專利名稱：檢測嗜肺軍團菌多種血清型致病菌特異性引物及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種多重PCR快速檢測的方法及其應用，尤其涉及一種可同時 用于檢測嗜肺軍團菌血清型1型(Legionella pneumophila serogroup 1)，4型 (Legionellapneumophila serogroup 4)，6 型(Legionella pneumophila serogroup 6), 10 型(Legionella pneumophila serogroup 10)禾口 13 型(Legionella pneumophila serogroupl3)五種致病菌的PCR技術及其所用PCR引物的序列。
背景技術：
軍團菌(Legionella)在1976年“費城軍團病事件”中首次被發現，并因此而得名。 軍團菌是一種兼性細胞內寄生菌，廣泛存在于自然界及人工水體、土壤環境中，吸入污染有 軍團菌的氣溶膠，飲用污染或創面接觸污染水源等，都有可能導致軍團菌的感染，由軍團菌 引發的急性發熱性肺部疾病——軍團病為人畜共患疾病，相繼已有多個國家和地區報道該 病可在馬、牛、羊、豬和犬等動物中的發生和流行。受感染的人和動物排出的軍團菌污染環 境、土壤和水源，成為本病的傳染來源。美國、英國、加拿大、荷蘭、瑞典和西班牙等30多個 國家和地區相繼報道了軍團病在馬、牛、羊、豬和犬等動物中的發生和流行。據報道，我國沈 陽、成都地區部分畜禽的血清學調查，牛、羊、豬、雞、鴨、鵝和狗均檢出不同程度軍團病陽性 抗體，感染率為10. 3% -55. 5%。目前已確認軍團菌有50個種，70多個血清型，其中嗜肺軍團菌與人類疾病關系最 為密切。根據0-抗原的不同，嗜肺軍團菌可分為15個血清型。其中大約有70%的軍團 菌感染是由嗜肺軍團菌01引起的，20-30%是由其它血清型引起的，非嗜肺軍團菌導致約 5-10%的軍團菌感染。目前，很多分子分型方法應用于軍團菌分型研究，但大部分方法沒有標準化，傳統 的血清學分型鑒定的不足之處在于其容易受環境因素的影響，且可能與他菌種之間存在共 同抗原而出現交叉反應，而由此發展而來的單克隆抗體分型同樣存在穩定性差的缺陷。隨著分子技術特別是PCR技術的發展，許多分子生物學方法被用于軍團菌 分子分型和流行病學研究。目前已用于軍團菌分型的4種常用分子分型技術為隨 機擴增多態性 DNA(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)、脈沖場凝膠電泳 (Pulsed-Field GelElectrophoresis，PFGE)、擴增片段長度多態性(Amplified fragment lengthpolymorphism, AFLP)(sequence-based typing, SBT)。由 胃—& 即可分離出大量DNA片段，且具有操作簡便，重復率好等優勢，先后用于軍團菌分子分型和 流行病學調查。 1988年，自Chamberlain et al首先報道采用多重PCR診斷杜氏肌營養不良 癥(DMD)以來，已被成功的用于基因組結構與功能基因、突變與多態性，以及定量分析與 反轉錄 PCR 等多個 DNA 檢測領域。[Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophylocus via multiplex DNA amplification。 Nucleic Acids Res,1988,16: 11141 11156]，可在同一反應體系中加入一對以上的特異的引物對，如果存在與各引物對特異互補的模板，則可同時在同體反應體系中擴增出一條以上的目的DNA片段，從而檢 測出對應的致病菌。該方法對檢測致病菌具有快速、敏感、特異性強的優點

發明內容
