專利名稱：擬南芥人工miRNA基因干涉載體快速構(gòu)建方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領域，主要是一種擬南芥人工miRNA基因干涉載體快速構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的方法構(gòu)建擬南芥基因沉默載體以Overlapping PCR為核心，通過PCR替換擬南芥miR319a的方法構(gòu)建擬南芥基因沉默載體(Sctwab et al.，2006)。現(xiàn)有方法針對單個沉默載體構(gòu)建需采用四條帶有沉默相關序列的PCR引物，和兩條公共引物配合，對 PRS300載體進行擴增，對擴增獲得的3段DNA片段進行回收，再進行融合PCR，連入T載體， 酶切后再連入轉(zhuǎn)化載體，最終獲得轉(zhuǎn)基因用的沉默載體。方法具體分為四個步驟第一步，通過針對每個不同的基因干涉設計合成4條長度為40bp的引物，合成兩條公共的引物組合，用于擴增基因特異的沉默相關DNA片段；第二步，通過4條基因特異的沉默引物和兩條公共引物祝賀，分別擴增獲得三段長度為271bp，173bp, 299bp的DNA片段，通過電泳分離DNA片段，切割含目標大小DNA的凝膠，進行DNA片段回收；第三步，將回收得到的三段PCR產(chǎn)物混合，再用兩條公共進行融合PCR，獲得長度為6%bp的DNA片段，通過電泳分離DNA片段，切割含目標大小DNA的凝膠，進行DNA片段回收；第四步，將回收后的695bp片段連接到T載體或其他中間載體，通過連接、轉(zhuǎn)化獲得攜帶有相應載體的大腸桿菌菌落，擴增菌體后，抽取帶有沉默片段的中間載體，再采用限制性內(nèi)切酶進行酶切，獲得有粘性末端的DNA片段，再和目標載體進行連接，通過連接、轉(zhuǎn)化獲得攜帶有轉(zhuǎn)化載體的大腸桿菌菌落，測序檢測正確后，用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。現(xiàn)有方法構(gòu)建載體需要四個大的步驟，且每個步驟操作的內(nèi)容又相當繁瑣，需要實驗人員具有一定的分子生物學操作基礎。本專利涉及的方法只需要兩個步驟，并且每個步驟操作也非常簡單，具有簡單分子生物學基礎的實驗人員也能快速，準確的完成載體構(gòu)建任務。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種擬南芥人工miRNA基因干涉載體快速構(gòu)建方法，尤其涉及擬南芥快速沉默載體改造用DNA序列和該DNA序列的合成以及采用該DNA序列用于建立高效的擬南芥人工miRNA基因干涉載體。為了解決上述的存在的技術(shù)缺陷，本發(fā)明的第一個目的是提供擬南芥快速沉默載體改造用DNA序列及其合成方法，本發(fā)明的第二個目的是提供用于高效構(gòu)建擬南芥基因沉默載體的載體及其制備方法，本發(fā)明的第三個目的是提供擬南芥基因沉默載體及其制備方法。本發(fā)明簡化了單個沉默載體構(gòu)建的方法，加速了構(gòu)建過程，提高了載體構(gòu)建的效率。為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
擬南芥快速沉默載體改造用DNA序列，該DNA序列如SEQ ID NO 1所示，SEQ ID NO 1所述如下caaacacacgctcggacgcatattacacatgttcatacacttaatactcgctgttttgaattgatgttt tAGGCCTagcgcTACGTAtccaattttcttgattaatctttcctgcacaaaaacatgcttgatccactaagtgacat atatgctgccttcgtatatatagttctggtaaaattaacattttgggtttatctttatttaaggcatcgccatg其中，AGGCCT部分為MuI酶切位點，TACGTA為SnaBI酶切位點。上述的擬南芥快速沉默載體改造用DNA拼接方法合成，該方法采用擬南芥 miR319a基因沉默序列作為基礎，如SEQ ID NO :2所示，將此擬南芥序列分成首片段、尾片段和核心沉默片段(如圖2所示)，通過連接融合首片段、接頭片段和尾片段，然后用于快速基因沉默載體改造。SEQ ID NO 2 所述如下caaacacacgctcggacgcatattacacatgttcatacacttaatactcgctgttttgaattgatgttt taggaatatatatgtagagagagcttccttgagtccattcacaggtcgtgatatgattaattagcttccgactcatt catccaaataccgagtcgccaaaattcaaactagactcgttaaatgaatgaatgatgcggtagacaaattggatcat tgattctctttgattggactgaagggagctccctctctcttttgtatccaattttcttgattaatctttcctgcaca aaaacatgcttgatccactaagtgacatatatgctgccttcgtatatatagttctggtaaaattaacattttgggtt tatctttatttaaggcatcgccatg tagg ；

首片段如SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 5所述如下
caaacacacgctcggacgcatattacacatgttcatacacttaatactcgctgttttgaattgatgttt
