荷可沿著流出道的兩個(gè)分叉的一個(gè)或另一個(gè)來使DNA(例如，染色質(zhì)片段)定向。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，提供了高速電路以實(shí)時(shí)地并響應(yīng)于在檢測容積中的材料的熒光特性來切換電荷，檢測容積恰好位于分叉之前。在單分子水平處的高速實(shí)時(shí)探測和分選被提供來實(shí)現(xiàn)用于研究DNA的基因組數(shù)量的設(shè)備。
實(shí)施例實(shí)施例I :探測微流控和/或納流控提供用于探測從單分子發(fā)射的熒光的良好平臺(tái)。流控通道使用單光刻步驟在熔融硅石中被構(gòu)造，并覆蓋有硅石，如圖IOA和IOB所示。通道橫截面的近似均勻的照明允許探測穿過檢測容積( 150aL)的每個(gè)被標(biāo)記的分子，如圖IOC所示。我們?cè)诘蜐舛?< IOnM)樣本中實(shí)現(xiàn)高信噪比探測，如圖IOD所示。直到最近，單分子熒光使用“自制”軟件在實(shí)驗(yàn)后被記錄和分析。實(shí)施例2 :主動(dòng)分詵和收集為了代替基于軟件的單分子探測(SMD)，實(shí)現(xiàn)了廉價(jià)的現(xiàn)場可編程門陣列 (FPGA)，如圖IlC所示。使用在50MHz處操作的專用Altera FPGA，硬件水平的算法以微秒時(shí)間尺度評(píng)估單分子熒光。單獨(dú)的分子基于參數(shù)例如熒光強(qiáng)度和顏色在分叉的納流控通道內(nèi)被主動(dòng)分選和實(shí)時(shí)地分離，如圖IlA和圖IlB所示。圖12A示出示例性分選實(shí)驗(yàn)的參數(shù)和結(jié)果。圖12B示出來自由納流控通道分選的分子的結(jié)果。圖12B示出通過使用5. 7Kbp線性化質(zhì)粒測試分子穿過分選設(shè)備的運(yùn)動(dòng)并測量使用吸管重新收集它們的效率來產(chǎn)生的結(jié)果。樣本穿過Y形接頭的I個(gè)分支被電動(dòng)地輸送，使用吸管在輸出口處被收集，并接著使用qPCR被放大。qPCR的結(jié)果對(duì)照已知濃度標(biāo)準(zhǔn)被檢測以評(píng)估“所收集的量”。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中不時(shí)地，使用激光誘導(dǎo)的熒光在Y形通道中測量單分子事件的速率，以便“估計(jì)流量”。基于“所估計(jì)的流量”和“所收集的量”的質(zhì)量，我們導(dǎo)出收集效率。可使用各種技術(shù)——包括功能化膜、濾紙、涂有瓊脂糖的電極、吸收材料——或使用額外的管道來收集分子。額外的管道可通到片外位置。
實(shí)施例3 :對(duì)表觀遺傳分析的應(yīng)用在真核細(xì)胞內(nèi)的染色質(zhì)包括DNA和在DNA上聚集到核小體中的組織蛋白。DNA序列攜帶遺傳代碼并控制特性的遺傳，然而，對(duì)特定DNA序列及其相關(guān)組蛋白的可逆共價(jià)修飾可影響下層的DNA如何被利用，并可因此也控制特性。這些被稱為表觀遺傳狀態(tài)的修飾。 表觀遺傳狀態(tài)由DNA甲基化和與DNA結(jié)合的組蛋白的很多修飾來管理。這些狀態(tài)對(duì)適當(dāng)發(fā)展的調(diào)節(jié)的基因表達(dá)是必要的，并在很多疾病中被干擾。存在對(duì)鑒定表觀遺傳標(biāo)志放置全基因組和理解這些標(biāo)志如何在細(xì)胞類型當(dāng)中變化的極大興趣，有在環(huán)境中的或根據(jù)健康和疾病狀態(tài)的變化。存在很多修飾，包括在核小體內(nèi)的四個(gè)核心組蛋白的30個(gè)氨基酸殘留物處出現(xiàn)的甲基化、乙酰化、核糖基化、磷酸化、Sumo化、泛素化和瓜氨酸化。給出表觀遺傳機(jī)制在正常發(fā)展、環(huán)境響應(yīng)中起的基本作用以及它們的干擾如何影響疾病狀態(tài)，存在致力于表征人類表觀基因組的增加的努力。染色質(zhì)穿過納流控通道的流動(dòng)可便于表觀遺傳分析。我們首先演示以納米尺度的單染色質(zhì)分析(SCAN)以研究在天然染色質(zhì)片段中的核小體的結(jié)合狀態(tài)。來自HeLa細(xì)胞的染色質(zhì)一野生型和表達(dá)eGFP-H2B——以變化的比例混合。