專利名稱：一種低溫酯酶及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體的說，涉及一種低溫酯酶、其編碼基因及其應用。
背景技術：
酯酶(esterase，EC 3. 1)是一種水解酶，可在水分子的參與下，經由水解作用，將酯類切割成酸類與醇類。酯酶存在于動物、植物和微生物細胞中。根據氨基酸序列差異，目前細菌酯酶可分為8個家族(I-VIII)。近年來，隨著基因工程技術的發展，一些新的酯酶陸續被發現，例如篩選至韓國海域的LipG、南中國海水體和沉積物環境的htA和htF，植物根部土壤的htD2、以及羊瘤胃的EstGKl和等。宏基因組，又稱元基因組，源于20世紀70年代土壤微生物基因組DNA直接提取技術，由Handelsman等人于1998年首次提出并完善了該名詞。宏基因組是指生境中全部微小生物遺傳物質總和。宏基因組技術可從環境樣品中直接提取微生物基因組DNA，克隆于不同載體，再將重組載體轉移到適宜的宿主以建立宏基因組文庫，結合不同篩選技術，從基因文庫中篩選獲得新基因或新的生物活性物質。應用這種免培養的新技術，可繞過微生物菌種分離培養技術難點，直接在基因水平上研究、開發和利用未培養的微生物資源，為工業、 農業、醫藥和環境可持續發展提供微生物基因資源。中國專利200710143545. 8提供了種編碼β -葡萄糖苷酶的基因，它通過構建土壤未培養微生物的宏基因組DNA文庫和文庫克隆的葡萄糖苷酶活性檢測篩選法獲得。目前授權的細菌酯酶及其基因專利多數直接來源于分離培養的菌株。中國專利 98811110. 1提供了一種耐熱堿性磷酸酯酶的氨基酸序列、編碼基因序列，以及生產重組酶的方法。中國專利200410091990. 0提供了一種假單胞菌磷酸甘油磷酸酯酶基因及其克隆方法。中國專利20081022^71. 7提供了一種酯酶及其編碼基因與應用，發明的酯酶適用于化工、食品、生物轉化、醫藥工業和其它相關工業。中國專利200910144213.0提供了一種從中溫鏈霉菌中獲取的熱穩定性羧酸酯酶基因、編碼蛋白及其應用。然而，細菌酯酶及其基因專利也有通過未培養技術篩選于宏基因文庫。中國專利200810226942. 6提供了一種酯酶新基因ht pi及其重組表達體系，該基因克隆自中國南海海底IOOm深海洋底泥宏基因組文庫。中國專利20081022^71. 7提供了一種酯酶及其編碼基因與應用，該基因克隆自中國南海778. 5m深海沉積物宏基因組文庫，發明的酯酶適用于化工、食品、生物轉化、醫藥工業和其它相關工業。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的低溫酯酶、編碼基因及其制備方法，該酯酶用于脂類降解及其他油脂類化合物的生物催化和轉化。本發明從中太平洋深海沉積物(水深5886m)宏基因組文庫中，通過特異性底物 (三丁酸甘油酯)篩選獲得一種新的酯酶基因Est6，包含該基因的表達重組菌已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所(100101)，保藏編號為CGMCC No.5084，保藏日期為2011年7月 18日，拉丁分類命名為hcherichia coli.經PCR克隆測序，酯酶基因的核苷酸序列如 SEQ ID No. 1 所示。Est6 大小為 909bp，堿基組成為148Α(16·)、3^C(36. 19% )、 292G(32. 12% )和140T(15. 40% )，編碼蛋白大小為302個氨基酸殘基，其氨基酸序列如 SEQ ID No. 2所示。將該基因序列在GenBank中進行同源搜索，發現一個與之相似性最高為 61%的蛋白來源于一株未培養細菌的酯酶(其在GenBank數據庫中的注冊號為ACL67845)。 結構預測顯示，酯酶具有甘氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸和甘氨酸組成的催化結構域(氨基酸位置為142至146)，構成酯酶催化中心；還具有組氨酸、甘氨酸、甘氨酸和甘氨酸組成的氧陰離子洞(氨基酸位置為74至77)。綜上所述，Est6應為酯酶家族一名新成員O在不影響&丨6蛋白活性前提下，可對SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列進行各種取代、添加和/或缺失一個或幾個氨基酸獲得具有酯酶活性的衍生蛋白質。