專利名稱：畢赤酵母壁蛋白Gcw3及其表面展示系統和構建方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種巴斯德畢赤酵母壁蛋白Gcw3及其構建的表面展示系統和構建方法。
背景技術：
微生物細胞表面展示技術是一種通過錨定蛋白將蛋白質或多肽固定在細胞表面的技術。微生物細胞表面展示系統包括宿主菌、錨定蛋白和靶蛋白，有時在錨定蛋白和靶蛋白之間也添加一段連接(linker)序列。微生物細胞表面展示在多肽分離、全細胞催化劑、 全細胞吸附劑、疫苗和抗體生產、蛋白文庫篩選、生物傳感器、生物修復等方面都有廣闊的應用前景。目前在微生物表面展示系統中應用比較多的宿主菌主要有噬菌體、細菌(如大腸桿菌Esctwrichis. coli、奇異變形菌Proteus mirabilis 等)、釀酒酵母 QSaccharomyces cerevisiae)和巴斯德畢赤酵母G0ZcAia pastor is)。表面展示使用的錨定蛋白一般具有以下特征(1)較牢固地錨定在細胞表面，不會輕易地從細胞表面脫落；(2)可以與靶蛋白序列有效融合而不影響靶蛋白的結構和功能；(3)對蛋白酶有一定的抗性。細菌表面展示系統的錨定蛋白主要有細菌菌毛蛋白、S層蛋白、冰核蛋白(INP)和一些外膜蛋白。釀酒酵母表面展示系統的錨定蛋白主要有凝集素系統、絮凝素系統和其它GPI錨定 (glycosylphosphatidylinositol anchored)蛋白系統和一些Pir蛋白系統。巴斯德畢赤酵母具有可以實現高密度發酵(細胞密度可高達140g/L)、蛋白適度糖基化和發酵培養基組成簡單等優點，在微生物細胞表面展示方面的應用具有非常廣闊的前景，目前已有許多種蛋白，如解脂耶氏酵母脂肪酶、乳酸克魯維酵母黃酶、米根霉脂肪酶等已經成功地展示在巴斯德畢赤酵母表面。目前巴斯德畢赤酵母表面展示系統中使用的錨定蛋白主要來自釀酒酵母的凝集素系統、絮凝素系統和kdlp蛋白等。但是，這些錨定蛋白不是畢赤酵母的組成成分，而是通過人為手段外源引進的。因此用外源壁蛋白作為畢赤酵母表面展示系統的錨定蛋白，可能會與內源壁蛋白競爭壁蛋白結合位點，導致展示效率不高。Khasa YP (Khasa YP, et al. Isolation of Pichia pastoris PIR genes and their utilization for cell surface display and recombinant protein secretion. Yeast. 2010. (published online).)等報道了利用畢赤酵母Pir蛋白作為錨定蛋白進行外源蛋白的細胞表面展示。但發明人發現Pir蛋白本身的表達量較低，作為畢赤酵母表面展示系統的錨定蛋白效果一般。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提高用于巴斯德畢赤酵母表面展示系統的內源錨定蛋白的表達效率。本發明解決上述問題的技術方案是
一種巴斯德畢赤酵母壁蛋白Gcw3，該蛋白的氨基酸序列為SEQ NO :1。
本發明所述的巴斯德畢赤酵母壁蛋白由288個氨基酸組成，大小約為31. 3KDa。 本發明所述的巴斯德畢赤酵母壁蛋白以共價鍵的形式結合在巴斯德畢赤酵母細胞壁上，用十二烷基硫酸鈉法不能提取，可以用β -1，3-葡聚糖酶法提取。本發明所述的巴斯德畢赤酵母壁蛋白Gcw3可用于構建畢赤酵母細胞表面展示系統，所述的巴斯德畢赤酵母細胞表面展示系統是以所述壁蛋白為錨定蛋白將靶蛋白固定在畢赤酵母細胞表面構成的。編碼所述巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW3的基因，核苷酸序列如SEQ NO 4所示。一種巴斯德畢赤酵母細胞表面展示系統，是以所述的巴斯德畢赤酵母壁蛋白Gcw3 為錨定蛋白，將靶蛋白固定在巴斯德畢赤酵母細胞表面構成的。上述巴斯德畢赤酵母細胞表面展示系統可通過以下步驟構建