本發明的目的在于提供一種對嗜肺軍團菌中常見血清型的多重PCR快速檢測技 術，并建立了相應的多重PCR檢測試劑盒，為快速檢測與鑒定常見致病菌提供有效的手段。 所用引物的序列包含以下序列中選取的一種或多種(1)嗜肺軍團菌血清型1型和6型wzt基因，4型，10型和13型wzm基因的特異核 苷酸序列；(2)上述(1)中選取的核苷酸序列的互補DNA序列。上述的引物序列可用于制備檢測嗜肺軍團菌多種血清型用PCR試劑盒、基因芯片 或微陣列。所述嗜肺軍團菌血清型取樣于自來水、礦泉水、空調冷卻水的培養物的粗提液， 或是嗜肺軍團菌1型，4型，6型，10型和13型的純培養物的粗提液。本發明還提供一種多重PCR試劑盒，包括10XPCR酶特異性反應緩沖液、MgCl2, dNTP、PCR引物、DNA聚合酶，所述PCR引物包括上述的核苷酸序列；其中所述的PCR引物優 選為如SEQ ID NO =I-SEQ ID NO 10所示的核苷酸序列。SEQ NO 1 ACACTTTTAGGCTTTGGT特異擴增嗜肺軍團菌10型的上游引物SEQ NO 2 CCCAAGCATAAAAACAATA特異擴增嗜肺軍團菌10型的下游引物SEQ NO 3 TAAAGATATTGTAGAGAGCCAGC特異擴增嗜肺軍團菌6型的上游引物SEQ NO 4 CATAGAGAGATAACCCTCACATT特異擴增嗜肺軍團菌6型的下游引物SEQ NO 5 TGCAGCAAGCAAAAGTTCAG特異擴增嗜肺軍團菌1型的上游引物SEQ NO 6 AATAAGGGTGAATACAAAGTACATC特異擴增嗜肺軍團菌1型的下游引物SEQ NO 7 TTGTCATTTGTGCCACAG特異擴增嗜肺軍團菌13型的上游引物SEQ NO 8 GCCAATTACCCTTTAAAC特異擴增嗜肺軍團菌13型的下游引物SEQ NO 9 CAACTCCGGATTGGTAAA特異擴增嗜肺軍團菌4型的上游引物SEQ NO 10 TTCAAATCGCGGTACCTG特異擴增嗜肺軍團菌4型的下游引物上述多重PCR檢測試劑盒可以包括如下試劑10mM dNTP 20 μ 1 ；IOX酶特異性反 應緩沖液50 μ 1 ;5U/ μ 1耐熱DNA聚合酶8 μ 1 ；弓丨物各10 μ 1 ；陽性對照品10 μ 1，陰性對照 品 10 μ 1 ； ddH20 5ml。上述針對嗜肺軍團菌多種血清型PCR試劑盒，整個檢測步驟包括樣品預處理_擴 增-電泳檢測結果。引物和PCR反應體系所需要的試劑已預先加入擴增管中，使用者只需 將預處理后的樣本加入擴增管啟動擴增反應即可，簡單快速的完成檢測工作。本發明中所用的核苷酸序列還可用于芯片的研制，包括固相載體和固定在固相載 體上的寡核苷酸探針，其中所述寡核苷酸探針包括上述的核苷酸。由上述的技術方案可見，本發明建立的一種多重PCR反應體系，可同時檢測5種血 清型嗜肺軍團菌，該試劑盒有如下優點(1)方法簡便，周期短、速度快、可操作性強本發明所配制的PCR試劑盒配制方法 簡便，檢測周期短、速度快，可操作性強，易于產業化生產，而檢測成本卻相對較低，市場應 用前景廣。本多重PCR試劑盒若用嗜肺軍團菌1型，4型，6型，10型和13型的菌懸液進行PCR擴增，與經提取得到的DNA作為模板擴增所得結果一致，且敏感度和特異性無差別，這 樣，可省去模板DNA的提取步驟，使操作方法得以簡化。同時，相比常規生化檢測方法而言， 本方法所采用的待測樣品可以直接是臨床樣品培養液，或者對檢測樣品進行簡單分離培養 就可進行檢測，因而節省了人力物力。(2)檢測靈敏度高本發明提供的多重PCR檢測試劑盒及其檢測方法敏感性高，檢 測精度高，可以檢測到Ipg/μ 1的DNA模板。對常見致病菌可以進行全面、系統、準確的檢 測與鑒定。(2)檢測成本相對較低可以推廣應用于環境監測、食品衛生監督、商品檢驗檢疫 等領域，并為其他不同致病菌檢測組合提供技術模式。(3)準確性高本發明根據嗜肺軍團菌1型和6型的wzt基因的特異區，和4型， 10型和13型的wzm基因的特異區設計出引物。繼而利用引物組合成復合PCR檢測體系，能 夠直接將這五種嗜肺軍團菌和其近源菌種分開。


