專利名稱：從石蠟包埋組織中提取總rna的方法
技術領域：
本發明涉及RNA提取方法，尤其是長時間福爾馬林固定石蠟包埋組織中總RNA的提取方法。
背景技術：
福爾馬林固定石蠟包埋組織(FFPE)是醫療機構最常用的保存病理組織的方法， 由于新鮮標本難以得到，為進行實體腫瘤分子生物學研究，對已有病例進行回顧性研究時只能從石蠟包埋組織中進行基因提取，因此石蠟包埋組織就成為來源最豐富的珍貴資源。 從石蠟包埋組織中提取DNA的方法已經成熟，但針對DNA的研究有時在某種程度上不能準確反映疾病相關基因轉錄過程中發生的改變，因此從病理學檔案標本中提取足量且能有效擴增的RNA對基因組功能及多態性研究具有重要意義。但長期以來從石蠟包埋組織中提取RNA —直存在一些困難一方面，與DNA相比較，RNA很不穩定，容易受到環境溫度、酸堿度等因素的影響，尤其是無處不在的RNA酶，在固定和包埋處理過程中很容易使得RNA分子被化學修飾或降解，不適宜進一步用于分子生物學研究；另一方面，固定劑所引起的組織蛋白質一 RNA的高度交聯，使得RNA更難以提取。最近幾年，國內外這方面出現諸多進展，但提取方法各異，所得RNA的產量及擴增效率也存在很大差別。文獻中報道的提取方法，多為 Trizol裂解法，蛋白酶消化法或試劑盒提取法，但提取的RNA的濃度和純度不理想，降解嚴重，只能進行小片段RNA擴增，更不能進一步很好的進行實時定量PCR(q RT-PCR)和基因芯片(microarray)的研究。并且現有技術所應用針對的對象，即FFPE樣本多為1年內的樣本，這也為臨床研究的應用帶來很大的限制。因此，需要研發更有效的能適用于更長時間保存的FFPE樣本的RNA提取的方法。

發明內容
本發明的目的在于提供一種可用于長時間保存的FFPE樣本的RNA提取的方法，本發明是在試劑盒(RecoverAl 1 Total Nucleic Acid Isolation Kit，Ambion公司產品，貨號AM1975)的基礎上所提出的改進方法，該方法包括如下步驟①脫蠟將待處理的石蠟包埋組織切成厚度為20 μ m的組織片，取4片組織片置于無菌的1. 5ml離心管內，加入Iml 二甲苯，漩渦震蕩混勻，50°C水浴3分鐘，室溫條件下， HOOOrpm離心4分鐘，棄上清，重復操作1 3次；加Iml無水乙醇，混勻，室溫條件下， HOOOrpm離心2 4分鐘，棄上清，重復操作2次，所得樣品室溫空氣干燥15 30分鐘；②消化向步驟①所得樣品中加入400ul消化緩沖液和4ul蛋白酶，55°C水浴 30 150分鐘；③提取在480ul提取劑中加入IlOOul無水乙醇，加入離心管中，用吸頭反復吹打直到組織沒有成團，90%的組織碎裂，呈白色云霧狀為止；準備一個帶濾柱的收集管，加 700ul混合液，9000rpm離心30秒，再加剩余液體，再9000rpm離心30秒，棄濾液；加700ul 洗液l,9000rpm離心30秒，加500ul洗液2/3，9000rpm離心30秒，棄濾液，再9000rpm離心30秒，棄濾液；④純化提前95°C水浴預熱無核酸酶水，準備DNase混合液6ul IOxDNA酶緩沖液，4ul DNA酶，50ul無核酸酶水；加60ul DNA酶混合液到濾柱中央，室溫靜置30分鐘，加 700ul洗液1室溫靜置30 60秒，9000rpm離心30秒，棄濾液，加500ul洗液2/3 9000rpm 離心30秒，棄濾液，再加500ul洗液2/3，9000rpm離心60秒，棄濾液；用新的收集管，加 60ul的預熱的無核酸酶水，室溫靜置2 3分鐘，12000rpm離心1分鐘，反復收集一次。