(1)將權利要求2所述的基因克隆到表達載體的表達盒中，得到以權利要求1所述巴斯德畢赤酵母壁蛋白為錨定蛋白的表面展示表達載體；
(2)將靶蛋白的基因序列克隆到所述表面展示表達載體的巴斯德畢赤酵母壁蛋白基因序列的上游，與所述巴斯德畢赤酵母壁蛋白基因形成融合基因；
(3)轉化巴斯德畢赤酵母，根據所述表達載體上的篩選標記篩選陽性轉化子，即得到表面展示系統。所述靶蛋白為堿性木聚糖酶、米黑根毛霉脂肪酶或南極假絲酵母脂肪酶B。所述巴斯德畢赤酵母為巴斯德畢赤酵母GSl 15。上述方法中，所述的表達載體是常用的帶有分泌信號肽序列的巴斯德畢赤酵母表達載體，如 PPIC9K、pPICZ α A、pPICZ α B、pPICZ α C、pGAPZ α A、pGAPZ α B、pGAPZ α C 等；如果是無信號肽的表達載體，可在靶蛋白基因序列的上游添加分泌信號肽序列。表達載體為pPIC9K時，構建表面展示表達載體后，將靶蛋白的基因序列克隆連接到所述表面展示表達載體的巴斯德畢赤酵母壁蛋白基因序列上游的限制性內切酶酶切位存、EcoR 1與Mlu I之間。本發明相對于現有技術所具有的優點及有益效果。本發明所述的壁蛋白Gcw3是巴斯德畢赤酵母內源壁蛋白，且在畢赤酵母中表達量十分高，與現已用于巴斯德畢赤酵母表面展示系統的內源錨定蛋白Pirl蛋白和Pir2蛋白相比，分別高6倍和14倍。因此，本發明所述巴斯德畢赤酵母可用于構建高表達效率的巴斯德畢赤酵母表面展示系統。


圖1.用SDS法和β-1，3-葡聚糖酶法提取巴斯德畢赤酵母壁蛋白Gcw3的 Wfestern blot結果。a. SDS法提取壁蛋白Gcw3 ;b. β _1，3-葡聚糖酶法提取壁蛋白Gcw3。圖2 重組菌GS115/GCW3和對照菌GS115的流式細胞儀檢測結果。虛線對照菌 GS115 ；實線重組菌 GS115/GCW3。圖3 三丁酸甘油酯乳化平板水解圈法檢測GS115/GCW3-CALB陽性轉化子。a.對照菌 GS115 ；b.陽性轉化子 GS115/GCW3-CALB。圖4 熒光顯微鏡驗證融合蛋白GCW3-CALB在畢赤酵母細胞壁表面展示結果。a. GS115/GCW3-CALB的普通光學顯微圖；b.GS115/GCW3-CALB的熒光顯微c.對照菌GS115的普通光學顯微d.對照菌GS115的熒光顯微圖。圖5 菌體酶活曲線圖。其中，+表示重組菌GSll5/GCW3-CALB的菌體酶活曲線； ■ "表示對照菌GSl 15的菌體酶活曲線。圖6 采用Gcw3、Pirl和Pir2作為錨定蛋白展示CALB的酶活比較。術語解釋
MD平板13. 4g/L酵母氮源，4X 10_4 g/L生物素，20g/L葡萄糖和20g/L瓊脂 BMGY培養基20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，100 mM磷酸鉀緩沖液(pH6. 0)，13. 4g/ L酵母氮源，4X10_4 g/L生物素，10g/L甘油。BMMY培養基20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，100 mM磷酸鉀緩沖液(pH6. 0)， 13.4g/L酵母氮源，4X10_4 g/L生物素，5g/L甲醇。三丁酸甘油酯乳化平板13. 4g/L酵母氮源，10g/L三丁酸甘油酯，5g/L聚乙烯醇，20g/L瓊脂，IOOmM磷酸鹽緩沖液(pH6. 0)。
具體實施例方式實施例1 巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW3基因的克隆、表達和鑒定 (1)巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW3基因的克隆
根據巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW3的基因序列SEQ NO. 4以及巴斯德畢赤酵母質粒 PPIC9K上的多克隆位點特征，設計合成引物