根據本領域技術的公知常識，蛋白質的生物學活性是和其功能結構域密切相關的。一般來說，只有發生在功能結構域的位點突變可能對蛋白質的二維和三維結構產生影響，從而影響其生物學活性。而對于發生在遠離功能結構域的氨基酸位點，由于這一區域不參與蛋白功能構象，因而氨基酸的個別點突變不會對蛋白質的生物學活性產生實質性影響，從而能夠基本保留原蛋白質的生物學功能。因而，在已知74-77和142-146位氨基酸為酯酶的活性結構域的基礎上，根據公知常識和邏輯推理，通過合理的實驗安排可以得到對&16蛋白1-73、78-141或147-302位氨基酸序列進行各種取代、添加和/或缺失一個或幾個氨基酸從而獲得基本保留酯酶生物學活性的蛋白突變體，優選的為對^^6蛋白1-73、78-141或147-302位氨基酸進行點突變從而獲得基本保留Est6酯酶生物學活性的蛋白突變體。相應地，考慮到密碼子的簡并性，例如可在其編碼區，在不改變氨基酸序列的條件下，或在其非編碼區在不影響基因表達的條件下，可對編碼上述蛋白的基因序列進行修改。因此，本發明還保護對SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列進行的替換、添加和/或缺失一個或幾個核苷酸從而獲得編碼能基本保留酯酶蛋白生物學活性的DNA分子。例如對基因序列第1-219、234-423或441-906位核苷酸序列進行各種取代、添加和/或缺失一個或幾個核苷酸從而獲得編碼能基本保留酯酶蛋白生物學活性的DNA分子，優選的為對基因序列第1-219、234-423或441-906位核苷酸序列進行點突變從而獲得編碼能基本保留酯酶蛋白生物學活性的DNA分子。利用基因克隆技術，可將上述獲得的酯酶基因連接到合適載體上，并轉化或轉染到原核或真核生物宿主表達制備重組酯酶。合適的原核生物宿主包括各種細菌如E. COli 等，合適的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢細胞) 等，優選采用原核表達系統E. coli。一個優選的例子是將本發明篩選到的酯酶基因連接到大腸桿菌表達載體 pET28b (Novagen)上，并轉化到大腸桿菌Rosetta中，經誘導表達出高活性的重組酯酶。本發明還提供所述在催化水解酯、酯交換或合成、以及蛋白運輸保藏中的應用。通過酯酶活力測定表明，酯酶或上述能表達酯酶的宿主菌可用于水解短鏈脂肪酸脂。優選的短鏈脂肪酸脂為具有C2-C10短碳鏈的對硝基苯酚酯，例如對硝基苯乙酸酯、對硝基苯丁酸酯、對硝基苯己酸酯、對硝基苯辛酸酯和對硝基苯癸酸酯等，其中底物為對硝基苯酚丁酸酯(C4)時催化活性最高。Este酯酶為一種低溫酯酶，催化水解溫度范圍為10 50°C，優選為20 30°C ； 所述水解的PH值為6. 0 9. 0，優選為7. 5 8. 0。在0 20°C條件下，酶蛋白可保持良好的穩定性，在添加二價離子Mg2+、Mn2+或有機溶劑吐溫20和80條件下，酶學活性增大。本發明從中太平洋深海沉積物宏基因組文庫中篩選獲得新的酯酶基因，發現了該基因編碼蛋白具有優良的酶學特性，可應用于催化解酯和酶法合成酯產品生產過程中。獲得的酯酶基因可克隆到合適的宿主中實現異源表達，實現工業化生產酯酶，為后續的工業應用提供成本低廉的酯酶起始材料。該酶的生產，將會在洗滌劑、印染助劑和生物柴油制備等工藝中顯示出重要的經濟和社會價值。


圖1為純化酯酶的聚乙酰胺凝膠電泳分析圖。圖2為酯酶的底物特異性圖。C2 對硝基苯乙酸酯；C4 對硝基苯丁酸酯、 C6 對硝基苯己酸酯；C8 對硝基苯辛酸酯；ClO 對硝基苯癸酸酯；C12 對硝基苯十二酸酯；C14 對硝基苯十四酸酯；C16 對硝基苯十六酸酯；定義底物為C4時測定值為100%。圖3為酯酶最適反應溫度圖。圖4為酯酶最適反應pH圖。圖5為酯酶熱穩定性圖。圖6為二價陽離子對酯酶活性影響圖。圖7為有機溶劑和去垢劑對酯酶活性影響圖。
具體實施例方式實施例1 酯酶基因的獲取深海沉積物樣品于2008年8月采用多管取樣器采集自中太平洋，水深5886m。宏