展示綠色組蛋白標(biāo)志和紅色 DNA染劑的事件用于在流動(dòng)期間檢驗(yàn)完整無損的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。第二個(gè)實(shí)驗(yàn)使用對(duì)表觀遺傳標(biāo)志的現(xiàn)有探針證明SCAN的能力。使用綠色標(biāo)記的甲基化結(jié)合域(MBD)蛋白質(zhì)和紅色DNA 染劑，我們鑒定出DNA甲基化——一種表觀遺傳標(biāo)志。圖14示出特征化本文所述的分選系統(tǒng)的實(shí)施方案的探測流量的表。我們演示了 SCAN，一種基于納流控的SMD方法，其用于研究核小體對(duì)天然染色質(zhì)的結(jié)合狀態(tài)，并用于使用結(jié)合的MBD-DNA絡(luò)合物來探詢表觀遺傳狀態(tài)。該技術(shù)可提供優(yōu)于常規(guī)ChIP的明顯改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)在單分子上的多個(gè)表觀遺傳標(biāo)志的同時(shí)探測。SCAN可進(jìn)一步使用分叉通道設(shè)計(jì)和專用FPGA來增強(qiáng)，以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)單分子探測和分選。我們證明了分離、收集和放大(qPCR)所分選的材料的能力。本發(fā)明還提供了用于使用SCAN-分選以大約IOMbp/ min的初始流量在單個(gè)流控通道中執(zhí)行快速表觀遺傳分析的完整系統(tǒng)。實(shí)施例4 :單分子分誅如本文所述的，系統(tǒng)被設(shè)計(jì)成擴(kuò)展基于流控的單分子技術(shù)以提供與特定的輪廓或分子“特征”匹配的單獨(dú)分子的快速選擇。使用下面牢記的原則來設(shè)計(jì)系統(tǒng)實(shí)時(shí)地收集和鑒定單分子的“特征”，如從熒光或其它可探測的手段測量的；決定分子的特征是否匹配用戶定義的分選或選擇標(biāo)準(zhǔn)；執(zhí)行收集模式匹配的分子的物理過程；以及收集這些分子用于隨后的分析(即，PCR、測序等)。系統(tǒng)可具有下面可能的應(yīng)用具有特定的表觀遺傳標(biāo)志(SCAN-分選)的染色質(zhì)片段的收集、具有最高結(jié)合親和性(SELEX-FAAS)的適配子探針的純化、藥物發(fā)現(xiàn)和蛋白質(zhì)或 DNA庫的集合、以及對(duì)凝膠電泳的備選方案和恢復(fù)選定的片段的切除。圖15示出概念布局的示意圖。圖16示出分選子系統(tǒng)和速率確定步驟。圖17示出分叉的流控網(wǎng)絡(luò)的線路模型。 流控網(wǎng)絡(luò)可引導(dǎo)并物理地分離分子。圖18示出確定通道的電阻特性的方程和計(jì)算。圖19 示出用于控制分叉的流控網(wǎng)絡(luò)的方式。使用外部電阻器的平行網(wǎng)絡(luò)可減小有效電阻。這也可允許對(duì)流動(dòng)特性的增加的控制。在一些實(shí)施方案中，電阻可減小，同時(shí)占用熱損耗的增加。圖20通過移動(dòng)到單層光刻術(shù)示出在流控網(wǎng)絡(luò)的設(shè)計(jì)中的改進(jìn)。這可減小設(shè)備阻塞，并消除電阻網(wǎng)絡(luò)失衡。圖21示出使用可變電阻器來調(diào)節(jié)電阻網(wǎng)絡(luò)的一種方法。圖22示出2kbp DNA片段從2、8和IOkbp片段的混合物的移除。在這里，可通過使用Y0Y0-1嵌入劑標(biāo)記所有片段并使用熒光強(qiáng)度的差異鑒定較大的片段來執(zhí)行實(shí)驗(yàn)。圖23示出利用可變電阻器的分子分選硬件的示意圖。圖24示出使用在本實(shí)施例中所述的硬件來進(jìn)行分選的例子。圖25示出固態(tài)繼電器和簧片繼電器的相關(guān)優(yōu)點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，可調(diào)節(jié)流控通道尺寸，且可使用固態(tài)繼電器。固態(tài)繼電器的使用可減小操作電壓和/或允許較快的繼電器的使用。實(shí)施例5 :在輸入和輸出探詢?nèi)莘e之間的時(shí)間相關(guān)性在輸入探詢?nèi)莘e和輸出探詢?nèi)莘e之間經(jīng)過的物體被探測。圖33示出作為時(shí)間偏移的函數(shù)的在50暈秒bin內(nèi)的相關(guān)事件的數(shù)量。如圖33所不,在輸入和輸出探詢?nèi)莘e之間的時(shí)間偏移是大約17ms。