專利名稱：一種改進ctab法提取杏鮑菇中的dna的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種杏鮑菇DNA的提取方法。尤其是一種CTAB法提取杏鮑菇的DNA。
背景技術：
目前在食用菌基因工程研究中，DNA的提取、分離和純化是重要的技術之一。但是食藥用真菌中往往富含多糖，而多糖的許多理化性質與核酸很相似，因此食用菌DNA的提取方法中其多糖類物質如何去除是一個棘手的問題；由于多糖可以抑制DNA限制性內切酶、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶等多種分子生物學酶類的活性，因此污染了多糖的DNA 樣品無法用于進一步的分子生物學研究?，F有CTAB法提取植物基因組織中的DNA，均是在 CTAB緩沖液中加入PVP以去除少許多糖；在高濃度Na+或K+存在條件下，通過Tris-酚、氯仿抽提除去多糖。目前通常是通過計算0D26(I/0D28(i比值來評價DNA的純度，若比值低于1. 8 則說明DNA樣品中有蛋白污染；現有CTAB常規方法的0D26(I/0D28(i比值均低于1. 8，說明僅通過PVP以去除少許多糖加上用Tris-酚氯仿異戊醇來抽提蛋白質仍會有相當多的多糖與DNA混雜在一起，目前還沒有更有效的方法來解決DNA分離純化時多糖污染的問題。

發明內容
本發明的目的在于提供一種改進的CTAB法提取杏鮑菇的DNA。以實現有效解決 DNA分離純化時多糖污染的問題。本發明包括以下步驟
(1)取杏鮑菇菌絲體0.3-0. 7g離心lOmin，取沉淀，放入研缽中，加入研缽容積1/2左右的液氮研磨成細粉，置于IOmL離心管中，加入55-70°C預熱的CTAB提取緩沖液4mL，振蕩混勻，放于恒溫65°C的水浴鍋中水浴保溫0. 5-lh，隔10 20min振蕩混勻一次；取出離心 IOmin ；取上清液，轉移到對應的試管中；
(2)在提取液中加入CTAB體積25-35%的無水乙醇；再加入4mLTris-酚、氯仿、異戊醇的混合溶液，所述混合溶液中的Tris-酚氯仿異戊醇=(22 觀)(21 26) (1 3)；離心分離IOmin ；棄沉淀取上清液；
(3)在上清液中再加入氯仿、異戊醇的混合溶液重新抽提，所述混合溶液中氯仿異戊醇=(24 28) (1 5)；
(4)在上清液中加入0.3 0. 5ml 3mol/L的乙酸鈉，pH為5. 2 ；再加入3 5ml 經_20°C預冷的異丙醇，充分混勻，在_20°C放置過夜；離心分離IOmin ；棄上清液；取沉淀；
(5)用70%乙醇洗滌沉淀2次，室溫下揮發乙醇，直至沉淀無醇味但仍保持濕潤；加入 100 μ 1 TE溶液溶解DNA ；再加入1 μ 150mg/mlRNAse ；在37°C水浴消化lh。所述CTAB 提取緩沖液包括 100 mmol/LTris-HCl (pH 8. 0)，20 mmol/LEDTA(pH 8. 0)，1. 4 mol/LNaCl，3%CTAB, 2%PVP, 2. 67% β -巰基乙醇。本發明的優點
本發明在加入Tris-酚、氯仿、異戊醇的混合溶液的同時加入25-35%的無水乙醇，所提出的DNA其OD26tZOD28tl值都處于1. 9 一 2. 0之間。說明乙醇的加入有助于蛋白質的去除。 這是因為乙醇與水互溶，對水的親和力很大，能破壞蛋白質顆粒的水化膜，使蛋白質在等電點沉淀下來，因此抽提時就可以很好地將蛋白質沉淀去除。用不同的五種方法分別進行紫外檢測結果，只有本發明的DNA條帶最亮，總體基本無降解拖尾現象，在加樣孔附近滯留的物質也很少；說明采用低濃度乙醇沉淀法可以很好地去除DNA中的多糖。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步說明。實施例1
