專利名稱：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)液。
背景技術(shù)：
單個(gè)核細(xì)胞是多種細(xì)胞的混合群體，使用Sigma基礎(chǔ)培養(yǎng)液與生長(zhǎng)因子組合配制的Sigma培養(yǎng)液能較好擴(kuò)增MNC細(xì)胞，但Sigma培養(yǎng)液的成分不明確，價(jià)格昂貴，不利于廣泛應(yīng)用的推廣

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題(培養(yǎng)液成分不明確，成本昂貴)，本發(fā)明提供一種單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)液，成分明確，可用于單個(gè)核細(xì)胞的快速擴(kuò)增，節(jié)約了生產(chǎn)成本。一種單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)液，包括IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)液、重組人胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、β-巰基乙醇、重組人血小板生成素、重組人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、rhFlt-3 ligand、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素3和重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子。采用上述技術(shù)方案的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)液，無需添加動(dòng)物血清即可實(shí)現(xiàn)單個(gè)核細(xì)胞的快速擴(kuò)增，具有成分明確的優(yōu)點(diǎn)。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述重組人胰島素的終濃度為10 yg/mL。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白的終濃度為20 yg/mL。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述β-巰基乙醇的終濃度為100 ymol/L。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述重組人血小板生成素的終濃度為5 10 ng/mL ；所述重組人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子的終濃度為5 10 ng/mL ；所述rhFlt-3的終濃度為5 10 ng/mL ； 所述白細(xì)胞介素6的終濃度為5 10 ng/mL ；所述白細(xì)胞介素3的終濃度為5 10 ng/mL ；所述重組人粒細(xì)胞_巨噬細(xì)胞集落刺激因子的終濃度為5 10 ng/mL。采用上述技術(shù)方案的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)液，生長(zhǎng)因子濃度較低，能較好地維持單個(gè)核細(xì)胞的群體特性，也節(jié)約了材料和成本。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)液成分明確，無需添加動(dòng)物血清即可快速擴(kuò)增單個(gè)核細(xì)胞，避免了動(dòng)物血清帶來的潛在風(fēng)險(xiǎn)；生長(zhǎng)因子的使用量少，能較好地維持單個(gè)核細(xì)胞的群體特性，節(jié)約了材料和成本。


圖1本發(fā)明實(shí)施例二中不同培養(yǎng)液培養(yǎng)單個(gè)核細(xì)胞的擴(kuò)增曲線。圖2本發(fā)明實(shí)施例二中auto6-10培養(yǎng)不同來源單個(gè)核細(xì)胞的結(jié)果示意圖。圖3本發(fā)明實(shí)施例三中各種細(xì)胞集落形態(tài)特征圖；圖3-a:CFU-E;圖3-b: BFU-E ；圖 3-c =CFU-G ； 3-d :CFU_M ；圖 3_e =CFU-GM ；圖 3-f CFU-GEMM 圖4本發(fā)明實(shí)施例三中各種細(xì)胞集落統(tǒng)計(jì)圖。圖5本發(fā)明實(shí)施例四中單個(gè)核細(xì)胞表面抗原流式分析的結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例一單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)液的配制。 本發(fā)明提供的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)液包括基礎(chǔ)培養(yǎng)液、細(xì)胞生長(zhǎng)輔助成分和生長(zhǎng)因子，具體為=IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)液+ 10 yg/mL重組人胰島素+ 20 yg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白+ 100 μ mol/L β-巰基乙醇+ 5^10 ng/mL重組人血小板生成素+ 5^10 ng/mL重組人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子+ 5 10 ng/mL rhFlt-3 ligand + 5 10 ng/mL白細(xì)胞介素6 + 5 10 ng/mL白細(xì)胞介素3 + 5^10 ng/mL重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子。為便于細(xì)胞培養(yǎng)效果的比較，配制多種不同的培養(yǎng)液如下
Auto6-10 :IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)液+ 10 μ g/mL重組人胰島素+ 20 μ g/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白+ 100 μ mol/L β-巰基乙醇+ 10 ng/mL重組人血小板生成素+ 10 ng/mL重組人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子 + 10 ng/mL rhFlt-3 ligand + 10 ng/mL 白細(xì)胞介素 6 + 10 ng/mL 白細(xì)胞介素 3 + 10 ng/mL重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；