實(shí)施例6 :時(shí)間相關(guān)的分選包括2和SKbp片段的混合物的樣本流經(jīng)分選設(shè)備。片段使用+20V梯度流動(dòng)。如圖32所示，在輸入處使用每bin 300個(gè)光子的閾值探測到95個(gè)分子。78個(gè)分子由分選觸發(fā)器使用大于17ms的觸發(fā)脈沖來鑒定。76個(gè)分子在分選輸出處被收集。實(shí)施例I :高諫分詵 使用分選設(shè)備來執(zhí)行高速分選。包括2和SKbp片段的混合物的樣本被輸送到輸入通道。使用+20V梯度驅(qū)動(dòng)樣本。在閾值(在每bin 25-300個(gè)光子之間)之上的1023個(gè)分子在輸入處被探測到。757個(gè)分子由分選觸發(fā)器使用大于25ms的觸發(fā)脈沖來鑒定。1063 個(gè)分子在分選輸出處被收集。長觸發(fā)脈沖持續(xù)時(shí)間可連接快速連續(xù)出現(xiàn)的分子。在本實(shí)施例中，實(shí)現(xiàn)了滿足閾值的所有分子的完全或幾乎完全的收集，但這33個(gè)中只有28個(gè)在觸發(fā)信號(hào)跡線中被鑒定出，因?yàn)楫?dāng)多個(gè)分子出現(xiàn)在觸發(fā)窗口內(nèi)時(shí)算法不發(fā)出新的脈沖。雖然在本文示出和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說很明顯，這樣的實(shí)施方案僅作為例子來提供。本領(lǐng)域技術(shù)人員將現(xiàn)在將想到很多變更、變化和替換，而不偏離本發(fā)明。應(yīng)理解，可在實(shí)踐本發(fā)明時(shí)使用對(duì)本文所述的發(fā)明的實(shí)施方案的各種備選方案。意圖是下面的權(quán)利要求限定本發(fā)明的范圍，且在這些權(quán)利要求及其等效形式的范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)由此被涵蓋。
權(quán)利要求
1.一種用于分選物體的系統(tǒng)，包括(a)通道，其流體地連接到多個(gè)下游流路，所述通道適合于將所述物體保持在所述通道中的連續(xù)液體主體中；(b)一個(gè)或多個(gè)光源，其配置成照亮所述通道以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)探詢?nèi)莘e；(C)探測模塊，其配置成探測表示在所述一個(gè)或多個(gè)探詢?nèi)莘e中的所述物體的兩種不同的特性的至少兩種類型的信號(hào)；以及(d)分選模塊，其配置成基于所述兩種類型的信號(hào)使所述物體定向到所述多個(gè)下游流路中的一個(gè)。
2.如權(quán)利要求I所述的系統(tǒng)，還包括(a)一個(gè)或多個(gè)次級(jí)光源，其配置成照亮所述多個(gè)下游流路中的一個(gè)以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)下游探詢?nèi)莘e；以及(b)次級(jí)探測模塊，其配置成探測在所述一個(gè)或多個(gè)下游探詢?nèi)莘e中的至少一種類型的信號(hào)。
3.如權(quán)利要求2所述的系統(tǒng)，還包括次級(jí)分選模塊，所述次級(jí)分選模塊配置成基于所述一個(gè)或多個(gè)下游探詢?nèi)莘e中的所述兩種類型的信號(hào)使所述物體定向到多個(gè)次級(jí)下游流路中的一個(gè)。
4.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中所述物體選自由核酸分子、蛋白質(zhì)、染色質(zhì)、生物分子、細(xì)胞、細(xì)胞成分、碳水化合物和遺傳物質(zhì)組成的組。
5.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中所述一個(gè)或多個(gè)探詢?nèi)莘e小于10、1、 0. 5,0. 2,0. I 或 0. 05 飛升。
6.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中所述通道在分支點(diǎn)處流體地連接到2、3、4或5個(gè)下游流路。
7.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)包括由單個(gè)光源照亮的多個(gè)探詢?nèi)莘e。