其中引物Pl方框部分為^boTP I酶切位點，下劃線部分為I酶切位點，斜體部分為 FLAG標簽序列；引物Ρ2下劃線部分為Λ^ I酶切位點。以巴斯德畢赤酵母GS115基因組 DNA為模板，以Pl和P2為引物，通過PCR方法擴增出壁蛋白GCW3基因序列，擴增條件為 預變性94°C 5分鐘；再進行30個以下循環94°C變性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸1分鐘；最后72°C延伸7分鐘。
(2)載體 p9KGCW3-FLAG 的構建
將壁蛋白GCW3基因的PCR產物用EcoR I和Λ^ I雙酶切，酶切的產物與巴斯德畢赤酵母表達質粒PPIC9K的^bo/ I和Λ^ I雙酶切產物連接，得到重組巴斯德畢赤酵母表面展示表達質粒P9KGCW3。將得到的P9KGCW3質粒轉化大腸桿菌宿主ToplOF。用含50mg/L氨芐青霉素的LB平板篩選轉化子，挑取氨芐青霉素抗性陽性的轉化子，提取質粒，通 I和Λ^ I雙酶切鑒定并測序，結果表明壁蛋白GCW3基因序列正確插入，且FLAG標簽在所述壁蛋白GCW3基因的上游。
(3)巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW3的表達和鑒定
采用限制性內切酶I對P9KGCW3質粒進行線性化后，用LiCl法轉化巴斯德畢赤酵母GS115，在MD平板上挑取His+轉化子，提取基因組DNA作為模板，以PI、P2為引物，進行
5PCR擴增，結果證明巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW3的基因序列整合到了 GS115的基因組中，得到的重組菌命名為GSl 15/ GCW3<^fGS115/ GCW3接種于50mL BMGY培養基中，30°C，200rpm 振蕩培養16_20h至OD6tltl到2-6。離心收集菌體，再將其懸浮于BMMY培養基中，稀釋至0D_ 為1，繼續振蕩培養，每隔24h向BMMY培養基中補加1%的甲醇進行誘導表達。發酵后， 10000 rpm離心收集菌體，采用β _1，3-葡聚糖酶法提取細胞壁蛋白，進行SDS-PAGE電泳， 并用anti-FLAG抗體進行Wfestern blot驗證(圖1)，結果表明巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW3 成功地在巴斯德畢赤酵母細胞表面得到表達。用anti-FLAG抗體進行免疫反應后，采用流式細胞儀對重組菌GSl 15/ GCW3和GSl 15進行分析比較(圖2)，結果顯示與GSl 15相比，重組菌GS115/ GCW3的熒光發生較大偏移，表明在重組菌GS115/ GCW3的細胞表面成功地表達了巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW3-FLAG的融合蛋白。 實施例2 巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW3表面展示載體p9KGCW3的構建 (1)巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW3基因的克隆
根據巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW3基因序列以及巴斯德畢赤酵母質粒pPIC9K上的多克隆位點特征，設計合成引物
引物P2下劃線部分為I酶切位點；引物P3方框部分為^boTP I酶切位點，下劃線部分為i/Ζ I酶切位點。以巴斯德畢赤酵母GS115基因組DNA為模板，以P2和引物，通過PCR方法擴增出壁蛋白GCW3基因序列，擴增條件為預變性94°C5分鐘；再進行 30個以下循環94°C變性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸1分鐘；最后72°C延伸7分鐘。 得到巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW3基因片段。