CopyControlTM HTP fosmid library production kit (Epicentre, 美國)，克隆載體為 pCC2 FOS fosmid vector (Epicentre，美國)，宿主為 EPI300-T1R Ε. coli (Epicentre，美國)。經脈沖場電泳檢測，插入片段大小為36 48kb0采用氯霉素酯酶篩選平板[1% (w/v)三丁酸甘油酯，12. 5yg ml—1氯霉素，LB培養基(IOg胰蛋白胨，5g酵母抽提物，IOg氯化鈉，pH 7.0)]篩選具有酯酶基因的克隆子。取 10 μ 1文庫菌液稀釋至100 μ 1，涂布于酯酶篩選平板，30°C培養2天，菌落周圍出現明顯透明圈即為陽性克隆。將篩選出來的陽性克隆挑出，在氯霉素酯酶篩選平板上劃線重復驗證。 經篩選和重復驗證獲得酯酶陽性克隆E6。經重復驗證的酯酶陽性克隆E6接入:3ml LB液體培養基(含12. 5 μ g ml—1氯霉素禾口 6μ 1 500 X CopyControl Fosmid Autoinduction Solution), 37°C 震蕩培養 18h,震蕩速率為250rpm。采用質粒抽提試劑盒(Axygen，美國)抽提fosmid質粒。攜帶酯酶基因的 fosmid質粒采用限制性內切酶Sau3AI進行不完全酶切，割膠回收1. 5 41Λ大小的DNA片段，將其克隆至PUC19質粒，再轉化E.coli DH5a菌株，最后涂布氨芐青霉素酯酶篩選平板 [1% (w/v)三丁酸甘油酯，IOOyg ml—1氨芐青霉素，LB培養基]篩選陽性亞克隆。30°C培養2天后挑選產生透明圈的亞克隆，經劃線重復驗證后測序，獲得插入片段DNA序列。經陽性亞克隆測序獲得1748bp插入片段。針對插入片段的序列，基于 NCBI/ORF Finder (http//www. ncbi. nlm. nih. gov/ gorf/gorf. html)的ORF分析，獲得插入片段中開放閱讀框序列信息，通過Blastx (http:// blast, ncbi. nlm. nih. gov/)比對序列與已知酯酶基因序列的同源性。經數據庫比對分析獲得 Est6 基因，大小為 909bp，堿基組成為:148A(16. 28% ) ,329C(36. 19% ) ,2926(32. 12% ) 和140T(15.40% )，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。編碼蛋白大小為302個氨基酸殘基，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。將該基因序列在GenBank中進行同源搜索，發現一個與之相似性最高為61%的蛋白來源于一株未培養細菌的酯酶，其在GenBank數據庫中的注冊號為ACL67845。結構預測結果顯示，酯酶具有甘氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸和甘氨酸組成的催化結構域(氨基酸位置為142至146)，構成酯酶催化中心；還具有組氨酸、甘氨酸、 甘氨酸和甘氨酸組成的氧陰離子洞(氨基酸位置為74至77)，其在催化過程中可向過渡狀態中帶負電荷的氧原子提供氫鍵。系統發育分析結果表明，酯酶屬于酯酶家族中的IV 家族。綜上所述，Est6應為酯酶家族中的一名新成員。實施例2 酯酶基因的重組表達質粒和重組菌株的構建將本發明獲得的酯酶基因克隆到表達載體上，構建重組表達菌株。基于 NCBI/ORF Finder的ORF分析獲得的酯酶基因的開放閱讀框序列，設計擴增酯酶全基因的上游引物 Est6F (5’-CGCACATATGGCCAGTCCACAGCTCC-3’，NdeI)和下游引物 ht6R(5，_AATTA AGCTTCTAGCGTGCGGCGGCG-3 ’，Hindi 11), PCR擴增確認基因全長序列。采用酶切克隆的方法構建表達質粒，即用NdeI和HindIII雙酶切PCR產物，割膠回收酶切后的片段與經NdeI和 HindIII雙酶切的質粒pET28b連接，采用CaC12轉化法轉化至大腸桿菌DH5 α中，卡那霉素抗性篩選陽性克隆。采用質粒抽提試劑盒(Axygen，美國)提取陽性克隆的質粒，經NdeI 和HindIII雙酶切鑒定，獲得909bp的DNA片段，經測序鑒定為酯酶基因ht6。表明已成功構建了表達質粒，將此重組表達質粒轉化到大腸桿菌Rosetta表達菌株中，構建了表達重組菌株。包含該基因的表達重組菌已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所(100101)，保藏編號為CGMCC No. 5084，保藏日期為2011年7月18日，拉丁分類命名為Escherichia coli。