采用本發明的方法，可以提取出保存時間最長達6年的石蠟包埋保存的組織樣品中的RNA，并成功的進行了后續的國際公認的分子生物學檢測。而相關領域的現有研究多是針對保存期少于1年的樣品。國內外均無文獻報道在保存2 6年福爾馬林固定石蠟包埋的組織中提取總RNA，進行mRNA及miRNA的q RT-PCR及microarray。經過核酸微量測試儀和國際公認的Agilent 2100bioanalyzer分析，提取的濃度在211_3116ng/ul，提取純度A260/280 1. 75-2. 04，都非常理想，可以進一步進行mRNA及miRNA水平的qRT-PCR和 miRNA的microarray的高豐度基因的表達研究，這對于開展大量FFPE的基因研究提供了實驗基礎，具有廣闊的應用價值。


本發明附圖6幅，圖1是本發明的方法提取的人卵巢癌的福爾馬林固定石蠟包埋組織的RNA瓊脂糖電泳結果，圖中數字分別表示樣品標號。圖2是本發明的方法提取的人卵巢癌的福爾馬林固定石蠟包埋組織的RNA質量分析圖譜，其中圖2(A)是標準品1的分析結果圖譜，Ladder :RNA范圍:218 ；RNA濃度:150ng/ul ；圖2(B)和圖2(C)分別是21號、12號樣本的分析結果圖譜，參照標準品1 ；圖2 (D)是標準品2的分析結果圖譜，Ladder =RNA范圍223. 7 ；RNA濃度:150ng/ ul ；圖2(E)是14號樣本的分析結果圖譜，參照標準品2 ；圖2 (F)是標準品3的分析結果圖譜，Ladder =RNA范圍J81. 3 ；RNA濃度150ng/ ul ； 2 (G),2 (H),2 (I),2 (J)和2 (K)分別是22、24、四、34和40號樣本的分析結果圖譜，參照標準品3。附圖3是本發明的方法提取的人卵巢癌的福爾馬林固定石蠟包埋組織的RNA用于 miRNA基因芯片(Microarray)實驗結果譜圖。附圖4是miRNA的表達在不同卵巢癌樣本中的microarray結果的可信度圖譜。附圖5是本發明的方法提取的1年期以內的人卵巢癌的福爾馬林固定石蠟包埋組織的RNA用于mRNA q RT-PCR檢測結果譜圖，其中圖5(A)是內參基因GAPDH的擴增曲線，圖5 (B)是目的基因STMNl的擴增曲線，圖5 (C)是內參基因GAPDH的融解曲線，圖5 (D)是目的基因STMNl的融解曲線。
附圖6是本發明的方法提取的6年期以內的人卵巢癌的福爾馬林固定石蠟包埋組織的RNA用于miRNA q RT-PCR檢測結果譜圖，其中圖6 (A)是內參miRNA U6的擴增曲線，圖6 (B)是目的miRNA的擴增曲線。
具體實施例方式美國Ambion公司的核酸提取試劑盒，Recoveral 1 Total Nucleic AcidIsolation Kit (貨號AM1975)是本領域技術人員常用的工具試劑盒。本申請的發明人在研究中發現，該試劑盒在用于石蠟包埋組織樣品RNA提取中存在一定的局限，在應用于保存期較長的樣品時，提取的RNA的濃度和純度不夠理想。并且，在試劑盒的具體應用過程中，發明人發現該試劑盒的方法還有諸多可改進之處，基于此，提供本發明的包括脫蠟、消化、提取和純化等步驟的RNA提取方法，具體包括如下步驟①脫蠟將待處理的石蠟包埋組織切成厚度為20 μ m的組織片，取4片組織片置于無菌的1. 5ml離心管內，加入Iml 二甲苯，漩渦震蕩混勻，50°C水浴3分鐘，室溫條件下， HOOOrpm離心4分鐘，棄上清，重復操作1 3次；加Iml無水乙醇，混勻，室溫條件下， HOOOrpm離心2 4分鐘，棄上清，重復操作2次，所得樣品室溫空氣干燥15 30分鐘；上述步驟①中，所述采用二甲苯對待處理的石蠟包埋組織進行脫蠟的操作，即“將待處理的石蠟包埋組織切成厚度為20 μ m的組織片，取4片組織片置于無菌的1. 