(2)表面展示表達載體p9KGCW3的構建
將壁蛋白GCW3基因的PCR產物用EcoR I和Λ^ I雙酶切，酶切的產物與巴斯德畢赤酵母表達質粒PPIC9K的^bo/ I和Λ^ I雙酶切產物連接，得到重組巴斯德畢赤酵母表面展示表達質粒P9KGCW3。將得到的P9KGCW3質粒轉化大腸桿菌宿主ToplOF。用50mg/L氨芐青霉素的LB平板篩選轉化子，挑取氨芐青霉素抗性陽性的轉化子，提取質粒，通 I和I雙酶切鑒定并測序，結果表明壁蛋白GCW3基因序列正確插入。
實施例3 巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW3表面展示載體ρΖ α AGCW3的構建 (1)巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW3基因的克隆
根據巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW3基因序列以及巴斯德畢赤酵母質粒pPIC9K上的多克隆位點特征，設計合成引物
權利要求
1.一種巴斯德畢赤酵母壁蛋白Gcw3，其特征在于，該蛋白的氨基酸序列如SEQ N0:1所
2.編碼權利要求1所述巴斯德畢赤酵母壁蛋白GCW3的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ NO :4所示。
3.—種巴斯德畢赤酵母細胞表面展示系統，其特征在于，是以權利要求1所述的巴斯德畢赤酵母壁蛋白Gcw3為錨定蛋白，將靶蛋白固定在巴斯德畢赤酵母細胞表面構成的。
4.權利要求3所述的巴斯德畢赤酵母表面展示系統的構建方法，該方法由以下步驟組成(1)將權利要求2所述的基因克隆到表達載體的表達盒中，得到以權利要求1所述巴斯德畢赤酵母壁蛋白為錨定蛋白的表面展示表達載體；(2)將靶蛋白的基因序列克隆到所述表面展示表達載體的巴斯德畢赤酵母壁蛋白基因序列的上游，與所述巴斯德畢赤酵母壁蛋白基因形成融合基因；(3)轉化巴斯德畢赤酵母，根據所述表達載體上的篩選標記篩選陽性轉化子，即得到表面展示系統。
5.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，所述表達載體包括帶有分泌信號肽序列的巴斯德畢赤酵母表達載體。
6.根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于，所述表達載體為pPIC9K、pPICZα A、 pPICZ α B、pPICZ α C、pGAPZ α A、pGAPZ α B 或 pGAPZ α C。
7.根據權利要求4 6之一所述的構建方法，其特征在于，所述靶蛋白為堿性木聚糖酶、米黑根毛霉脂肪酶或南極假絲酵母脂肪酶B。
8.根據權利要求4 6之一所述的構建方法，其特征在于，所述巴斯德畢赤酵母為巴斯德畢赤酵母GSl 15。
全文摘要
本發明公開了一種畢赤酵母壁蛋白及其構建的表面展示系統和構建方法。所述巴斯德畢赤酵母壁蛋白的氨基酸序列為SEQNO1；所述巴斯德畢赤酵母細胞表面展示系統是以所述的巴斯德畢赤酵母壁蛋白Gcw3為錨定蛋白，將靶蛋白固定在巴斯德畢赤酵母細胞表面構成的。本發明的壁蛋白Gcw3在畢赤酵母中表達量十分高，與現已用于巴斯德畢赤酵母表面展示系統的內源錨定蛋白Pir1蛋白和Pir2蛋白相比，分別高6倍和14倍。
文檔編號C12N1/19GK102260335SQ201110216679
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月29日 優先權日2011年7月29日
發明者葉燕銳, 周新瑩, 張莉, 林影, 鄭穗平, 韓雙艷 申請人:華南理工大學