圖1為本發明的試劑盒檢測結果圖，其中M為DL2000DNA marker ；N為陰性對照 品；P為陽性對照品；1為嗜肺軍團菌10型G2818 ；2為嗜肺軍團菌6型62771 ；3為嗜肺軍 團菌1型G2756 ；4為嗜肺軍團菌13型G2819 ；5為嗜肺軍團菌4型G2781 ；圖2為本發明試劑盒檢測嗜肺軍團菌其他血清型標準菌株電泳結果圖，其中1， 嗜肺軍團菌10型G2818 ；2，嗜肺軍團菌6型G2771 ；3為嗜肺軍團菌1型G2756 ；4為嗜肺 軍團菌13型G2819 ；5為嗜肺軍團菌4型G2781 ；6，嗜肺軍團菌7型G3410 ；7，嗜肺軍團菌 12型G2822 ；8，嗜肺軍團菌11型G2824 ；9，嗜肺軍團菌14型G2817 ； 10)，嗜肺軍團菌2型 G2773 ；M,DL2000DNA marker ；圖3是圖2的繼續，其中11，嗜肺軍團菌3型G2772 ； 12，嗜肺軍團菌8型G2820 ； 13，嗜肺軍團菌5型G3408 ；14，嗜肺軍團菌15型G2829 ；15，嗜肺軍團菌9型G2774 ；M, DL2000 DNA marker ；圖4為本發明試劑盒檢測軍團菌屬非嗜肺軍團菌電泳結果圖，其中1，嗜肺軍團 菌10型G2818 ；2，嗜肺軍團菌6型G2771 ；3為嗜肺軍團菌1型G2756 ；4為嗜肺軍團菌13 型 G2819 ；5 為嗜肺軍團菌 4 型 G2781 ；6，Legionella waltersii ；7，Legionellamicdadei ； 8, Legionella Iongbeachae ；9, Legionella anisa ；Μ, DL2000 DNA marker ；m 5 4 白勺鄉L，胃巾10,Legionella gormanii ；11,Legionella bozemanii ； 12, Legionella steigerwaltii ；Μ, DL2000 DNA marker ； 圖6為本發明檢測軍團菌屬臨床菌株電泳結果圖，其中1，嗜肺軍團菌10型 G2818 ；2，嗜肺軍團菌6型G2771 ；3為嗜肺軍團菌1型G2756 ；4，為嗜肺軍團菌13型G2819 ； 5，為嗜肺軍團菌4型G2781 ；6，嗜肺軍團菌1型G2759 ；7，嗜肺軍團菌3型G2762 ；8，嗜肺 軍團菌7型G2763 ；9，嗜肺軍團菌7型G2764 ； 10，嗜肺軍團菌5型G2765 ；M, DL2000 DNA marker ；圖7為本發明試劑盒檢測其它種屬近源菌種標準菌株電泳結果圖，其中1，嗜肺 軍團菌10型G2818 ；2，嗜肺軍團菌6型G2771 ；3為嗜肺軍團菌1型G2756 ；4為嗜肺軍團 菌13型G2819 ；5為嗜肺軍團菌4型G2781 ；6，志賀痢疾桿菌；7，沙門氏菌；8，金黃色葡萄球菌；9，小腸結腸炎耶爾森菌；M，DL2000DNA marker 圖8是圖7的繼續，其中10，綠膿桿菌；11，嗜水氣單胞菌；M，DL2000DNA marker ；圖9為本發明篩選嗜肺軍團菌10型的特異引物的電泳結果圖，其中1，嗜肺軍團 菌10型G2818 ；2，嗜肺軍團菌6型G2771 ；3為嗜肺軍團菌1型G2756 ；4為嗜肺軍團菌13 型 G2819 ；5 為嗜肺軍團菌 4 型 G2781 ；M, DL2000DNA marker ；圖10為本發明篩選嗜肺軍團菌10型的特異引物的電泳結果圖，其中6，嗜肺軍團 菌7型G3410 ；7，嗜肺軍團菌12型G2822 ；8，嗜肺軍團菌11型G2824 ；9，嗜肺軍團菌14型 G2817 ；10，嗜肺軍團菌2型G2773 ；11，嗜肺軍團菌3型G2772 ； 12，嗜肺軍團菌8型G2820 ； M, DL2000 DNA marker
具體實施例方式為保證本發明的上述和其它目的特征和優點更明顯易懂，下面特舉較佳實施例， 并配合說明書附圖，結合具體實例對本發明作進一步詳細描述。實施例1 基因組的提取1)從菌種保存管中取少許菌液，劃線接種于軍團菌BCYE生長平板；2. 5% CO2, 37°C培養5-7天。2)在平板內加入ImL 50mM Tris-HCl (pH8. 0)，用滅過菌的涂棒刮菌，取適量菌液 至1. 5mL離心管中，IOOOOrpm離心5分鐘積菌，去掉上清。3)力口 250 μ L 50mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)重懸，力口 10 μ L 0. 5Μ EDTA (ρΗ8· 0)，充分混勻。4)加15 μ L 20mg/mL溶菌酶，充分混勻，37 °C保溫20分鐘。5)力卩3 μ L 20mg/mL蛋白酶K，溫柔混勻。6)力Π 20 μ L 10% SDS, 50°C水浴1小時至溶液澄清。7)力口 2 μ L 25mg/mL RNAase，65 °C 水浴 20 分鐘。8)加等體積苯酚氯仿異戊醇(25 24 1)，IOOOOrpm離心10分鐘，上清液
