專利名稱：用細胞系生產兔瘟疫苗的方法及其制品的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用細胞系生產兔瘟疫苗的方法及其制品，屬于獸用疫苗領域。
背景技術：
兔病毒性出血癥(rabbit heamorrhagic disease, RHD)是1984年由我國首次發現并報道的新病毒病。由于其發病急、傳播快、發病率和死亡率都相當高，所以又俗稱“兔瘟”，是兔的一種以全身性出血和多發性血管內凝血為主要癥狀的急性、烈性、病毒性傳染病。目前，國內各省(市)均有流行。意大利、德國、法國、前捷克斯洛伐克、前蘇聯、西班牙、墨西哥、朝鮮和日本等國家也有發生。給全世界養兔業造成了巨大的經濟損失，國際獸醫局將該病列為B類傳染病，我國農業部96號令頒布為二類疫病。RHD出現比較突然且流行速 度極快，現有研究結果表明世界范圍內的所有RHDV分離株均為同一血清型，無論是遺傳特性還是抗原性都很穩定。目前用兔病毒性出血癥組織滅活疫苗免疫是預防該病的主要措施，疫苗的制備過程中必須以RHDV感染致死的兔內臟組織為原料。如中國專利CN88108859. 5公開了一種用病兔肝組織培養RHD病毒及生產兔瘟疫苗的方法，但該方法疫苗的制備過程中必須以RHDV感染致死的兔內臟組織為原料，而用于制備組織滅活疫苗的非免疫兔的供應量卻很不穩定，造成傳統的組織滅活疫苗的成本不斷增加，另外組織滅活疫苗存在散播強毒的潛在危險、批間差異大、產量不高等種種缺點。近年來，隨著兔產品等行業的興起以及其他動物疫苗等對家兔的需求的增加，市場對兔病毒性出血癥疫苗的需求量增加了許多，但是用于制備組織滅活疫苗的非免疫兔的供應量卻很不穩定，造成傳統的組織滅活疫苗的成本不斷增加，加之組織滅活疫苗存在散播強毒的潛在危險、批間差異大、產量不高等種種缺點，組織滅活疫苗的廣泛應用受到一定的限制。

發明內容
有鑒于此，本發明的目的在于克服現有技術存在的不足之處，提供一種用細胞系生產兔瘟疫苗的方法，特別是使用常見易培養的細胞系如RK13、ST、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等細胞系生產RHD病毒及疫苗的方法。該方法使用培養病毒的細胞系是成熟的商業化的細胞系，具有生產工藝簡單穩定、易操作，病毒含量高，批間差異小，質量易控，可顯著提高疫苗產量和質量。利用本發明生產的兔瘟疫苗安全性好、免疫力高，對兔瘟強毒攻擊具有完全的免疫保護作用。本發明的主要目的在于提供一種用細胞系生產兔瘟病毒的方法，包括以下步驟I)細胞的培養將細胞系經消化傳代，以細胞培養液進行培養，形成生長良好的細胞單層；2)病毒接種與吸附將兔瘟病毒接種于上述生長良好的細胞單層，進行病毒吸附；
3)細胞的孵育換用細胞維持液培養后，加入孵育劑進行細胞的孵育；4)病毒的繁殖將上述孵育劑洗去，重新加入細胞維持液培養細胞系以繁殖兔瘟
病毒;5)病毒的收獲收獲含有兔瘟病毒的培養液。優選地，本發明步驟2)中用于接種的兔瘟病毒為使用細胞系生產的兔瘟病毒。優選地，本發明所述的細胞為RK13細胞、ST細胞、VeroE6細胞、BHK-21細胞、PK-15細胞、IBRS-2細胞的任意一種或幾種。優選地，本發明所述的細胞系為RK13細胞。
