專利名稱：一種EPS基因簇EpsA、EpsB、EpsC、EpsD的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種EPS基因簇EpsA、EpsB、EpsC、EpsD和包括該基因簇的嗜熱鏈球菌。
背景技術：
嗜熱鏈球菌是發酵乳生產中必不可少的乳酸菌菌株，其常常與保加利亞乳桿菌配比使用，某些嗜熱鏈球菌在發酵乳制品生產中不僅起到前期的產酸作用，而且還有發揮一個非常重要的生物功能，就是產生胞外多糖，嗜熱鏈球菌產生的胞外多糖具有增加黏度、改善發酵乳質構、流變特性及口感等作用，近年人們通過大量動物實驗證明嗜熱鏈球菌產生的胞外多糖除了上述作用外還擁有一定的益生功能，如降膽固醇、增強粘膜吸附、增加機體免疫力和抗腫瘤等作用。嗜熱鏈球菌產生的胞外多糖均為雜多糖，是由不同的單糖組合而成的，組成雜多糖的單糖包括葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、果糖等。雜多糖是通過聚合在細胞質中形成的前體物質即重復單元的聚合反應而形成的，其生物合成和分泌過程需要一系列的酶和蛋白質，該過程可以分為四個反應階段糖轉運進入細胞質，合成糖-1-磷酸，糖的激活和耦合及多糖轉運出細胞質。決定嗜熱鏈球菌產胞外多糖的基因簇均存在于菌株的染色體上，相關研究表明嗜熱鏈球菌有一個復雜的基因組織負責EPS的生物合成和分泌。例如，通過 Tn916誘變和對比染色的平板分析方法鑒定出S. thermophilus Sf i6位于染色體上的印s 基因簇，是一段長14. 52kb的DNA，編碼Eps A到EpsM十三個基因。EpsE, EpsF, EpsG和 EpsI基因在大腸桿菌中表達和體外用薄層色譜分析mC標記核苷酸的糖基轉移酶反應，鑒定出EpsE、EpsG和EpsI分別是β -半乳糖酶、α -1，3_Ν_乙酸半乳糖胺和β _1，3-葡萄糖轉移酶。通過排除，α-1，6-半乳糖轉移酶應該是EpsF，它是糖基轉移酶基因留下的沒有功能的片段。Eps K基因與多糖輸出有關，EpsI基因與聚合作用有關，EpsA、EpsB基因與決定鏈長有關。總之不同菌株的EPS基因簇的基因組的構成、轉錄的方向和功能表現出高度的保守性。根據同源性調查這類基因簇由四個功能區域組成，一個中心區域帶有表現糖基轉移酶同源性，這些酶是EPS重復單元生物合成的專一酶，兩個在中心區域側翼的區域，表現參與聚合作用和運輸的酶的同源性(鏈長的控制、轉運、聚合)和一個位于基因簇開始端的調節區域。了解和闡明EPS基因簇的功能有助于我們掌握嗜熱鏈球菌生產胞外多糖的基因調控機制，弄清EPS基因簇與嗜熱鏈球菌生產胞外多糖的關系，可為產粘乳酸菌篩選、益生菌株(擁有EPS相關益生功能)篩選以及用于菌株的基因改造提供基礎性的研究材料。

發明內容
本發明人針對上述問題，以傳統發酵乳制品中乳酸菌為目標菌群，采用特定的篩選方法，從甘肅省甘南縣采集的傳統發酵乳制品中篩選出產粘菌株，得到一種產胞外多糖嗜熱鏈球菌(streptococcus thermophilus ,MN-ZLff-002)及其篩選方法，并進一步研究了該產粘菌株中EPS基因簇以及其與胞外多糖產生之間的關系。本發明的目的之一是對產胞外多糖嗜熱鏈球菌CJir^iococc^s thermophilus ) MN-ZLW-002中相關EPS基因進行克隆和測序。本發明的目的之二是通過PCR確定EPS基因簇與胞外多糖產生之間的關系。本發明的目的之三是提供胞外多糖(EPQ基因簇或EPS基因在篩選和改造乳酸菌中的應用。本發明的嗜熱鏈球菌CJire^iococ^As thermophilus) MN-ZLW-OO2 已于 2OlO 年 5 月7日，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址為北京市朝陽區北辰西路1號院，中科院微生物研究所)，保藏號=CGMCC No. 3817。本發明提供了從所述嗜熱鏈球菌、Streptococcus thermophilus) MN-ZLff-002 中分離的EPS基因簇EpsA、EpsB、EpsC、EpsD,并且對該基因進行了克隆和測序。本發明還提供了一種產胞外多糖嗜熱鏈球菌的篩選方法。包括 a.以傳統發酵乳制品為樣品，從中分離鑒定得到30株乳酸球菌；
b.經進一步理化鑒定確定嗜熱鏈球菌菌株，并制得嗜熱鏈球菌菌懸液；
c.吸取所述嗜熱鏈球菌菌懸液，以洲接菌量接種于200mL1 脫脂乳中。置于43°C 條件下進行18小時過夜培養，在4°C條件下打冷5-8小時，打冷后對各樣品進行檢測；
d.用流變儀測定各樣品的流變特性以及黏度大小；利用苯酚硫酸法測定各樣品的胞外多糖產量；
本發明還提供了相關EPS基因的克隆方法，包括
a.查詢GeneBank，找到己公布的相關序列進行EPS基因的引物設計；