實施例3 利用重組表達菌株表達重組酯酶基因將構建好的3ml重組表達菌株轉接到100ml含有20 μ g/ml卡那霉素和34 μ g/ ml氯霉素的LB液體培養基中，37°C振蕩培養至0D_達到0. 6，此時加入終濃度為0. 5mM的 IPTG進行誘導表達，轉入25°C以150r/min振蕩培養幾。低溫離心收集菌體，重懸于Buffer A(500mM氯化鈉，IOmM咪唑，20mM Tris鹽酸，pH 8.0)中，在冰上進行超聲波破碎處理。低溫離心收集上清，然后進行NTA-Ni2+親和柱層析，所表達的重組蛋白含有N端的6XHis tag, 能親和吸附到層吸柱中，經過不同濃度的咪唑溶液梯度洗脫后，收集洗脫液。經SDS-PAGE 檢測，得到電泳純的重組酯酶蛋白Est6，分子量32kd，與預測值一致(圖1)。用Bradford 方法測定蛋白質濃度，得到約2. 28mg/100ml發酵液的表達量。實施例4 重組酯酶基因的活性檢測
利用對硝基苯丁酸酯法測定純化的重組酯酶活性。具體操作在Iml的反應體系中包括ImM對硝基苯丁酸酯，IOOmM Tris鹽酸緩沖液(pH 7. 5)和0. 57 μ g純酶蛋白 (為10 μ 1經稀釋的純化酶液)，采用紫外可見光分光光度計(Beckman DU800型，美國)于 20°C條件下連續測定吸光值A4tl5 3min，使用失活的酶液作為對照用于調零。測得的酯酶活性為104.41U/mg。另外，將純化的酶液直接滴于(w/v)三丁酸甘油酯平板上，可觀察到明顯的透明圈。表明這個重組表達的酯酶具有酯酶水解活性，為后續的研究和應用提供了材料。實施例5 酯酶底物特異性分析酯酶的底物特異性分析采用體系100mM Tris-鹽酸緩沖液(pH 7. 5)，ImM底物，加入0. 57μ g純酶蛋白，在20°C下連續測定吸光值A4(153min。測定采用的底物為對硝基苯酚乙酸酯(C2)，對硝基苯酚丁酸酯(C4)，對硝基苯酚己酸酯(C6)，對硝基苯酚辛酸酯 (C8)，對硝基苯酚癸酸酯(ClO)，對硝基苯酚十二酸酯(C12)，對硝基苯酚十四酸酯(C14)， 對硝基苯酚十六酸酯(C16)。經測定表明，能特異性水解化合物對硝基苯酚丁酸酯的酯鍵。酯酶對酰基碳鏈較短的對硝基苯酚酯(C2、C4、C6、C8和C10)具有催化活性， 其中底物為對硝基苯酚丁酸酯(C4)時催化活性最高，較難水解對硝基苯酚十四酸酯(C14) 和對硝基苯酚十六酸酯((16)(圖幻。結果表明，酯對酰基碳鏈較短脂類物質具有催化活性，對于短鏈脂類的水解活力優于長鏈脂類。實施例6 酯酶最適反應條件分析酯酶最適反應溫度在10 50°C范圍內測定。具體操作采用體系100mM Tris-鹽酸緩沖液(pH 7. 5)，ImM對硝基苯酚丁酸酯，加入0.57 μ g純酶蛋白，分別在10、 15、20、25、30、35、40、45和50°C條件下連續測定吸光值A4(15;3min。測定結果表明為低溫酶，在10°C條件下仍具有催化活性，最適反應溫度為20°C (圖3)。酯酶最適反應pH在3.0 10.0范圍內測定。具體操作為在不同pH緩沖液中加入ImM對硝基苯酚丁酸酯和0. 57 μ g純酶蛋白，在20°C下連續測定吸光值A348 3min。 測定使用的緩沖液為=IOOmM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 3.0 6. 5)，100mM磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液(pH 6. 5 7. 5)，IOOmM Tris鹽酸緩沖液(pH 7. 5 9. 0)和50mM 2-環己胺基乙磺酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9.0 10.0)。測定結果表明，最適pH為 pH 7. 5，在pH 6.0 9.0范圍內具有活性(圖4)。實施例7 酯酶酶學穩定性分析酯酶熱穩定性分析在0 60°C范圍內測定。具體操作為將純化后酶液分別保溫在0、10、20、30、40、50和601下301^11，然后測定酶活性。測酶活體系為=IOOmM Tris 鹽酸緩沖液(pH 7. 5)，ImM對硝基苯酚丁酸酯，加入0. 57 μ g純酶蛋白，于20°C連續測定吸光值A4c^miru測定結果表明，Est6在0 20°C時保持良好的穩定性，在40 60°C保存時失去活性(圖5)。二價陽離子對酯酶活性影響的測定具體操作為在反應體系中分別加入 IOmM C02+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、ai2+、Sr2+、Mn2+、Ni2+、Ba2+和乙二胺四乙酸，測定酶活性。測酶活體系為100mM Tris鹽酸緩沖液(pH 7. 5)，ImM對硝基苯酚丁酸酯，0. 57 μ g純酶蛋白，于20°C 下連續測定吸光值A4tl5 3min。測定結果表明，酯酶活性會被ai2+、Cu2+和Ni2+抑制，在 Co2+、Ca2+、Sr2+和Ba2+存在下仍能保持較強的活性，在Mg2+和Mn2+存在下活性增大(圖6)。