尾片段，SEQ ID NO 6 SEQ ID NO 6所述如下
gtatccaattttcttgattaatctttcctgcacaaaaacatgcttgatccactaagtgacatatatgct gccttcgtatatatagttctggtaaaattaacattttgggtttatctttatttaaggcatcgccatg ；接頭片段，SEQ ID NO 7所述如下cctagcgctac通過序列分析和設計，使得其中首片段由AGG位點結(jié)尾，而干涉尾片段由GTA位起始。這樣首片段、連接片段和尾片段拼接獲正好獲得一個包含MuI酶切位點和SnaBI酶切位點的沉默載體改造用DNA序列，同時首片段的前端和尾片段的尾端包含了酶切位點及相應的保護堿基，用以酶切并連接改造的目標載體。作為優(yōu)選，上述的擬南芥快速沉默載體改造用DNA序列的合成方法，包括以下的步驟①引物合成合成8條引物，序列如下
權(quán)利要求
1.一種擬南芥快速沉默載體改造用DNA序列，其特征在于該DNA序列如SEQ ID NO 1所示，SEQ ID NO 1所述如下caaacacacgctcggacgcatattacacatgttcatacacttaatactcgctgttttgaattgatgttttAGGCCTagcgcTACGTAtccaattttcttgattaatctttcctgcacaaaaacatgcttgatccactaagtgacatatatgctgccttcgtatatatagttctggtaaaattaacattttgggtttatctttatttaaggcatcgccatg ； 其中，AGGCCT部分為MuI酶切位點，TACGTA為SnaBI酶切位點。
2.一種合成如權(quán)利要求1所述的擬南芥快速沉默載體改造用DNA序列的方法，其特征在于該方法采用擬南芥miR319a基因沉默序列作為基礎，如SEQ ID NO 2所示，將此擬南芥序列分成首片段、尾片段和核心沉默片段；首片段的序列如SEQ ID NO :5所示，尾片段的序列如SEQ ID NO :6所示；設計接頭片段如SEQ ID NO :7所示，在首片段的前端和尾片段的尾端設計了酶切位點及相應的保護堿基；將首片段、接頭片段和尾片段拼接獲得一個包含MuI和SnaBI酶切位點的沉默載體改造用DNA序列，其中首片段由AGG位點結(jié)尾，而干涉尾片段由GTA位起始。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的擬南芥快速沉默載體改造用DNA序列的合成方法，其特征在于該方法包括以下的步驟①「引物合成合成8條引物，序列如下 引物名稱引物序列amiR-FlatgaattcctgcagccccaaacacacgctcggacgcatattacacatgttcatamiR-F2ttgatgttttaggcctagcgctacgtatccaattttcttgattaatctttcctgamiR-F3agtgacatatatgctgccttcgtatatatagttctggtaaaattaacattttggamiR-RlggcctaaaacatcaattcaaaacagcgagtattaagtgtatgaacatgtgtaatamiR-R2agcatatatgtcacttagtggatcaagcatgtttttgtgcaggaaagattaatcamiR-R3agggatccccccatggcgatgccttaaataaagataaacccaaaatgttaatttG-F-SaclTCGAGCTCatgaattcctgcagccccaacG-R-KpnlTCGGTACCagggatccccccatggcgatg②采用分步分段合成改造片段采用分步合成的方法合成此片段，amiR-FU amiR-Rl、amiR-F2和amiR-R2合成前端片段，amiR-F2、amiR-R2、amiR-F3 和 amiR-R3 合成后端片段； 合成前段和后段PCR體系濃度和反應條件為試劑加入量濃度H2O33.5ul/PCRBuffer5.Oul/dNTP5.Oul2. 5mMpb-Taq0.5ul/Primerl1.OulIOmMPrimer21.OulIOmMPrimer32.OulIOmMPrimer42.Oul lOmM溫度 時間 循環(huán) 95 °C 2min / 95 °C 30" 34cycles 55 °C 30" 34cycles 72V 40" 34cycles 72 °C 7min / ③改造片段的拼接分別稀釋100倍，再采用G-F-SacI和G-R-Kpnl引物用融合兩段PCR產(chǎn)物，合成帶有完 整改造片段的DNA鏈。
4.一種用于高效構(gòu)建擬南芥基因沉默載體的載體，其特征在于該載體含有如權(quán)利要 求1所述DNA序列的基因片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求4用于高效構(gòu)建擬南芥基因沉默載體的載體制備方法，其特征在于 該方法包括以下的步驟①載體改造片段與目標載體的連接采用如權(quán)利要求1所述DNA序列的基因片段，再采用&icl和Kpnl內(nèi)切酶酶切，如果目 標載體的采用其他的多克隆位點，則應在引物設計時，修改酶切位點，并在此處用相應的內(nèi) 切酶進行酶切，然后連入未修改的目標載體，混合好后的連接體系在16°C水浴過夜；②改造完成的目標載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌取連接產(chǎn)物5ul，加入lOOul的CaCl2處理的DH5 a熱擊感受態(tài)，42°C熱擊處90秒，力口 入800ul的LB無抗培養(yǎng)基，在37°C用250rpm復蘇1小時；在無菌條件下，取lOOul涂布在 含有50ug/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)平板上，37培養(yǎng)培養(yǎng)16小時，挑選轉(zhuǎn)化子，接入LB重新 培養(yǎng)后送測序確認；測序正確的菌采用25%甘油凍存，以備長期使用。