b.對上述新鮮嗜熱鏈球菌進行PCR擴增，從而得到目的片段；
c.對目的片段進行瓊脂糖凝膠回收以及基因克隆，并將克隆片段送往基因公司進行測序。本發明的嗜熱鏈球菌{streptococcusthermophilus，MN-ZLff-002)具有較好產粘性能，對其EPS基因簇進行克隆研究后表明EPS基因簇與嗜熱鏈球菌生產胞外多糖具有一定的關系，可用于產粘乳酸菌篩選、益生菌株(擁有EPS相關益生功能)篩選以及用于菌株的基因改造。


附圖 1 為本發明的嗜熱鏈球菌{streptococcus thermophilus，MN-ZLff-002)的全基因組圖。
具體實施例方式下列實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1 嗜熱鏈球菌 CJire^iococ^As thermophilus )MN-ZLW_002 的分離和鑒
定
1、菌株的篩選經無菌離心管采集回來的甘肅省甘南縣傳統發酵乳制品，及時移入超凈工作臺，以無菌槍頭吸取25mL，溶解于225mL的生理鹽水中，振蕩均勻，得到KT1的菌懸液。用移液槍吸取ImL此菌懸液注入9mL的生理鹽水管中，得到稀釋度為10_2，的菌懸液，厭氧條件下逐級稀釋，直到10_6。每個稀釋度分別取lmL，接種到M17瓊脂培養基中，37°C恒溫厭氧培養。培養48h 后取出觀察。待菌落形成后，用接種環或接種針挑取菌落，接種于M17液體中，置于37°C條件下，培養Mh-48h。待菌株生長良好后，再次劃線接種于M17瓊脂培養基中，置于37°C條件下，培養Mh-48h，仔細觀察記錄菌落形態和革蘭氏染色細胞形態特征。將革蘭氏陽性鏈球菌暫定為嗜熱鏈球菌進一步純化培養，并采用冷藏、_85°C凍結保存或
低溫真空冷凍保存。將從傳統發酵乳制品中分離的鏈球菌菌株，經生理生化學試驗、乳酸旋光性測定等一系列試驗分析鑒定，并將鑒定后的菌株分別制成供試菌液。吸取菌懸液，以1接菌量接種于200mL 12%脫脂乳中。置于43°C條件下進行18 小時過夜培養，在4°C條件下打冷5-8小時，打冷后對各樣品進行檢測。用流變儀測定各樣品的流變特性以及黏度大小；利用苯酚硫酸法測定各樣品的胞
外多糖產量。嗜熱鏈球菌的鑒定分離純化的嗜熱鏈球菌、Str印tococcus thermophilus) MN-ZLW-002經生理生化學特性分析和16SrDNA序列分析的方法鑒定，其微生物學特性及 16SrDNA如表1及表2所示。表 1 Str印tococcus thermophilus，MN-ZLW-002 的生物學特性
權利要求
1.一種胞外多糖(EPS)基因簇 EpsA、EpsB、EpsC、EpsD， 其特征在于所述基因簇的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.—種如SEQ ID NO: 1所示核苷酸編碼的多肽，其序列如SEQ ID N0:2所示。
3 EpsA基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。
4.EpsB基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。
5.EpsC基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。
6.EpsD基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。
7.權利要求1的胞外多糖(EPS)基因簇、權利要求3的EpsA基因、權利要求4的EpsB 基因、權利要求5的EpsC基因或權利要求6的EpsD基因在篩選和改造乳酸菌中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種嗜熱鏈球菌及其包含的胞外多糖(EPS)基因簇EpsA、EpsB、EpsC、EpsD。所述菌株是從甘肅省甘南縣采集的傳統發酵乳制品中分離得到的產EPS的嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)MN-ZLW-002，保藏號為CGMCCNo.3817。所述基因簇是從該嗜熱鏈球菌中分離得到的，其分別由EpsA、EpsB、EpsC和EpsD基因組成；并且對上述基因進行了克隆和測序。本發明的EPS基因簇可用于乳酸菌產粘菌株的篩選、益生菌株(擁有EPS相關益生功能)篩選以及用于菌株的基因改造。
文檔編號C12N1/20GK102559705SQ20111026161
公開日2012年7月11日 申請日期2011年9月6日 優先權日2010年10月28日
發明者周琦, 孫國慶, 康小紅, 張蘭威, 生慶海, 齡南 申請人:內蒙古蒙牛乳業(集團)股份有限公司