有機溶劑和去垢劑對酯酶活性影響的測定具體操作為在反應體系中分別加入15% (ν/ν)有機溶劑(異丙醇、乙腈、乙醇、甲醇、丙酮、二甲基亞砜和二甲基甲酰胺) 和去垢劑(w/v或v/v)(十二烷基硫酸鈉、吐溫20、吐溫80和Triton X-100)然后測定酶的活性。測活體系為100mM Tris鹽酸緩沖液(ρΗ 7.幻，ImM對硝基苯酚丁酸酯，0. 57 μ g 純酶蛋白，于20°C下連續測定吸光值A4tl5 3min。測定結果表明，酯酶活性會被十二烷基硫酸鈉抑制，但吐溫20和80可增強其活性(圖7)。
權利要求
1.一種酯酶蛋白，是具有如下(1)或( 特征的蛋白質(1)、其氨基酸序列與ID NO. 2所示序列一致；O)、將kq ID NO. 2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失和/ 或添加且具有酯酶活性的由(1)衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的酯酶蛋白，其特征在于所述的衍生蛋白質為對^^6蛋白1-73、78-141或147-302位氨基酸序列進行各種取代、添加和/或缺失一個或幾個氨基酸從而獲得基本保留酯酶生物學活性的蛋白突變體。
3.根據權利2所述的酯酶蛋白，其特征在于所述的衍生蛋白質為對^^6蛋白 1-73、78-141或147-302位氨基酸殘基進行點突變從而獲得基本保留酯酶生物學活性的蛋白突變體。
4.編碼權利要求1所述Est6酯酶蛋白的DNA分子，其核苷酸序列如SEQID NO. 1所示；或為對SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列進行替換、添加和/或缺失一個或幾個核苷酸從而獲得編碼能基本保留酯酶蛋白生物學活性的DNA分子。
5.根據權利要求4所述的DNA分子，其特征在于其為對SEQID NO. 1所示基因序列第1-219、234-423或441-906位核苷酸序列進行各種取代、添加和/或缺失一個或幾個核苷酸從而獲得編碼能基本保留酯酶蛋白生物學活性的DNA分子。
6.根據權利要求5所述的DNA分子，其特征在于其為對SEQID NO. 1所示基因序列第1-219、234-423或441-906位核苷酸序列進行點突變從而獲得編碼能基本保留酯酶蛋白生物學活性的DNA分子。
7.攜帶有權利要求4-6任一項所述DNA分子的載體。
8.一種宿主系統，其由權利要求7所述的載體經轉化或轉染原核生物或真核生物宿主得到。
9.權利要求1-3任一項所述的的酯酶在催化水解酯、酯交換或合成、以及蛋白運輸保藏中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述的酯酶可用于水解短鏈脂肪酸脂。
全文摘要
本發明公開了一種低溫酯酶、編碼基因及其應用。本發明從太平洋深海沉積物宏基因組文庫中篩選獲得新的酯酶基因，發現了該基因編碼蛋白具有優良的酶學特性，催化水解溫度范圍為10～50℃，水解的pH值為6.0～9.0。在0～20℃條件下，酶蛋白可保持良好的穩定性，在添加二價離子Mg2+、Mn2+或有機溶劑吐溫20和80條件下，酶學活性增大。獲得的酯酶基因可克隆到合適的宿主中實現異源表達，實現工業化生產酯酶，可應用于催化水解酯和酶法合成酯產品生產過程中，將會在洗滌劑、印染助劑和生物柴油制備等工藝中顯示出重要的經濟和社會價值。
文檔編號C12N9/18GK102286441SQ20111020821
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月24日 優先權日2011年7月24日
發明者劉鎮盛, 吳敏, 楊俊毅, 江夏薇, 王春生, 許學偉 申請人:國家海洋局第二海洋研究所