Auto6-5 :IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)液+ 10 μ g/mL重組人胰島素+ 20 μ g/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白+ 100 μ mol/L β-巰基乙醇+ 5 ng/mL重組人血小板生成素+ 5 ng/mL重組人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子 + 5 ng/mL rhFlt-3 ligand + 5 ng/mL 白細(xì)胞介素 6 + 5 ng/mL 白細(xì)胞介素 3 + 5 ng/mL 重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；
Promo6_10 :promocell基礎(chǔ)培養(yǎng)液+ 10 μ g/mL重組人胰島素+ 20 μ g/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白+ 100 μ mol/L β-巰基乙醇+ 10 ng/mL重組人血小板生成素+ 10 ng/mL重組人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子+ 10 ng/mL rhFlt-3 ligand + 10 ng/mL白細(xì)胞介素6 + 10 ng/mL白細(xì)胞介素3 + 10 ng/mL重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；
Promo6-5 :promocell基礎(chǔ)培養(yǎng)液+ 10 μ g/mL重組人胰島素+ 20 μ g/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白 + 100 μ mol/L β-巰基乙醇+ 5 ng/mL重組人血小板生成素+ 5 ng/mL重組人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子+ 5 ng/mL rhFlt-3 ligand + 5 ng/mL白細(xì)胞介素6 + 5 ng/mL白細(xì)胞介素3 + 5 ng/mL重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；
Sigma6-10 :sigma基礎(chǔ)培養(yǎng)液+ 10 μ g/mL重組人胰島素+ 20 μ g/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白+ 100 μ mol/L β-巰基乙醇+ 10 ng/mL重組人血小板生成素+ 10 ng/mL重組人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子+ 10 ng/mL rhFlt-3 ligand + 10 ng/mL白細(xì)胞介素6 + 10 ng/mL白細(xì)胞介素3 + 10 ng/mL重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子；
Sigma6-5 sigma基礎(chǔ)培養(yǎng)液+ 10 μ g/mL重組人胰島素+ 20 μ g/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白+ 100 μ mol/L β-巰基乙醇+ 5 ng/mL重組人血小板生成素+ 5 ng/mL重組人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子 + 5 ng/mL rhFlt-3 ligand + 5 ng/mL 白細(xì)胞介素 6 + 5 ng/mL 白細(xì)胞介素 3 + 5 ng/mL重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子。上述6種生長(zhǎng)因子儲(chǔ)液的配制以體積比為1:1的PBS和100%甘油進(jìn)行各生長(zhǎng)因子的溶解，分別配成濃度為20 mg/mL的儲(chǔ)液，_20°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｖ亟M人胰島素儲(chǔ)液的配制以體積比為1:1的PBS和100%甘油進(jìn)行重組人胰島素的溶解，配成濃度為10 mg/mL的儲(chǔ)液，_20°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＾D(zhuǎn)鐵蛋白儲(chǔ)液的配制以體積比為1:1的PBS和100%甘油進(jìn)行重組人胰島素的溶解，配成濃度為20 mg/mL的儲(chǔ)液，_20°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩MDM基礎(chǔ)培養(yǎng)液購自Invitrogen公司，貨號(hào)為31980-030 ；重組人胰島素購自 Roche Diagnostics Gmbh 公司，貨號(hào)為 11376497001 ；轉(zhuǎn)鐵蛋白購自 R&D systems 公司，貨號(hào)為2914-HT-100mg ； β -巰基乙醇購自Invitrogen公司，貨號(hào)為21985023 ；重組人血小板生成素購自R&D systems公司，貨號(hào)為288-TP-025/CF ；重組人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子購自R&D systems 公司，貨號(hào)為 255-SC-010/CF ;rhFlt-3 Iigand 購自 R&D systems 公司，貨號(hào)為 308-FK-025/CF ；白細(xì)胞介素6購自R&D systems公司，貨號(hào)為206-IL-010/CF ；白細(xì)胞介素 3購自R&D systems公司，貨號(hào)為203-IL-010/CF ；重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子購自 R&D systems 公司，貨號(hào)為 215-GM-010/CF。實(shí)施例二單個(gè)核細(xì)胞的分離與培養(yǎng)。采用如下步驟進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
1.Ficoll 分離
主要參考Miltenyi Biotech manual進(jìn)行分離。臍帶血用生理鹽水1 :1體積比稀釋， 取稀釋后的臍帶血30 35 mL，緩慢加入至15 mL Ficoll層面上，400 g離心35 min ；去上層血清層后，吸取中間白膜層，加3倍體積的生理鹽水，洗滌兩次，300 g離心8 min;棄上清，重懸在40ml生理鹽水，200g，離心8min，棄上清(上清含血小板)；
2.紅細(xì)胞裂解
往上述棄上清的細(xì)胞中加入1 mL生理鹽水重懸，pipettor分散細(xì)胞沉淀，精確加入 5 mL紅細(xì)胞裂解液(購自深圳新拓?fù)渖锟萍加邢薰?，輕輕搖勻(不可吹打)，精確裂解 3 3. 5 min后，立即加生理鹽水至50 mL總體積，以中和裂解液。200 g離心10 min，小心傾斜離心管，棄上清，此時(shí)可見紅細(xì)胞沉淀之下是白色細(xì)胞層(即我們分離目的單個(gè)核細(xì)胞)， 用1 mL pipettor小心吸取并棄去紅細(xì)胞層；
3.細(xì)胞培養(yǎng)