優選地，本發明所述的孵育劑為D-氨基葡萄糖、干擾素或脂多糖。優選地，本發明所述的孵育時間為20-40分鐘；更優選地，孵育時間為30分鐘。優選地，本發明所述的細胞生長液為含血清的培養液，其中血清含量為1% -7%v/v ;更優選地，所述細胞生長液的血清含量為5% _6%，最優地，血清含量為6%。優選地，本發明所述的細胞維持液為無血清的培養液。本發明的另一主要目的在于提供如上述的方法制備的兔瘟病毒，其中，使用細胞系生產兔瘟病毒。本發明的另一主要目的在于提供一種用細胞系生產兔瘟疫苗的方法使用上述方法生產的兔瘟病毒，加入滅活劑，滅活后加入獸藥學上可接受的疫苗佐劑制備為兔瘟疫苗。本發明的另一主要目的還在于提供一種用細胞系生產的兔瘟疫苗，其中，使用了細胞系用于生產兔瘟疫苗。由上可以看出，發明人意外地發現在兔瘟病毒繁殖時對細胞系進行細胞孵育可以幫助兔瘟病毒適應細胞系，特別是通過在生產用毒種和制苗用病毒中均使用孵育劑進行孵育，使得用細胞系繁殖兔瘟病毒成為了可能，從而實現了用細胞系生產兔瘟疫苗。而在現有技術中，國內外無論使用RK13、ST、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等何種細胞系，或者使用同步培養、帶毒傳代、兔血清培養等方法，都沒有實現兔瘟病毒在細胞系中獲得有效的增殖,并達到利用細胞系生產兔瘟疫苗的目的。其次，發明人還發現在細胞的培養中使用低血清的細胞培養液，而在細胞的孵育和病毒的增殖中換用無血清的細胞維持液，可以幫助兔瘟病毒適應細胞系，促進病毒在細胞系的增殖，而在細胞生長階段又不影響良好細胞單層的形成。基于以上發現，本發明獲得了一種使用細胞系生產的兔瘟病毒及兔瘟疫苗，本發明的兔瘟疫苗至少有以下優點I)用細胞系替代兔體組織制備兔瘟疫苗，可解決外源病原污染的問題，通過原材料和培養條件的嚴格控制，保證生產出來的疫苗純粹，確保疫苗的安全性；2)采用本發明的兔瘟病毒及兔瘟疫苗的生產方法，病毒的培養原料是較為廉價的細胞系，使用也比兔體組織更加方便；3)采用本發明培養的兔瘟細胞毒液病毒含量高，用高滴度的抗原制造的兔瘟疫苗可以大大提高疫苗的免疫力，經免疫攻毒試驗結果顯示，對兔瘟強毒攻擊可100%保護；4)用細胞系生產兔瘟疫苗各批間質量差異小，具有生產工藝穩定、易操作、產量大、成本低等特點，具備工業化大生產的可行性和可放大性，具有很好的經濟效益和應用前旦
O5)用細胞系代替兔體組織制備兔瘟疫苗，可解決組織苗在注射過程中易引起兔體精神不振、減食、注射部位過敏紅腫等不良反應。
具體實施例方式本發明實施例中使用了常見的商業化的容易培養的細胞系如RK13、ST、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等細胞系生產RHD病毒及疫苗，其他的哺乳動物細胞，也可以應用本發明的方法生產RHD病毒及疫苗。本發明實施例中接種用的兔瘟病毒優選使用細胞系生產獲得的兔瘟病毒；但是使 用細胞系生產的接種用的兔瘟病毒的目的僅為了提高接種用的兔瘟病毒的效價和使得接種用的兔瘟病毒更適應在細胞中生長，獲得疫苗的效力更佳。因此，本發明的接種用兔瘟病毒并不限于使用經細胞系培養的兔瘟病毒，其他來源的兔瘟病毒如組織來源的兔瘟病毒液也可以用于接種細胞系生產兔瘟病毒及疫苗。本發明的細胞培養液中血清為胎牛血清，其他的動物性血清如兔血清、羊血清等均可以作為細胞生長液，只要其血清含量比常規使用情況下的血清含量低，使得兔瘟病毒更容易適應在細胞中的生長，而又不影響細胞本身形成良好單層細胞即可。本發明的疫苗為滅活疫苗，也可以使兔瘟病毒進行弱化后，使用弱化病毒制備活疫苗，或使用基因工程方法獲得轉基因病毒，使用本發明的在動物細胞中培養方法制備滅活疫苗或活疫苗。為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規實驗方法進行。實施例1RK13細胞生產兔瘟病毒與兔瘟疫苗I. RK13細胞生產兔瘟病毒與兔瘟疫苗的方法本實施例中，選擇兔腎細胞系RK13(購自中國獸醫藥品監察所)作為生產兔瘟病毒與兔瘟疫苗的細胞系，兔瘟病毒AV33毒種購自中國獸醫藥品監察所，以下為生產兔瘟病毒與疫苗的具體步驟I)生產用兔瘟病毒種的制備使用上述細胞生長液培養RK13細胞至形成良好的細胞單層，接種兔痕病毒并進行病毒吸附后，換用細胞維持液培養，加入孵育劑進行細胞的孵育，將上述孵育劑洗去，重新加入細胞維持液培養細胞，收獲病毒液，即獲得生產用兔瘟病毒種子，具體步驟為將兔腎RK13細胞系經EDTA-胰酶細胞分散液消化傳代，以細胞生長液(94% v/vDMEM(Invitrogen公司生產)液，6% v/v胎牛血清(PAA公司生產)，pH值調整為7. 