5ml離心管內，加入Iml 二甲苯，漩渦震蕩混勻，50°C水浴3分鐘，室溫條件下，HOOOrpm離心4分鐘， 棄上清”可根據樣品的石蠟含量調整次數石蠟含量高于50%時，重復操作3次；石蠟含量 30 50%時，重復操作2次；石蠟含量低于30%時，操作1次。該步驟在試劑盒方法的基礎上對脫蠟次數進行了細化，是樣品的更高效和有效。上述步驟①中，用無水乙醇處理樣品后，可用吸頭擠壓組織，盡量吸凈組織中的乙醇，在此改進條件下處理所得樣品在下一步操作中所需干燥時間15 30分鐘，比試劑盒方法所需的45min更短，并且提高了干燥的效果，進而縮短下一步消化的時間。②消化向步驟①所得樣品中加入400ul消化緩沖液和4ul蛋白酶，55°C水浴 30 150分鐘；上述步驟②中，消化緩沖液的用量、消化溫度和消化時間均經過發明人摸索改進， 提高消化的效果，尤其針對保存期限較長的樣品，改進效果尤其明顯。③提取在480ul提取劑中加入IlOOul無水乙醇，加入離心管中，用吸頭反復吹打直到組織沒有成團，90%的組織碎裂，呈白色云霧狀為止；準備一個帶濾柱的收集管，加 700ul混合液，9000rpm離心30秒，再加剩余液體，再9000rpm離心30秒，棄濾液；加700ul 洗液l,9000rpm離心30秒，加500ul洗液2/3，9000rpm離心30秒，棄濾液，再9000rpm離心30秒，棄濾液；該步驟中的離心轉數均較試劑盒降低，可以更好的保護濾柱。④純化95°C水浴預熱無核酸酶水，準備DNase混合液6ul IOx DNA酶緩沖液， 4ul DNA酶，50ul無核酸酶水；加60ul DNA酶混合液到濾柱中央，室溫靜置30分鐘，加 700ul洗液1室溫靜置30 60秒，9000rpm離心30秒，棄濾液，加500ul洗液2/39000rpm離心30秒，棄濾液，再加500ul洗液2/3，9000rpm離心60秒，棄濾液；用新的收集管，加60ul的預熱的無核酸酶水，室溫靜置2 3分鐘，12000rpm離心1分鐘，反復收集一次。上述步驟④中，95°C水浴預熱無核酸酶水是試劑盒方法中沒有的步驟，可以增加 RNA的提取濃度。此步驟中離心轉數也有所降低，更好地保護濾柱，保證濾過效果。上述本方法中所述及的Recoverall Total Nucleic Acid Isolation Kit，購自美國Ambion公司，貨號AM1975。本發明的上述方法中步驟②所述的消化緩沖液和蛋白酶，步驟③所述及的提取劑、帶濾柱的收集管以及步驟④所述及的IOx DNA酶緩沖液，DNA 酶，洗液1和洗液2/3均為試劑盒中提供，所對應的試劑盒中相應產品分別是提取齊[J :isolation additive ；IOx DNA 酶緩沖液IOxDNase buffer ；DNA 酶Dnase;洗液1 :washl ；洗液2/3 :wash2/3。上述本發明的方法所述的無核酸酶水，Thermo kientific產品，購自Hyclone，貨號:SH30538. 01 ；上述本發明的二甲苯(分析純，AR)，購自天津市凱信化學工業有限公司，產品批號2010年9月10日；上述本發明的無水乙醇(分析純，AR) ,10009218，購自國藥集團化學試劑有限公司，產品批號:20091105o以下的實施例用于進一步說明本發明。