8.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)包括沿著直線定位的至少三個(gè)探詢?nèi)莘e。
9.
10.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中所述一個(gè)或多個(gè)光源產(chǎn)生多個(gè)探詢?nèi)莘e。
11.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中所述通道是微流控通道。
12.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中所述物體由流體攜帶。
13.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中所述通道包括光學(xué)透明的壁。
14.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中所述探測模塊包括一個(gè)或多個(gè)光探測器。
15.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中所述物體通過電動(dòng)力流經(jīng)所述連續(xù)液體主體。
16.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中所述分選模塊包括配置成使所述物體定向到所述多個(gè)下游流路中的所述一個(gè)的多個(gè)電極。
17.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中所述分選模塊包括配置成使所述物體定向到所述多個(gè)下游流路中的所述一個(gè)的多個(gè)電極，其中所述電極放置成接近切換容積高達(dá)大約0. I、I或10_的距離。
18.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中所述分選模塊包括配置成使所述物體定向到所述多個(gè)下游流路中的所述一個(gè)的一個(gè)或多個(gè)閥。
19.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中所述分選模塊包括光鑷。
20.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中所述分選模塊使所述物體以及不大于大約100、10、I、0. 5或0. I飛升的切換流體定向。
21.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中所述分選模塊使所述物體以及不大于大約100、50或10倍于所述一個(gè)或多個(gè)探詢?nèi)莘e的切換流體定向。
22.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中所述分選模塊包括現(xiàn)場可編程門陣列， 所述現(xiàn)場可編程門陣列配置成接收關(guān)于所述物體的數(shù)據(jù)和/或返回使所述物體定向到所述多個(gè)下游流路中的一個(gè)的指令。
23.如權(quán)利要求22所述的系統(tǒng)，其中所述現(xiàn)場可編程門陣列解釋數(shù)據(jù)和/或在小于大約 IX 10'I X 10'I X 10'IX 1(T6 或 IX 1(T7 秒內(nèi)返回指令。
24.—種用于分選通道中的物體的方法，包括(a)使所述物體流經(jīng)所述通道，其中用多個(gè)標(biāo)記來標(biāo)記所述物體；(b)照亮所述通道以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)探詢?nèi)莘e，每個(gè)探詢?nèi)莘e由所述通道的壁和光束限制；以及(C)探測在所述一個(gè)或多個(gè)探詢?nèi)莘e的相同或不同探詢?nèi)莘e中的所述多個(gè)標(biāo)記的至少一個(gè)標(biāo)記和另一其它標(biāo)記，以產(chǎn)生所述第一標(biāo)記和第二標(biāo)記的時(shí)間相關(guān)的分辨率；以及(d)使所述物體定向到流體地連接到所述通道的多個(gè)下游流路中的一個(gè)。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，還包括(a)照亮下游路徑以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)下游探詢?nèi)莘e；以及(b)探測在所述一個(gè)或多個(gè)下游探詢?nèi)莘e中的所述多個(gè)標(biāo)記的至少一個(gè)標(biāo)記。