6.一種擬南芥沉默載體的快速構(gòu)建方法，其特征在于采用以下兩條引物 At—HESC—B—F tcacaggtcgtgatatgattaaAt—HESC—B—R tcaaagagaatcaatgatccaa將引物稀釋到lOuM，并進行PCR ；PCR產(chǎn)物即為橋接片段；橋接片段和權(quán)力要求4所述 載體相連接，獲得擬南芥基因沉默載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的擬南芥沉默載體的快速構(gòu)建方法，其在于該方法包括以下的 特征步驟①「質(zhì)粒準備及線性化將權(quán)利要求4獲得的載體搖菌擴增，采用質(zhì)粒抽提試劑盒進行質(zhì)粒DNA抽提，然后用 StuI和SnaBI酶切質(zhì)粒；在37 下酶切過夜，酶切后的DNA采用1 %瓊脂糖凝膠電泳，用溴乙錠染色后在紫外燈 下切膠，采用凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物；②橋接片段的合成 用以下兩條引物引物名稱引物序列At_HESC_B_F tcacaggtcgtgatatgattaaAt_HESC_B_R tcaaagagaatcaatgatccaa將引物稀釋到10uM，并進行PCR ；PCR產(chǎn)物即為橋接片段，橋接片段和權(quán)力要求4所述載體相連接，獲得擬南芥基因沉默載體；③核心沉默片段的擴增為每個基因分別合成基因沉默相關片段引物兩條首先，設計人工miRNA序列，將設計獲得的人工miRNA片段反向互補，將3位、 14 位和 21 位進行 G-A，C-A, T-A, A-T 顛換，并在 5’ 增加 “aatatatatgtaga”，3’ 增加 "tcacaggtcgtgata",形成At_HESH_F ；將設計獲得的人工miRNA片段反向互補，并在5’增力口 “aaaagagaga，，，3，±曾力口 “tcaaagagaatcaa，，形成特異弓I物 At_HESH_R ；④核心沉默片段與載體的連接無需進行回收，直接將擴增獲得的片段PCR產(chǎn)物直接和已經(jīng)線性化的載體相連接，混合好后的連接體系在16°C水浴過夜；⑤轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株取連接產(chǎn)物5ul，加入IOOul的CaC12處理的DH5 α熱擊感受態(tài)菌，42°C熱擊處理90秒， 加入800ul的LB無抗培養(yǎng)基，在37°C用250rpm復蘇1小時；在無菌條件下，取IOOul涂布在含有50ug/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)平板上，37°C培養(yǎng)培養(yǎng)16小時，挑選轉(zhuǎn)化子，接入LB重新培養(yǎng)；⑥基因沉默載體的檢測檢測引物的合成，需合成兩條檢測用引物引物名稱引物序列Promoter—test—FgattgatgtgatatctccacAt—amiR—test—Rtatttggatgaatgagtcgg菌液PCR檢測，將連接后的平板，挑選克隆搖菌，過夜培養(yǎng)后，取Iul進行菌液PCR檢測，PCR確認的陽性克隆即可初步判斷為轉(zhuǎn)化克隆。
8. 一種擬南芥快速基因沉默載體，其特征在于該載體由權(quán)利要求5所述的載體通過權(quán)利要求7所述的方法構(gòu)建獲得。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種擬南芥人工miRNA基因干涉載體快速構(gòu)建方法，完成擬南芥沉默載體構(gòu)建，主要是針對不同基因修改沉默片段，其他部分都是相同的，擴展了目標載體上不變的DNA區(qū)間，將沉默相關片段兩端的不變區(qū)域事先放入轉(zhuǎn)基因目標載體，再將核心沉默片段連入改造后的載體，直接完成載體構(gòu)建。在首、尾片段選擇時，分析了DNA序列，使得首尾片段通過橋接片段相連后可獲得一個StuI酶切位點和一個SnaBI酶切位點，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，可大量制備該載體并用StuI和SnaBI酶內(nèi)切酶對其進行線性化，直接連接采用本專利方法合成的核心沉默片段，完成擬南芥沉默載體的構(gòu)建。本發(fā)明有益的效果簡便易行，操作方便，效益高，能夠極大縮短實驗時間，降低單個沉默載體的改造成本。
文檔編號C12N15/63GK102268434SQ201110048020
公開日2011年12月7日 申請日期2011年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月23日
發(fā)明者嚴成其, 余初浪, 周潔, 楊勇, 王栩鳴, 程曄, 陳劍平 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學院