置新管，重復抽提一次。9)加等體積氯仿異戊醇(24 1)，IOOOOrpm離心10分鐘，上清液置新管。10)加2. 5倍預冷的無水乙醇，輕搖，沉淀DNA。11)用毛細管繞起DNA，并用70%冰乙醇洗滌。12)651烘干，3(^1^ TE回溶，通過0. 4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。實施例2 引物的設計從NCBI上下載的序列，結合實驗室自測序列，針對嗜肺軍團菌1和6型的wzt基 因，嗜肺軍團菌4，10和13型的wzm基因的特異區設計引物，引物序列如下表1所示表1嗜肺軍團菌血清型1型、4型、6型、10型和13型的特異引物序列
權利要求
1.用于檢測嗜肺軍團菌多種血清型致病菌的特異性PCR引物，其特征在于所述的特異 性引物如SEQ ID NO =I-SEQ ID NO 10所示的核苷酸序列。
2.權利要求1所述的特異性引物，其中的特異性引物為(1)嗜肺軍團菌血清型1型和 6型wzt基因，4型，10型和13型wzm基因的特異核苷酸序列；(2)上述(1)中選取的核苷 酸序列的互補DNA序列。
3.權利要求1或2所述的特異性PCR引物，其中的特異性引物為SEQ NO 1 ACACTTTTAGGCTTTGGT特異擴增嗜肺軍團菌10型的上游引物； SEQ NO 2 CCCAAGCATAAAAACAATA特異擴增嗜肺軍團菌10型的下游引物； SEQ NO 3 TAAAGATATTGTAGAGAGCCAGC特異擴增嗜肺軍團菌6型的上游引物； SEQ NO 4 CATAGAGAGATAACCCTCACATT特異擴增嗜肺軍團菌6型的下游引物； SEQ NO 5 TGCAGCAAGCAAAAGTTCAG特異擴增嗜肺軍團菌1型的上游引物； SEQ NO 6 AATAAGGGTGAATACAAAGTACATC特異擴增嗜肺軍團菌1型的下游引物； SEQ NO 7 TTGTCATTTGTGCCACAG特異擴增嗜肺軍團菌13型的上游引物； SEQ NO 8 GCCAATTACCCTTTAAAC特異擴增嗜肺軍團菌13型的下游引物； SEQ NO 9 CAACTCCGGATTGGTAAA特異擴增嗜肺軍團菌4型的上游引物； SEQ NO 10 TTCAAATCGCGGTACCTG特異擴增嗜肺軍團菌4型的下游引物。
4.一種含有權利要求1所述特異性PCR引物的試劑盒，其特征在于它是由10XPCR酶 特異性反應緩沖液、MgCl2, dNTP、PCR引物、DNA聚合酶組成；所述PCR引物如SEQ IDNO I-SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列。
5.權利要求4所述的試劑盒，其中它是由下述試劑組成1)dNTP (IOmM)50 μ 1；2)IOX酶特異性反應緩沖液300μ 1；3)MgCl2 (25mM)300μ 1；4)Taq聚合酶(5 U/ul)5μ 1；5)引物混合物(5 uM)70μ 1；6)陽性對照品(KP)10μ 1；7)陰性對照品(KN)10μ 1；8)d ClII2O5ml ο
全文摘要
本發明涉及一種用于檢測嗜肺軍團菌多種血清型致病菌的特異性PCR引物及采用多重PCR試劑盒快速檢測的方法及應用，其中的試劑盒包括10×PCR反應液、MgCl2、dNTP、引物、DNA聚合酶，所用引物的序列包含以下序列中選取的一種或多種(1)嗜肺軍團菌血清型1型，4型，6型，10型和13型的wzt或wzm特異的核苷酸序列；(2)上述(1)中選取的DNA序列的互補DNA序列。本發明的對常見嗜肺軍團菌血清型的wzt特異的核苷酸及包含該核苷酸的PCR試劑盒、基因芯片或微陣列的實用性強，PCR試劑盒配制方法簡便，檢測周期短、速度快、準確性高，可操作性強，降低檢測成本，易于產業化生產。
文檔編號C12Q1/68GK102140514SQ20111000057
公開日2011年8月3日 申請日期2011年1月4日 優先權日2011年1月4日
發明者馮露, 周光朋, 姚芳芳, 曹勃陽, 王磊 申請人:天津生物芯片技術有限責任公司