26.如權(quán)利要求25所述的方法,還包括基于探測到在所述一個(gè)或多個(gè)下游探詢?nèi)莘e中的至少一個(gè)標(biāo)記來使所述物體定向到多個(gè)次級(jí)下游流路中的一個(gè)。
27.如權(quán)利要求24-26的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述物體選自由核酸分子、蛋白質(zhì)、 染色質(zhì)、生物分子、細(xì)胞、細(xì)胞成分、碳水化合物和遺傳物質(zhì)組成的組。
28.如權(quán)利要求24-27的任一項(xiàng)所述的方法，其中照亮所述通道以產(chǎn)生多個(gè)探詢?nèi)莘e。
29.如權(quán)利要求24-28的任一項(xiàng)所述的方法，其中用多個(gè)標(biāo)記來標(biāo)記所述物體。
30.如權(quán)利要求24-29的任一項(xiàng)所述的方法，包括探測多于兩個(gè)的不同標(biāo)記。
31.如權(quán)利要求24-30的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)探詢?nèi)莘e小于大約10、1、0. 5,0. 2,0. I 或 0. 05 飛升。
32.如權(quán)利要求24-31的任一項(xiàng)所述的方法，其中光學(xué)地探測所述標(biāo)記。
33.如權(quán)利要求24-32的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述定向步驟由電動(dòng)力、光鑷或閥實(shí)現(xiàn)。
34.如權(quán)利要求24-33的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述物體被分析并在小于大約I、 0. 5,0. 1,0. 01,0. 001 或 0. 0001 秒內(nèi)被定向。
35.如權(quán)利要求24-34的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述物體被定向到在分支點(diǎn)處流體地連接到所述通道的至少2、3、4或5個(gè)下游流路中的一個(gè)。
36.如權(quán)利要求24-35的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述物體使用小于大約100、50或10 倍于所述一個(gè)或多個(gè)探詢?nèi)莘e的切換容積被定向到所述多個(gè)下游流路中的所述一個(gè)。
37.如權(quán)利要求24-36的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述物體使用小于大約1000、100、50 或10倍于物體的容積的切換容積被定向到所述多個(gè)下游流路中的所述一個(gè)。
38.如權(quán)利要求24-37的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多個(gè)下游流路中的所述一個(gè)由現(xiàn)場可編程門陣列選擇，所述現(xiàn)場可編程門陣列配置成接收關(guān)于所述物體的數(shù)據(jù)和/或返回使所述物體定向到所述多個(gè)下游流路中的一個(gè)的指令。
全文摘要
提供了用于高速分選在連續(xù)流體主體中的物體的系統(tǒng)和方法。物體可在允許物體的特性的同時(shí)或時(shí)間相關(guān)的測量的一個(gè)或多個(gè)探詢?nèi)莘e內(nèi)被分析。處理器可解釋物體的特性并接著測量，且然后使物體定向到多個(gè)下游流路中的一個(gè)。在一些實(shí)施方案中，物體的分選基于物體的兩種或更多種特性。可重復(fù)分析過程以產(chǎn)生分選事件的網(wǎng)絡(luò)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102612652SQ201080038285
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月6日
發(fā)明者B·R·西普里亞尼, H·G·克雷格黑德, P·索洛韋, S·利維 申請(qǐng)人:康奈爾大學(xué)