2)于37°C繼續培養，形成良好單層時，用于繼續傳代或接種病毒；其次，將兔瘟病毒AV33毒種(購自中國獸醫藥品監察所)用PH7. 2磷酸鹽緩沖液10倍稀釋，接種體重I. 5Kg以上的家兔，每只皮下注射1ml。無菌采集接種后24-72小時瀕死或剛死亡的家兔且有典型病理變化的肝組織作為病料，加入PH7. 2磷酸鹽緩沖液研磨制成10% v/v混懸液，再經3000rpm離心10分鐘，取上清液作除菌過濾，作10倍稀釋(稀釋后的血凝效價為101og2)，接種生長良好的RK13單層細胞培養中，37°C吸附1-2小時，然后加入細胞維持液(100% v/vDMEM(Invitrogen公司生產)液，不添加血清，pH值調整為7· 2)在37°C中培養。6個小時后加入D-氨基葡萄糖孵育半小時，后用pH7. 2磷酸鹽緩沖液沖洗三遍，繼續加入細胞維持液培養。逐日觀察記錄，接毒后48-72小時(或細胞單層出現較多圓縮細胞時)收毒，凍融3次后離心于_15°C保存,作為生產用毒種。生產用兔瘟病毒毒種鑒定血凝價為對人“O”型紅細胞凝集價> 81og2。對兔最小致死量毒種10_4稀釋，接種體重1.55kg以上的家兔4只，每只lml，4只全部死于兔瘟癥狀，具有明顯的病理變化，主要為呼吸系統和肝、脾、腎、心等實質臟器淤血、腫大和出血。 2)制苗用兔瘟病毒的制備使用細胞生長液培養細胞至形成良好的細胞單層，接種上述生產用兔瘟病毒毒種并進行病毒吸附后，換用細胞維持液培養，加入孵育劑進行細胞的孵育，將上述孵育劑洗去，重新加入細胞維持液培養細胞，收獲病毒液，即獲得制苗用兔痕病毒，具體步驟為將上述細胞生長液培養獲得的生長良好的RK13細胞單層，加入含3% v/v上述步驟獲得的生產用毒種的細胞維持液，置37°C吸附1-2小時；吸附病毒后,在RK13細胞系加入細胞維持液，在37°C中培養。6個小時后棄去細胞維持液，加入D-氨基葡萄糖孵育半小時。用pH7. 2磷酸鹽緩沖液沖洗三遍，將上述孵育劑洗去，重新加入細胞維持液培養細胞系，并逐日觀察。接毒后48-72小時(或細胞單層出現較多圓縮細胞時)，即可收獲含有兔瘟病毒的培養液。凍融3次后離心即可得到兔瘟病毒液。制苗用兔瘟病毒液的檢驗按《中華人民共和國藥典》(2005年版)附錄進行檢驗，無細菌、霉菌、支原體生長。病毒液經測定對人“O”型紅細胞凝集價> 81og2 ;將得到的兔瘟病毒液置于_15°C進行保存。3)疫苗的制備在上述收獲的含有兔瘟病毒的培養液加入滅活劑，滅活后加入獸藥學上可接受的疫苗佐劑制備為成品兔瘟疫苗，具體步驟如下將檢驗合格的兔瘟病毒液與經過121°C滅菌30min后冷卻至室溫的法國賽比克公司的疫苗佐劑ISA206，按I : I的體積比混合，在500 800rpm的轉速下攪拌lOmin，在終止攪拌前加入1% (W/V)硫柳汞溶液，使其終濃度為萬分之一，充分振蕩混勻，分裝后2 8°C保存即可完成兔瘟滅活疫苗的制備。2.對兔瘟疫苗的檢驗I)物理性狀檢驗a)外觀為乳白色或淡紅色均勻乳劑。b)劑型為雙向型，即水包油包水(W/0/W)。取清潔吸管，吸取少量疫苗滴于清潔冷水中，除第I滴外，均呈油滴狀不擴散。c)穩定性取疫苗IOml加入離心管中，經3，OOOrpm離心15min,不分層,管底析出水相< O. 5ml ;取疫苗在37°C左右放置21d，結果顯示不分層，沒有破乳現象。d)黏度用Iml清潔吸管(下口徑I. 2mm，上口徑2. 