實施例1樣品RNA提取本實施例的材料為人卵巢癌的福爾馬林固定石蠟包埋組織，本實施例中1Μ、2Μ、 3皿、411、511、811、1011、1說、2￥、3￥、4￥、5￥、6￥，分別代表了組織從固定包埋開始到進行實驗的保存時間分別為1個月，2個月，3個月，4個月，5個月，8個月，10個月，11個月，2年，3年，4 年，5年，6年。1年內的標本21個依次編號為1 21。2 6年的標本21個依次編號為22 42。該編號系統也適用于本說明書其它實施例。用本發明的方法從上述42個標本中提取RNA，經過核酸微量測試儀(品牌 NanoVue Plus , GE Healthcare產品，美國，型號=28923216)測定的濃度及純度如下表1 表 權利要求
1.從石蠟包埋組織中提取總RNA的方法，包括如下步驟①脫蠟將待處理的石蠟包埋組織切成厚度為20μ m的組織片，取4片組織片置于無菌的1.5ml離心管內，加入Iml 二甲苯，漩渦震蕩混勻，50°C水浴3分鐘，室溫條件下， 14000rpm,棄上清，重復操作1 3次；加Iml無水乙醇，混勻，室溫條件下，HOOOrpm離心 2 4分鐘，棄上清，重復操作2次，所得樣品室溫空氣干燥15 30分鐘；②消化向步驟①所得樣品中加入400ul消化緩沖液和4ul蛋白酶，55°C水浴30 150 分鐘；③提取在480ul提取劑中加入IlOOul無水乙醇，加入離心管中，用吸頭反復吹打直到組織沒有成團，90%的組織碎裂，呈白色云霧狀為止；準備一個帶濾柱的收集管，加700ul 混合液，9000rpm離心30秒，再加剩余液體，再9000rpm離心30秒，棄濾液；加700ul洗液 l,9000rpm離心30秒，加500ul洗液2/3，9000rpm離心30秒，棄濾液，再9000rpm離心30秒，棄濾液；④純化提前95°C水浴預熱無核酸酶水，準備DNase混合液6ulIOxDNA酶緩沖液，4ul DNA酶，50ul無核酸酶水；加60ul DNA酶混合液到濾柱中央，室溫靜置30分鐘，加700ul洗液1室溫靜置30 60秒，9000rpm離心30秒，棄濾液，加500ul洗液2/39000rpm離心30 秒，棄濾液，再加500ul洗液2/3，9000rpm離心60秒，棄濾液；用新的收集管，加60ul的預熱的無核酸酶水，室溫靜置2 3分鐘，12000rpm離心1分鐘，反復收集一次。
2.權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟①中采用二甲苯對待處理的石蠟包埋組織進行脫蠟的操作根據樣品的石蠟含量調整次數石蠟含量高于50%時，重復操作3次； 石蠟含量30 50%時，重復操作2次；石蠟含量低于30%時，操作1次。
全文摘要
一種從石蠟包埋組織中提取總RNA的方法，該方法是在試劑盒的基礎上所提出的改進方法，包括脫蠟、消化、提取和純化的步驟。采用本發明的方法，可以提取出保存時間最長達6年的石蠟包埋保存的組織樣品中的RNA，經過核酸微量測試儀和國際公認的Agilent 2100bioanalyzer分析，提取的濃度在211-3116ng/μl，提取純度A260/2801.75-2.04，都非常理想，可以進一步進行mRNA及miRNA水平的qRT-PCR和miRNA的microarray的高豐度基因的表達研究，這對于開展大量FFPE的基因研究提供了實驗基礎，具有廣闊的應用價值。
文檔編號C12N15/10GK102181431SQ20111005947
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月11日 優先權日2011年3月11日
發明者丁艷芳, 崔世英, 趙瑾瑤 申請人:大連醫科大學