往上述白色細(xì)胞層加入廣5 mL相應(yīng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，用Invitrogen Countess 計(jì)數(shù)，細(xì)胞數(shù)目總數(shù)N。同一來源的單個(gè)核細(xì)胞分別使用所述實(shí)施例1中相應(yīng)的培養(yǎng)液作為培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞種植密度為2. 5 X 10~6個(gè)/mL，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。備注種植體積V(mL) =細(xì)胞總數(shù)(N) /細(xì)胞種植密度(2. 5X10"6個(gè)/mL)，根據(jù)種植體積選擇合適細(xì)胞培養(yǎng)皿；細(xì)胞收獲數(shù)目(Nlfes) =細(xì)胞收獲密度(個(gè)/mL) X收獲體積V (mL)。培養(yǎng)第3天，計(jì)數(shù)(一般細(xì)胞數(shù)目下降25%左右，如果細(xì)胞數(shù)目下降50%以上，則是由于裂解過度，放棄培養(yǎng))。200 g離心8 min，棄上清，使用相應(yīng)的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，起始種植密度1.5X10~6個(gè)/ml。培養(yǎng)第6天，計(jì)數(shù)(一般肉眼可見培養(yǎng)液略微渾濁，顏色偏紅。如果細(xì)胞培養(yǎng)液顏色不變，計(jì)數(shù)也證明細(xì)胞數(shù)目略比第3天的數(shù)目增加，則放棄培養(yǎng))。200 g離心8 min，留取離心后上清，使用相應(yīng)的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，進(jìn)行半量換液培養(yǎng)，種植密度1. 5 X 10~6個(gè)/ mL。此時(shí)培養(yǎng)液組成50%全新培養(yǎng)液+ 50%培養(yǎng)過的離心后上清。培養(yǎng)第9天，計(jì)數(shù)(肉眼可見培養(yǎng)液明顯渾濁，顏色偏紅黃。如果細(xì)胞培養(yǎng)液顏色不變，說明細(xì)胞無擴(kuò)增，無需計(jì)數(shù)即放棄培養(yǎng))。200 g離心8 min，留取離心后上清，使用相應(yīng)的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，進(jìn)行半量換液培養(yǎng)，種植密度1.5X 10~6個(gè)/ml。此時(shí)培養(yǎng)液組成50%全新培養(yǎng)液+ 50%培養(yǎng)過的離心后的上清。注解細(xì)胞數(shù)目從Day6至day9，經(jīng)過3天的培養(yǎng)，若細(xì)胞密度達(dá)3、X 10~6個(gè)/ ml，此時(shí)應(yīng)考慮略微降低接種密度，可以調(diào)整為1.3X10~6f/ml。培養(yǎng)第12天，計(jì)數(shù)(肉眼可見培養(yǎng)液明顯渾濁，顏色偏紅黃。如果細(xì)胞培養(yǎng)液顏色不變，無需計(jì)數(shù)即放棄培養(yǎng))。200 g離心8 min0培養(yǎng)細(xì)胞3天后收獲，細(xì)胞密度可以到 3、X 10~6個(gè)/ml。我們認(rèn)為，如果細(xì)胞密度超過3X 10~6個(gè)/ml，則細(xì)胞起始種植密度太高，并非最優(yōu)培養(yǎng)條件。
權(quán)利要求
1.一種單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)液，其特征在于包括IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)液、重組人胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、β-巰基乙醇、重組人血小板生成素、重組人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、rhFlt-3 ligand、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素3和重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)液，其特征在于所述重組人胰島素的終濃度為 10 μ g/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)液，其特征在于所述轉(zhuǎn)鐵蛋白的終濃度為20μ g/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)液，其特征在于所述巰基乙醇的終濃度為 100 ymol/Lo
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)液，其特征在于所述重組人血小板生成素的終濃度為5 10 ng/mL;所述重組人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子的終濃度為5 10 ng/mL ；所述 rhFlt-3的終濃度為曠10 ng/mL ；所述白細(xì)胞介素6的終濃度為5 10 ng/mL ；所述白細(xì)胞介素3的終濃度為5 10 ng/mL ；所述重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的終濃度為5 10 ng/mLο
全文摘要
本發(fā)明提供一種單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)液，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，包括IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)液、重組人胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、β-巰基乙醇、重組人血小板生成素、重組人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、rhFlt-3ligand、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素3和重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子。本發(fā)明提供的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)液成分明確，可實(shí)現(xiàn)單個(gè)核細(xì)胞的快速擴(kuò)增，較好地維持單個(gè)核細(xì)胞的群體特性，同時(shí)節(jié)約了材料和成本。本發(fā)明主要應(yīng)用于單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)。
文檔編號(hào)C12N5/078GK102286426SQ20111022111
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月3日
發(fā)明者姜舒, 朱姣蓮, 李陶, 汪照靜, 胡祥, 黃昕華 申請(qǐng)人:深圳市北科生物科技有限公司