7mm)吸取25°C左右的疫苗Iml令其垂直自然流出，記錄流出O. 4ml所需時間，結果顯示,3次流出時間均在8s內。2)無菌檢驗按《中國獸藥典》附錄進行，無菌生長。3)支原體檢驗按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，無支原體生長。4)甲醛及硫柳汞含量測定按《中國獸藥典》附錄進行，甲醛及硫柳汞含量不超過規定的含量。因此，本實施例獲得兔瘟疫苗經過檢驗均符合國家獸藥相關標準。3.兔瘟疫苗的安全性與效力檢驗I)安全性試驗將上述方法制備的3批疫苗(批號分別為1101、1102和1103)進行安全性試驗。試驗內容包括對體重I. 5-3. OKg的健康易感家兔20只分別進行I次單劑量接種、超劑量接種、單劑量重復接種的安全性試驗。試驗結果表明3批疫苗接種動物后，均未出現紅腫、瘙瘁、破潰等局部反應，采食和精神狀態正常，無全身反應。將部分免疫動物7天撲殺，取注射部分組織制備成切片，觀察組織病變。結果顯示，3批疫苗免疫動物后，對注射部位無損傷，表明疫苗安全性好。
2)效力試驗將試制的3批疫苗(批號分別為1101、1102和1103)分別進行了效力試驗。試驗內容包括對體重I. 5-3. OKg的健康易感家兔6只，每只頸部皮下注射1ml，并作不接種家兔為對照組6只。定期采血測定血凝抑制(HI)效價，于第18天以大劑量強毒攻擊，每只家兔頸部皮下接種血凝價為141og2的肝組織兔瘟病毒1ml。6只易感兔注射滅活疫苗后第7天，血清中HI效價升到51og2-71og2，第15天升高到91og2-121og2。這些兔在攻毒后均不表現任何癥狀，全部獲得保護。而6只對照兔的HI仍為陰性，均于攻毒后48小時左右死亡。因此，本發明的細胞系生產的兔瘟疫苗對兔瘟強毒攻擊可100%保護，可以用于替代目前應用的兔體組織生產的兔瘟疫苗。4.細胞系生產兔瘟疫苗與兔體組織生產兔瘟疫苗的比較I)兔體組織生產兔瘟疫苗的方法將AV33毒種用pH7. 2磷酸鹽緩沖液或生理鹽水10倍稀釋,接種體重I. 5Kg以上的家兔，每只皮下注射1ml。無菌采集接種后24-72小時瀕死或剛死亡的家兔且有典型病理變化的肝、脾作為生產用毒種。經毒種鑒定，毒種對人“O”型紅細胞凝集價> 81og2。毒種對兔最小致死量毒種10_4稀釋，接種體重I. 5kg以上的家兔4只，每只1ml，4只全部死于兔瘟癥狀，具有明顯的病理變化，主要為呼吸系統和肝、脾、腎、心等實質臟器淤血、腫大和出血。取上述生產用種毒，用無菌生理鹽水作10倍稀釋，每只家兔皮下注射2ml。將接種后24-96小時內瀕死或剛死亡的家兔，用無菌手術采取肝、脾、腎、心、肺作為制苗材料，并逐只進行病理檢查，如有異常病變組織，應予以廢棄。采毒后立即用于配苗或迅速凍結保存。在-10°C以下保存，不得超過15日；-20°C以下保存，不得超過50日。在無菌操作下，剔除各臟器的脂肪與結締組織，稱重，加適量的磷酸鹽緩沖液(PH7. 2)或生理鹽水進行切碎或研磨，用5號篩過濾。組織與稀釋液的最終比例為I : 19.在稀釋液中亦可加入與組織等量的甘油，即組織甘油稀釋液=I : I : 18.肺臟單獨制苗，并另作安檢和效檢，合格后組批分裝。按乳劑總量的O. 4%加入甲醛溶液，充分混合后裝入無菌容器中，密封后置37°C滅活48小時，間隔4-6小時振蕩I次。滅活后經檢驗合格定量分裝。獲得了兔瘟組織苗 3 批，批號 1111、1112、1113。2)使用本實施獲得批號為1101、1102和1103的兔瘟疫苗與上述批號1111、1112、1113的兔體組織兔瘟疫苗進行兔體注射不良反應比較用體重I. 5-3Kg家兔分三組，第一組12只，3批疫苗1111、1112、1113，每批注射4只，每只皮下注射疫苗O. 5ml ;第二組12只，3批疫苗1101、1102、1103，每批注射4只，每只皮下注射疫苗O. 5ml ;第三組4只，作為對照。結果如下表顯示第一組在注射后1-3天內，出現不同程度的不良反應，精神不振，減食，注射局部出現紅腫等。第二組均正常，無不良反應。第三組對照正常。