(1)取杏鮑菇菌絲球0.5g，加入液氮(相當于研缽體積的1/2)研磨成細粉，置于IOml離心管中，加入 65°C預熱的 3%CTAB 提取緩沖液 4ml (100 mmol/LTris-HCl (pH8. 0)，20mmol/ LEDTA (pH8. 0)，1. 4mol/LNaCl, 3%CTAB, 2%PVP, 2. 67% β-巰基乙醇)，振蕩混勻，放于恒溫 65°C的水浴鍋中水浴保溫lh，隔10 15min振蕩混勻一次；取出離心IOmin ；離心后取上清液；
(2)在上清液中加入相當于第一次所加CTAB量30%體積的無水乙醇；再加入 4mLTris-酚、氯仿、異戊醇的混合溶液，混合溶液中的Tris-酚氯仿異戊醇=25:對1， 離心IOmin ；棄沉淀取上清液；
(3)在上清液中再加入4mL氯仿、異戊醇的混合溶液重新抽提，所述混合溶液中氯仿 異戊醇=24:1 ；離心lOmin，棄沉淀取上清液；
(4)加入上清液1/10體積的3mol/L，pH5. 2的乙酸鈉和等體積_20°C預冷的異丙醇， 充分混勻，在-20 0C放置過夜；離心分離IOmin ；棄上清液；取沉淀，
(5)用70%乙醇洗滌沉淀2次，室溫下揮發掉乙醇，直至沉淀無醇味但仍保持濕潤； 加入100 μ 1 TE溶液溶解DNA ；再加入0. 8-1. 5 μ 1 50mg/mlRNAse ；在37°C水浴鍋中消化
0.5-lho將提取的DNA進行七個平行樣的紫外檢測；結果如表1所示
權利要求
1.一種改進CTAB法提取杏鮑菇中的DNA，其特征在于，包括以下步驟(1)取杏鮑菇菌絲體0.3-0. 7g離心lOmin，取沉淀，放入研缽中，加入研缽容積1/2左右的液氮研磨成細粉，置于IOmL離心管中，加入55-70°C預熱的CTAB提取緩沖液4mL，振蕩混勻，放于恒溫65°C的水浴鍋中水浴保溫0. 5-lh，隔10 20min振蕩混勻一次；取出離心 IOmin ；取上清液，轉移到對應的試管中；(2)在提取液中加入CTAB體積25-35%的無水乙醇；再加入4mLTris-酚、氯仿、異戊醇的混合溶液，所述混合溶液中的Tris-酚氯仿異戊醇=(22 觀)(21 26) (1 3)；離心分離IOmin ；棄沉淀取上清液；(3)在上清液中再加入氯仿、異戊醇的混合溶液重新抽提，所述混合溶液中氯仿異戊醇=(24 28) (1 5)；(4)在上清液中加入0.3 0. 5ml 3mol/L的乙酸鈉，pH為5. 2 ；再加入3 5ml 經-20°C預冷的異丙醇，充分混勻，在_20°C放置過夜；離心分離IOmin ；棄上清液；取沉淀；(5)用70%乙醇洗滌沉淀2次，室溫下揮發乙醇，直至沉淀無醇味但仍保持濕潤；加入 100 μ 1 TE溶液溶解DNA ；再加入1 μ 150mg/mlRNAse ；在37°C水浴消化lh。
2.根據權利要求1所述的杏鮑菇DNA的提取方法，其特征在于，所述CTAB提取緩沖液包括 100 mmol/LTris-HCl(pH 8.0),20 mmol/L EDTA(pH 8.0),1.4 mol/LNaCl, 3%CTAB, 2%PVP, 2. 67% β -巰基乙醇。
全文摘要
一種改進CTAB法提取杏鮑菇中的DNA。是在加入Tris-酚、氯仿、異戊醇的混合溶液的同時加入25-35%的無水乙醇，所提出的DNA其OD260/OD280值都處于1.9－2.0之間。說明乙醇的加入有助于蛋白質的去除。這是因為乙醇與水互溶，對水的親和力很大，能破壞蛋白質顆粒的水化膜，使蛋白質在等電點沉淀下來，因此抽提時就可以很好地將蛋白質沉淀去除。用不同的五種方法種分別進行紫外檢測結果，只有本發明的DNA條帶最亮，總體基本無降解拖尾現象,在加樣孔附近滯留的物質也很少；說明采用低濃度乙醇沉淀法可以很好地去除DNA中的多糖。
文檔編號C12N15/10GK102286460SQ20111016677
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月21日 優先權日2011年6月21日
發明者夏志蘭, 姬建軍, 易恢滿, 陽國秀 申請人:湖南果秀食品有限公司