權利要求
1.一種用細胞系生產兔瘟病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)細胞的培養將細胞系經消化傳代，以細胞培養液進行培養，形成生長良好的細胞單層； 2)病毒接種與吸附將兔瘟病毒接種于上述生長良好的細胞單層，進行病毒吸附； 3)細胞的孵育換用細胞維持液培養后，加入孵育劑進行細胞的孵育； 4)病毒的繁殖將上述孵育劑洗去，重新加入細胞維持液培養細胞系以繁殖兔瘟病毒； 5)病毒的收獲收獲含有兔瘟病毒的培養液。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟2)中接種用的兔瘟病毒是使用細胞系生產的兔瘟病毒。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述的細胞為RK13細胞、ST細胞、VeroE6細胞、BHK-21細胞、PK-15細胞、IBRS-2細胞系的任意一種或幾種。
4.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述的細胞為RK13細胞系。
5.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述的孵育劑為D-氨基葡萄糖、干擾素或脂多糖。
6.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述的細胞孵育時間為20-40min。
7.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述的細胞生長液的血清含量為I % -7% v/vo
8.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述的細胞維持液為無血清的細胞培養液。
9.一種根據權利要求1-8任意一項所述的方法制備的兔瘟病毒，其特征在于，使用細胞系生產兔痕病毒。
10.一種用細胞系生產兔瘟疫苗的方法，其特征在于，使用權利要求9所述的兔瘟病毒，加入滅活劑，滅活后加入獸藥學上可接受的疫苗佐劑制備為兔瘟疫苗。
11.一種根據權利要求9所述的兔瘟疫苗，其特征在于，使用細胞系生產兔瘟疫苗。
全文摘要
本發明提供了一種使用常見易培養的細胞系如RK13、ST、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等細胞系生產RHD病毒及疫苗的方法。該方法包括以下步驟接種兔瘟病毒并進行吸附后，加入孵育劑進行細胞的孵育，并用細胞維持液培養細胞，獲得生產用兔瘟病毒種子；接種兔瘟病毒毒種吸附后，加入孵育劑進行細胞的孵育，重新加入細胞維持液培養細胞，獲得制苗用兔瘟病毒；加入滅活劑，滅活后加入獸藥學上可接受的疫苗佐劑制備為成品兔瘟疫苗。該方法使用培養病毒的細胞系是成熟的商業化的細胞系，具有生產工藝簡單穩定、易操作，病毒含量高，批間差異小，質量易控，可顯著提高疫苗產量和質量。利用本發明生產的兔瘟疫苗安全性好、免疫力高，對兔瘟強毒攻擊具有完全的免疫保護作用。
文檔編號C12N7/00GK102952784SQ20111025076
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月26日 優先權日2011年8月26日
發明者張許科, 孫進忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司